人工细胞外基质与多种细胞共培养

组织工程支架材料东南大学生物科学与医学工程学院生物电子学国家重点实验室黄宁平nphuang@2011-5-16√组织工程支架材料√生物材料的表面工程支架设计与制备技术组织工程支架材料展望理想的组织工程支架应具备以下功能:1）良好的生物相容性使细胞可黏附和增殖，无明显的细胞毒性、炎症反应和免疫排斥，不会因邻近组织的排异反应而影响新组织的功能；2）可降解性及合适的降解速率，当移植的细胞或组织在受体内存活时，支架材料可自行降解，降解吸收速率能与细胞、组织生长速率相匹配；3）合适的孔尺寸、高的孔隙率和相连通的孔形态，以利于大量细胞的种植、细胞和组织的生长、细胞外基质的形成、氧气和营养的传输、代谢物的排泄以及血管和神经的长入；4）高的表面积、合适的表面理化性质和良好的细胞界面关系，以利于细胞黏附、增殖、分化以及负载生长因子等生物信号分子；5）与植入部位组织的力学性能相匹配的结构强度，以在体内生物力学微环境中保持结构稳定性和完整性，并为植入细胞提高合适的微应力环境；6）便于加工成理想的二维或三维结构，可以获得所需的组织或器官形状，易于重复制作，而且移植到体内后能保持原有形状。组织工程支架材料主要包括：（1）天然可降解高分子材料。如胶原（collagen），其本身就是天然骨的组织成分。壳聚糖（chitosan），是甲壳素的衍生物。还有明胶、琼脂、葡聚糖、透明质酸。降解产物易被机体吸收，但强度和加工性能较差，降解速度无法调节。（2）天然可降解无机材料。例如珊瑚是天然动物的骨骼，其中99％是磷酸钙。再如，珊瑚羟基磷灰石（CHA）。它们都具有天然珊瑚的多孔结构，有较好的孔隙率。能和靶细胞很好的黏附，而不影响增殖、分化、成骨。但加工困难。（3）合成可降解高分子材料。常用的可降解合成高分子材料有聚乳酸[poly（lacticacid）,PLA],聚乙醇酸[poly(glycolicacid),PGA],聚己内酯(polycaprolactam,PCL)等。这类材料的降解产物可在体内代谢排除，对机体无害，可塑性较好。（4）合成可降解无机材料。常用的主要有磷酸钙水泥(calciumphosphatecement,CPC)，羟基磷灰石(hydroxyapatite,HA),磷酸三钙(tricalciumphosphate,TCP),生物活性陶瓷如生物活性玻璃陶瓷(biologicalactivityceramicglass,BCG),细胞外基质陶瓷类材料等。（5）复合材料。常用的有聚乳酸－羟基磷灰石

生物材料表面对细胞的影响：生物材料表面能：表面能较高（较亲水）的表面更有利于细胞的黏附和铺展。生物材料表面的蛋白吸附能力：生理液体中含大量白蛋白和少量ECMs蛋白质（纤连蛋白FN、玻连蛋白VN和层连蛋白LN等）。生物材料表面电荷：在正电荷生物材料表面，细胞的黏附呈现连续性。

生物材料表面的亲水－疏水平衡：疏水性表面对蛋白质的吸附能力较强。生物材料表面的拓扑（图案）结构：细胞根据材料表面的拓扑形貌而取向生长。生物材料表面的生物活性：生物材料表面具有整连蛋白认同的配体是细胞识别并接受生物材料为“自体”ECM的关键。组织工程研究现状组织工程研究的器官及其部分产品支架设计与制备技术1.天然高分子材料支架：蛋白质支架（胶原支架、明胶海绵、丝纤维基材）多糖支架（壳聚糖-阳离子多糖、海藻酸盐-存在于褐藻的阴离子线性多糖）蛋白质-多糖支架（明胶-海藻酸盐、壳聚糖－明胶）Preparationschemeofgelatinhydrogelsbythefreeze-dryingprocedure.冷冻干燥法制备明胶海绵支架示意图明胶海绵支架FabricationofporousgelatinscaffoldsH.-W.Kangetal.Biomaterials20(1999)1339-1344明胶水溶液用戊二醛交联形成凝胶，放置12h后用甘氨酸处理将水凝胶分别在－20°C和－80°C预冻12h（或在液氮中冷冻20min)冷冻干燥4天明胶是胶原的部分变性衍生物,由胶原的三重螺旋结构解体为单链分子而形成,可作为细胞培养的支架以及生长因子的控制释放载体。Anopticalphotographofahydrogelfreeze-driedfollowingfreezingat-20℃

and(b)aSEMmicrographofitshorizontalcross-section.SEMmicrographsofhorizontalcross-sectionsofgelatinhydrogelsfreeze-driedfollowingfreezing(a)at-80℃and(b)inN2(l).-20℃,孔径250±120μm-196℃,孔径45±5μm-80℃,孔径85±35μmH.-W.Kangetal.Biomaterials20(1999)1339-1344SEMmicrographsofverticalcross-sectionsofgelatinhydrogelsfreeze-driedfollowingfreezing(a)at-80℃and(b)inN2(l).迅速冷却时,冰晶将受到外应力的作用,而使它们在明胶水凝胶温度梯度方向上取向.不同冷冻温度条件下制备多孔支架的孔隙形态示意图随温度梯度的增大，支架内部孔隙呈三维，二维和一维结构。-20℃-80℃-196℃-80℃-196℃H.-W.Kangetal.Biomaterials20(1999)1339-1344壳聚糖－明胶双层支架：人工皮肤支架皮肤为层状组织,真皮层由成纤维细胞及其细胞外基质构成,而表皮层中的表皮细胞所分泌的角蛋白纤丝不断从增殖层分化为角质层,以保护皮肤,防止水份流失及细菌的侵入.壳聚糖－明胶双层支架：人工皮肤支架壳聚糖与明胶经戊二醛共交联形成杂混聚合物网络(HPN)凝胶,将此溶胀水凝胶经冷冻干燥可制备多孔支架.将装有水凝胶的培养皿直接放在-56˚C的冷却板上,通过调整热传导方式梯度控制样品的预冻过程.此时溶胀水凝胶底部直接与冷却板接触,是直接热传导过程;上部是与空气的对流热传导过程,属于间接热传导过程.由于热传导速率的不同,将形成双层支架,其底层为致密层(孔径较小),上部为疏松层,可用作人工皮肤支架，其透氧性优异，能控制蒸发水的损失量，防止外源性微生物的侵入。Thelamellarstructureofthebilayerscaffoldwithdifferentlocalmagnification:(a)100;(b)400;(c)1000:壳聚糖－明胶双层支架的层状结构,致密表层的孔径为0.43μm,疏松底层平均孔径102μm.J.S.Maoetal.Biomaterials24(2003)1067–1074Keratinocytesculturedfor1weekonfibroblast－containingscaffoldsthathadbeenculturedfor3weeks:(a)H&E;originalmagnification×100;and(b)H&E;originalmagnification×400.角质形成细胞在成纤维细胞培养3周的支架上培养1周后的HE（苏木素－伊红）染色照片J.S.Maoetal.JBiomedMaterRes64A(2003)301–308纤维粘结技术Fabricationofnon-woven相分离技术phaseseparation溶剂流延－颗粒沥滤法Solventcastingandparticularleaching（成孔剂析出法）膜材层压法Membranelamination熔融模塑法Meltmoulding超临界流体技术Supercritical-fluidtechnology（高压处理法、气体发泡法）2.合成降解聚合物支架制备技术溶剂流延－颗粒沥滤Solventcastingandparticularleaching将盐粒(用标准筛筛分)分散于PLLA的二氯甲烷溶液中，使之在玻璃培养皿中成膜。待溶剂挥发后真空干燥，将膜浸入水中，洗去NaCl，即得到多孔膜。通过热处理(退火或淬火)可以调节PLLA膜的结晶度（半结晶或非晶态），调节盐粒大小和用量可控制孔的尺寸及孔隙率.缺点是孔隙贯穿率低，必须使用有机溶剂，阻碍了水溶性生物活性剂与支架材料的结合。SEMof90%porous75:25PLGAfoamsfabricatedbyasolvent-castingparticulate-leachingtechnique.Thefoamsexhibitedporesizesrangingfrom150–300μm(a),300–500μm(b),and500–710μm(c).Atopviewofapolymerfoampreparedwithsaltparticlesrangingfrom300–500μmandseededwithcells(22.1×105cells/cm2)revealslayersofosteoblastscoveringtheporessurfacesafter1dayinculture(d).IshaugSL,JournalofBiomedicalMaterialsResearch,Vol.36,17–28(1997)植入物孔径为20μm时适于成纤维细胞的长入，20～125μm时适合成年哺乳类皮肤组织的长入，而100～250μm适合骨组织再生。采用溶剂流延/盐颗粒沥滤技术可制备87％～91％孔隙率、孔径100～500μm的多孔支架。采用乳液冷冻干燥法可得到孔隙率>90％、孔径20～200μm的支架。相分离法/冷冻干燥法Phaseseparation/freezedrying用于制备组织工程多孔支架的相分离法是指将聚合物溶液、乳液或水凝胶在低温下冷冻，冷冻过程中发生相分离，形成富溶剂相和富聚合物相，然后经冷冻干燥除去溶剂而形成多孔结构的方法。因而，相分离法又往往称为冷冻干燥法，按体系形态的不同可简单地分为乳液冷冻干燥法、溶液冷冻干燥法和水凝胶冷冻干燥法。该法避免了高温，有利于生物活性分子如蛋白质生长因子或分化因子的引入和控制释放。乳液冷冻干燥将水与聚合物溶液一起均化得到油包水乳液，并浇铸到模具中，冷冻干燥脱除水分和溶剂，得到多孔支架。支架孔隙率91-95％，平均孔径13-35μm,大孔尺寸达200μm，孔表面积达58-102m2/g，为相连的孔结构。MC:二氯甲烷PolymerVol36,1995,837-842SEMsofPLGAscaffoldsusedininvitroproteinrelease.(a)Group1:poresize=58±2μm.(b)Group2:poresize=33±8μm.(c)Group3:poresize=65±5μm.Allscaffoldshadabout90%porosityandabout10m2/gspecificsurfacearea.PolymerVol36,1995,837-842改变参数（如水体积分数，聚合物质量分数以及聚合物分子量）可调控支架的孔隙率，平均孔径及比表面积。3.快速成型（Rapidprototyping,RP)

又称固态自由成型（Solidfreeform,SFF)

虽然传统的支架制造方法应用已经十分广泛，但存在致命的缺点，主要表现为制造过程人工操作、使用有毒的有机溶剂，很难制造出与缺损组织相匹配的外形轮廓。使用快速成型技术（RP）或固态自由成型制备（SFF）方法来制造组织工程支架，不但可避免上述缺点，而且还可有效结合CAD技术，实现对支架结构的优化与仿生设计，以及对支架制造过程的精确控制，可以设计出宏观构造与缺损组织几乎完全相同的3D结构物，可以形成完全通孔、高度规则、形态与微结构具有重复性的支架.快速成型术（RP）制备骨支架，CT扫描患者缺损骨的数据信息。（a）形成计算机三维模型；（b）把模型引入RP软件系统，将其按指定路径切割成层层薄层；（c，d，e）薄层的数据指导RP机器通过三维模型结构层层组装，构建实体三维支架；（f、g）定制的支架和细胞构建都符合头颅复杂的三维轮廓.DietmarWHetal,JTRENDSinBiotechnology,2004,22(7):354-362光固化快速成型术（Stereolithography

Apparatus，SLA)

选择性激光烧结(selectivelasersintering,SLS)三维打印(threedimensionalprinting,3-DP)熔融沉积模塑(fuseddepositionmodelling,FDM)SFF技术中以光固化快速成型术（SLA）出现最早，应用也较多。SLA采用光敏树脂选择性固化，层层覆盖烧结的办法制成模具，然后将支架材料浇铸到模具内，烧结成型后把模具脱除，最终得到一定孔径和孔隙率的三维支架，而且孔洞间也相互连通。在树脂槽中盛满液态光敏树脂，它在紫外激光束的照射下会快速固化。成型过程开始时，可升降的工作台处于液面下一个截面层厚的高度，聚焦后的激光束，在计算机的控制下，按照截面轮廓的要求，沿液面进行扫描，使被扫描区域的树脂固化，从而得到该截面轮廓的树脂薄片。然后工作台下降一层薄片的高度，已固化的树脂薄片就被一层新的液态树脂所覆盖，以便进行第二层激光扫描固化，新固化的一层牢固粘结在前一层上，如此重复，直到整个产品成型完毕。光固化快速成型术（Stereolithography

Apparatus，SLA)MSTL制备的支架模具的SEM图像和最终成型支架形貌和内部构造JongYK,JMicroelectronicEngineering,2007,84:1762–1765

成纤维细胞在3D支架上的培养SEM结果。（a）细胞种植入支架4天后；（b）1周后；（c）4周后JinWL.JMicroelectronicEngineering,2007,84:1702–1705选择性激光烧结(selectivelasersintering,SLS)选择性激光烧结常采用红外激光束选择性烧结聚合物或者聚合物／生物陶瓷的复合材料粉末来形成材料层。成型时，先在工作台上均匀铺设一层粉末材料，将其加热至略低于它的熔化温度，然后高精度的激光扫描系统按照二维层数据的信息，控制激光束的照射位置和强度，照射粉末层，粉末材料融化后相互黏结，形成一截面层；然后工作台下降一截面层的高度，再进行下一层的铺料和烧结，如此循环至堆积到所需的支架高度。SLS技术适用于多种原料，包括类工程塑料，金属，陶瓷。SLS不使用有机溶剂,但烧结会引起高温.GriffithLGetal.Science295,1009(2002)三维打印（3D-printing)根据系统计算机所设计的支架形貌，在预先放置粉末的平台上，室温下打印喷头在CAD的控制下沿X轴和Y轴方向运行，同时喷头在粉末的表面喷出黏结剂，黏结剂黏附临近的颗粒形成二维结构；该二维结构沿轴方向降低，其上再放置一层粉末，重复上述过程，待制备出符合预先设计形状的支架后移去未结合的粉末。Scaffoldsmadeofastarch/chitosanblenddesignedandfabricatedviaa3Dprintingprocess.3D打印技术制备的淀粉/壳聚糖支架,采用水溶液作为粘合剂.由于3D打印是在室温条件下进行,生长因子等活性物质可引入到多孔支架而不失活.J.Biomater.Sci.PolymerEdn,Vol.12,No.1,pp.107–124(2001)Schematicillustrationofthefuseddepositionmodeling(FDM)process.熔融沉积模塑过程示意图熔融沉积模塑(fuseddepositionmodelling,FDM)首先将待用的支架材料拉丝，再放入融化器中熔融，喷嘴沿X轴和Y轴挤出聚合物束材，并通过沉积构建支架层模型，沿Z轴方向降低该模型并重复X轴和Y轴的运动即可层层构筑三维支架。D.W.Hutmacher/Biomaterials21(2000)2529-2543VariationinFDM-fabricatedHDPEscaffoldmicro-architecturesproducedusingdifferentrastergapsettings(RG)andlaydownpatterns;RG=200mm(a)0°/90°,(b)0°/60°/120°and(c)0/36/72/108/144°;RG=500mm(d)0/90°,(e)0/60/120°and(f)0/36/72/108/144°.通过FDM技术可设计制造出具有完全通孔网络结构的3D支架,支架加工过程完全由计算机控制,试样重复性好.FDM技术没有粉尘和化学物质污染。D.W.Hutmacher/Biomaterials21(2000)2529-2543静电纺丝纳米纤维在组织工程中的应用利用外加电场力使聚合物溶液或熔体克服表面张力在纺丝喷头毛细管尖端形成射流,当电场强度足够高时,在静电斥力、Coulomb和表面张力的共同作用下,聚合物射流沿不稳定的螺旋轨迹弯曲运动,在几十毫秒内被牵伸千万倍,随溶剂挥发,射流固化形成亚微米至纳米级超细纤维。目前已有超过100种天然和人工合成高分子材料被成功地电纺成纳米纤维,所得单根纤维的直径从40-200nm,甚至可以跨越10-10000nm的量级,即微米、亚微米或纳米尺度范围。静电纺丝过程示意图J.M.Deitzeletal./Polymer42(2001)261–272PolymersolutionPolymerjetMetalcollectorVAmbientconditions

TemperatureHumidityProcessingconditions

AppliedvoltageFeedrateDistancefromneedletocollectorNeedlediameterSolutionproperties

Viscosity/

Concentration

Conductivity

ElasticitySurfacetension静电纺丝技术纤维直径：10nm-5µm平均孔隙率：＞85%对材料本身和所负载物质（包括活性蛋白类物质）没有影响。能够制备直径与天然ECMs(其中胶原纤维的直径为50-500nm)相近的连续超细纤维,因而支架可以最大程度地仿生人体内ECMs结构;(2)能够简捷地制备各种聚合物支架,支架材料可以是单一的聚合物,也可以是多种聚合物的复合体,并可以在支架中引入无机粒子(如羟基磷灰石等)、生长因子、细胞调控因子甚至活细胞；(3)制备的支架具有较高的孔隙率和较好的孔道连通。通过调节加工参数,电纺纳米纤维的孔隙率可达90％左右,能够满足细胞生长对材料孔隙率的要求,由纳米纤维层层堆积而成的结构也确保了支架具有良好的孔道连通性。此外,纳米纤维具有极大的比表面积。这些都为细胞的生存提供了良好的微环境,有利于细胞的粘附、分化、增殖；(4)通过选择适当的材料和加工参数,可以获得降解率可控的纳米纤维支架,并能对材料表面进行理化修饰,提高支架的生物相容性;(5)通过调节溶液浓度、纺丝参数等可以控制支架的厚度、三维结构和力学性,很好地支持细胞生长.静电纺丝技术的优点具有纳米结构建筑体系的支架有巨大的比表面积，有利于吸附蛋白，提供更多的与细胞膜受体的连接点。纳米纤维支架体系与微米级支架体系培养细胞对比图A和B分别代表细胞连接在微米尺寸的孔洞和纤维上。可以看出细胞在这种微米级别的支架上黏附似乎是培养在2D平面上。为了培养组织细胞在3D环境中，孔和纤维尺寸必须比细胞显著的小.ABScience,2005,Vol310,1135-1138纳米纤维可用于模拟细胞外基质(ECM)细胞在ECM上的生长很大一部分取决于支架材料的化学特征和物理特征。纳米纺丝技术可以通过调节材料的特异性基团（亲水、疏水基团、特异蛋白吸附基团）、物理特征（硬度、粘弹性、韧性）以及形成的3D-ECM结构（孔隙率、纤维排布、纤维直径等）达到仿制天然ECM结构的目的，以利于细胞的粘附、生长、迁移、分化。相对其他形式的ECM，纳米纤维ECM具有较高的孔隙率、仿真纤维蛋白结构和形貌可控性强、设备简单、投入小等特点。小肠胶原蛋白纤维结构纳米仿真纤维结构纳米纤维是一种三维结构，它具有直径分布宽、高多孔性、高比表面积，因此相比于其他结构更有利于细胞连接。2.有利于氧气和营养成分的补给渗透。3.对于生长因子和其他蛋白或药物有极好的传送性能。4.这种结构与人体自然的细胞外基质十分相似,适于生物响应作为组织替代品。纳米纤维支架作为组织工程支架的优势：学界研究情况国际纳米纺丝研究机构分布SCI静电纺丝论文数量统计生物材料的纺丝据资料显示：现有的大部分用于组织工程的材料都已被电纺成丝。2001-2006报道的纺丝生物材料各种组织所适宜的纺丝材料生物功能材料纺丝的纳米纤维聚乙烯醇PVA壳聚糖CS聚乳酸PLA温敏性纤维PNiPAAm聚N异丙基丙烯酰胺Poly（NiPAAm－co－styrene）PVP(聚N-乙烯基吡咯烷酮)定向排列的纳米纤维中空TiO2纤维多孔PMMA纤维表面带羧基的PS纤维表面带磺酸基的PS纤维表面带氨基的PS纤维多孔及表面修饰的纳米纤维肝细胞在同种材料的膜片及纳米纤维上的生长膜纤维纳米纤维促进肝细胞的生长平滑肌细胞在定向纳米纤维上的生长

SEMImageCLSMImage平滑肌细胞（SMC）黏附在

定向排列的纳米纤维上培养一天后对细胞核及肌动蛋白染色箭头为纳米纤维定向排列方向

20mm5h10hSEMimageofthePLANanofibrous人骨髓间质干细胞SEMImage定向微米无序微米定向纳米无序纳米神经干细胞培养在PLLA2天LSCMImagePLLA纤维神经干细胞神经丝染色照片显示神经突在不同程度定向排列的PLLA纳米纤维表面的生长情况，G-I纳米纤维定向程度逐渐降低。Alignmentofneuritesisdependentonthealignmentofunderlyingnanofibers.A–C:SEMimagesoffiberswithhigh(A),intermediate(B),orlow(C)alignment.G–I:NeuritesfromDorsalrootganglia(DRG,背根神经节)grownfor3daysonfibersofidenticalalignmentsasdepictedinA–C.CoreyJMetal.JournalofBiomedicalMaterialsResearchPartA，2007：636-645神经丝染色照片显示不同程度定向排列的PLLA纳米纤维对神经节形状和神经突长度的影响。A-C纳米纤维定向程度逐渐升高。Effectsoffiberalignmentonneuritelengthandgangliashape.DRGgrownfor3daysandthenstainedforneurofilamentareshownonrandomlyalignedfibers(A),intermediatefibers(B),andhighlyalignedfibers(C).CoreyJMetal.JournalofBiomedicalMaterialsResearchPartA，2007：636-645目前认为用于防止手术后粘连的材料是很有限的，而电纺生物相容性的纳米纤维是非常有效的。PLGA纤维膜可有效减少术后伤害部位的粘连，这种优势体现在成分的可调性，药物（抗生素）导入性以及非常容易放置。外科手术poly(lactide-co-glycolide)静电纺丝对生物活性物质影响不大在静电纺丝过程中包埋细菌和病毒，其均保持生物活性,为包埋DNA，细胞等提供了一种有效的方法。组织工程支架材料展望人工细胞外基质2.新一代组织工程材料

生物材料表面三维化、细胞黏附介导生物材料3.人工细胞外基质智能化

温度敏感性二维细胞片层转载系统、温度敏感性可注射水凝胶、释放载体智能化Extracellularmatrix(ECM)

Scanningelectronmicrographofnativeextracellularmatrixinconnectivetissue.Itislargelycomposedofcollagenfibrils.Thehydrogel,composedofproteoglycansandglycosaminoglycans,thatnormallyfillstheintersticesofthisfibrousnetworkhasbeenremovedbytheprocessingtreatment.人工细胞外基质天然ECMs在组织和器官中起骨架作用，使细胞聚集，构筑组织，控制组织结构，调控细胞表型。ECMs主要由胶原、蛋白聚糖和糖胺聚糖组成，胶原纤维提供拉伸强度，糖胺聚糖凝胶使营养物、代谢物和生长因子扩散，纤连蛋白等介导细胞的黏附。Schematicdiagramofcelladhesiontoextracellularmatrix(ECM)moleculescontainingaspecificcell-adhesionsequence[Arg–Gly–Asp(RGD)].CellsbindtotheECMthroughintegrincellsurfacereceptors,whichconsistoftwosubunits.MechanicalforcesintheECMaretransducedintothecellviaintegrin-mediatedcellbinding.Theintegrin-mediatedcell-bindingandmechanicalforcesinfluencegeneexpressionviaeithercytoskeletonorchemical-signalpathways(e.g.tyrosinephosphorylation).KimBS,TrendsinBiotechnology,1998,16:224新一代组织工程材料

生物材料表面三维化利用材料的表面拓扑结构调控细胞的行为。研究表明，多种细胞可响应微米尺度和纳米尺度的信号。成纤维细胞对生物材料表面的三维岛状拓扑结构比较敏感。成骨细胞的细胞表型和骨接触程度响应表面拓扑结构，如骨首先在沟纹和裂缝内形成。粗糙的表面增强细胞的响应性。利用疏水性聚苯乙烯（PS）和亲水性聚4－溴苯乙烯（PBrS)在硅芯片旋涂过程中的自发相分离原理，在硅芯片表面构筑三维拓扑结构。通过聚合物的共混比率可改变拓扑结构的形状，聚合物浓度可调控拓扑结构的尺寸。可形成高度(13-95nm)和横向尺寸(0.3-2.5μm)可调的PS岛状结构。13nm35nm95nmM.J.Dalbyetal./Biomaterials23(2002)2945–2954高度为13nm的岛状结构增强成纤维细胞和内皮细胞的功能，而高度为95nm的岛使细胞的功能有所减弱。FluorescentimagesofHGTFNcytoskeletonsoncontrolandtestmaterials.M.J.Dalbyetal./Biomaterials23(2002)2945–2954细胞黏附介导生物材料纤连蛋白和其他细胞外基质糖蛋白中的黏附结构域中含有特殊氨基酸序列，如精氨酸－甘氨酸－天冬氨酸（RGD）。用RGD修饰合成材料表面可介导细胞的黏附。成纤维细胞与材料表面接触时首先要黏附，进而铺展,其后才能进行分裂。就细胞黏附而言，适宜的黏附力才能保证细胞的正常迁移。KimBS,TrendsinBiotechnology,1998,16:22428nm58nm73nm85nm58nm,withoutRGDSchemeofbiofunctionalizednanopatterntocontrolintegrinclusteringincellmembranes:Audotsarefunctionalizedbyc(RGDfK)-thiolsandareasbetweencell-adhesiveAudotsarepassivatedbyPEGagainstcelladhesion.Therefore,celladhesionismediatedentirelyviac(RGDfK)coveredAunanodots.AseparationofAu/RGDdotsby73nmcauseslimitedcellattachmentandspreadingandactinstressfiberformation,becauseofrestrictedintegrinclustering.Thisisindicatedbynofocaladhesionactivation(FA),whereasdistancesbetweendotsof58nmcausedfocaladhesionactivation(FA).RGD的密度要适宜,才能使细胞既能黏附又能迁移,RGD纳米团簇结构比无规的RGD更有效地诱导细胞的黏附与迁移.对表面氨基化后的基底进一步修饰使之连接上氧化后的葡聚糖。葡聚糖上的羟基通过过碘酸盐反应氧化生成醛基，进而共价结合上生物活性肽段：利于细胞吸附的GRGDSP，控制细胞的非特异性吸附的GRADSP，和促进神经元生长活性的IKVAV。

StephenP.Massia,etal.JournalofBiomedicalMaterialsResearchPartA,2004,68:1(p177-186)实验中采用的细胞为3T3纤维细胞，类神经元细胞PC12和类神经胶质细胞T98-G.连接有Gly-Arg-Ala-Asp-Ser-Pro（RAD）短肽这样一个非促黏附的基团的表面和单纯连接葡聚糖的表面都不促进细胞黏附；连接有Gly-Arg-Asp-Ala-Ser-Pro(RGD)短肽的材料表面能够显著增强纤维细胞和神经胶质细胞的黏附,但神经细胞（PC12）仅发生很小量的黏附；相反，修饰有Ile-Lys-Val-Ala-Val(IKVAV)短肽的材料表面则能显著提高神经细胞的黏附性,而纤维细胞和神经胶质细胞的黏附则不明显.修饰有IKVAV的材料对神经细胞的轴突生长有显著影响。StephenP.Massia,etal.JournalofBiomedicalMaterialsResearchPartA,2004,68:1(p177-186)A.含有IKVAV的短肽两性分子自组装形成纤维状结构。除了有促轴突生长的IKVAV片段外，该分子其他部分包括4个Ala和3个Gly残基以及十六烷烃链，它们构成了该分子的疏水部分。该分子在水溶液中自组装将功能性的基团暴露在外。B为自组装后纳米纤维的扫描电镜图片。这种纳米级纤维有较高的纵横比和表面积，可以提供和细胞外基质类似的三维环境。GabrielA.Silva,etal，SCIENCE，303:1352-1355,2004A、B为同一区域不同聚焦的在IKVAV纳米级纤维上培养一天后生长的神经元细胞，绿色部分为分化成熟的神经元细胞，桔色部分为星型胶质细胞。C为7天后在IKVAV纳米纤维上长出的大量的轴突。D、E为1天和7天后在基底上修饰层联蛋白后细胞生长的结果。可见神经元细胞未实现特异的定向分化，仍有相当数量的分化为星型胶质细胞。由自组装形成的IKVAV纳米纤维和单层层联蛋白相比，大大增加了其中生物活性决定基的数量，从而能够有效地促进神经元细胞的分化。GabrielA.Silva,etal，SCIENCE，303:1352-1355,2004人工细胞外基质智能化温度敏感性细胞培养基质以非酶解方式回收细胞片层：poly(N-isopropylacrylamide)(PIPAAm)：聚异丙基丙烯酰胺低临界溶解温度（LCST）：32℃above多种细胞共培养SchematicdiagramofthepreparationofPIPAAmpattern-graftedculturedishes.M.Yamatoetal./Biomaterials23(2002)561–567Schematicdiagramoftwomethodsofcellseedingforpatternedco-culture.M.Yamatoetal./Biomaterials23(2002)561–56737℃时PIPPAm具有弱疏水性,能吸附血清中的黏附蛋白,使细胞黏附增殖.待细胞扩增后,温度降至32℃以下,PIPPAm变为强亲水性,细胞由伸展状态变成球状,细胞脱附.20℃时PIPPAm具有强亲水性,黏附蛋白的吸附及细胞黏附被高度抑制.Patternedco-cultureofhepatocytesandfibroblasts.(a)Metalpatternedmaskhavingcircularholes(1mmindiameter).(b)HepatocyteswereseededandculturedonPIPAAm-pattern-grafteddishesfor5hat20℃,thenspreadat37℃onlyonnon-graftedTCPSdomains.(c)Then,thesecondcelltype,fibroblasts,wereseededat37℃,andco-culturedinanorganizedpattern.(d)Magnifiedimageoftheborderoftwodomainsafterasevendaycultureat37℃.Notethefibroblastorientationaroundthecircumferencesofnon-grafteddomains.Bar=1mmina–c,100mmind.(e)Macroscopicviewofpattern-seededhepatocytesbeforethesecondcellseeding.Circulardomainsspreadalloverthe60-mmdishsurfaces.M.Yamatoetal./Biomaterials23(2002)561–567释放载体智能化—生长因子释放载体将VEGF载在PLGA多孔支架内，而PDGF预先用PLGA包裹，再与支架复合形成双重生长因子释放体系。此类支架在开始的7天以1.7pmol/d的剂量在体外释放VEGF，而后以0.1-4.2pmol/d的剂量释放PDGF，可由PLGA的组成和分子量进行调控。骨或肌腱修复中需要诱导血管新生,就要求仿生支架在所需时间(脉管发育的不同阶段需要不同因子起作用),按所需剂量控制释放生长因子(以避免生长因子超过生理剂量时诱发肿瘤的可能性).血管内皮生长因子（VEGF）是血管新生的起始因子。血小板衍生生长因子（PDGP）能征集平滑肌细胞至新生脉管的内皮衬里，促进血管成熟。Naturebiotechnology2001Vol19,1029-1034良好的生物相容性,可降解性仿生化(模拟体内的细胞外基质:细胞识别位点)生长因子及相关基因材料的控制释放支架构造要考虑三种尺度问题: 厘米至毫米尺度决定工程组织的外形,尺寸和支架的孔隙结构; 微米尺度调控细胞的长入和生长,支架表面的拓扑结构; 纳米尺度控制与基质接触的细胞黏附和基因表达.设计组织工程三维支架要考虑的问题:TheEnd…《化妆品术语》起草情况汇报中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所一、标准的立项和下达时间2006年卫生部政法司要求各标委会都要建立自己的术语标准。1ONE二、标准经费标准研制经费：3.8万三、标准的立项意义术语标准有利于行业间技术交流、提高标准一致性、消除贸易误差，作为标准体系中的基础标准，术语标准在各个领域的标准体系中均起着重要的作用。随着我国化妆品卫生标准体系建设逐步加快，所涉及的术语和定义的数量也在迅速增长，在此情形下，化妆品术语标准的制定就显得尤为重要。四、标准的制订原则1.合法性遵守《化妆品卫生监督条例》、《化妆品卫生监