【毕业学位论文】（Word原稿）绿色木霉厚垣孢子与分生孢子生物学特性及生防效果的比较研究微生物学硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 硕士 学位论文 绿色木霉厚垣孢子与分生孢子生物学特性及生防效果的比较研究 F I 摘 要 木霉菌是一 类 重要的生防 真 菌 ，在植物病害中具有重要的应用价值 ，其生长周期内可产生分生孢子与厚垣孢子 。本实验以绿色木霉菌液体发酵产生的厚垣孢子和固体培 养获得的分生孢子为材料，研究了它们的生物学特性的差异、土壤对两者的抑菌作用的差异及对辣椒疫病防治作用的差异，以期探讨两者作为生防制剂形式的各自优缺点，以促进木霉菌生物农药的发展。 结果如下： 1、 不同温度对两种孢子萌发的影响具有显著差异。厚垣孢子萌发 温度范围为 15 40 ，适宜萌发温度为 25 35 ； 分生孢子 萌发 温度范围为 20 35 ，适宜萌发温度为 30 35 。 在相同 温度 条件下，厚垣孢子萌发较分生孢子快，芽管 的 生长速度也快 。 2、 不同的 碳 氮 源对厚垣孢子 和分生孢子 的萌发 有 促进作用 。五种实验糖对厚垣孢子 的萌发有促进作用但糖之间的作用没有显著差异，对分生孢子的萌发影响却有显著差异。蛋白胨和牛肉膏溶液对厚垣孢子和分生孢子萌发的促进作用最大；尿素对厚垣孢子的抑制作用较分生孢子小， ( 全抑制分生孢子萌发，对厚垣孢子萌发有较大影响。 3、 两种 孢子 对 求相对不严格。两者在 12 环境中均能萌发，厚垣孢子适宜的 10，最 适 6； 分生孢子适宜的 3 9，最适 5。 4、 光线对两种孢子的影响不同。紫外线（ 15W、 21射 210s）对厚垣孢子的萌发抑制率为 40%左 右，对分生孢子完全抑制；普通光照对两者萌发没有任何影响。 5、 两种孢子制剂的货架期存在明显差异。两种 孢子制剂室温 贮存 180d 后 检测 ， 厚垣孢子由 108g 下降到 105g，分生孢子由 108g 下降到 103g。 6、 两种孢子对土壤抑菌作用的反应存在差异。 厚垣孢子在土壤 培养基 中培养 24h 而分生孢子仅为 向土壤中添 加营养物质后，有利于厚垣孢子和分生孢子的萌发，但厚垣孢子萌发情况要优于分生孢子。 7、 厚垣孢子和分生孢子对辣椒疫霉病的防治效果没有显著差异，但预防效 果显著优于治疗效果 。 总之，厚垣孢子无论在萌发、抗 性、货架期等方面皆优于分生孢子，其对土壤的抑菌作用较敏感，但低于分生孢子；两者对辣椒疫病的防治效果相当。因此将 厚垣孢子 开发成生物制剂用于病害的防治更有优势。 关键词： 木霉菌 厚垣孢子 分生孢子 生物学特性 生物防效 is an It as We on to as as as 1. on 5 40 , 0 35 , 5 35 0 35 2. of in of no to in (on on of 3 a of at 10, at at 9, at no of on to of to V to V 10s, on no of on 5. in of he of to be 08g.A 80d of in 05g, 03g. So we of to of in in to of in in 7. no of . In to at of V to At it . So to be a to 录 摘 要 . I . 一章 绪论 . 1 言 . 1 霉菌在生物防治方面的研究现状及发展 . 1 霉孢子的形态特征 . 1 霉孢子的生产 . 2 霉孢子制剂 . 4 霉孢子的萌发 . 5 霉在生物防治中的应用技术 . 7 霉对辣椒疫霉的防治研究 . 11 霉菌在生物防治中问题与展望 . 12 究目的与意义 . 12 验内容和方法 . 13 第二章 绿色木霉厚 垣孢子与分生孢子生物学特性的研究 . 14 料和方法 . 14 验材料 . 14 验方法 . 15 计分析 . 16 果与分析 . 16 垣孢子和分生孢子形态特征 . 16 垣孢子与分生孢子萌发特性比较 . 17 垣孢子和分生孢子抗 性比较 . 24 垣孢子和分生孢子货架期比较 . 24 论与讨论 . 25 第三章 土壤对绿色木霉厚垣孢子与分生孢子抑制作用的研究 . 29 料和方法 . 29 验材料 . 29 验方法 . 29 果与分析 . 31 壤抑制木霉厚垣孢子与分生孢子的作用 . 31 菌土壤对厚垣孢子与分生孢子的抑制作用 . 31 壤抑菌机理研究 . 32 壤抑制厚垣孢子与分生孢子作用的解除 . 33 论与讨论 . 34 V 第四章 厚垣孢子与分生孢子 对辣椒疫霉病的生防效果研究 . 37 验材料与方法 . 37 料 . 37 验方法 . 37 果与分析 . 39 色木霉对辣椒疫霉菌生长的影响 . 39 色木霉菌厚垣孢子与分生孢子盆栽防效试验 . 41 论与讨论 . 42 第五章 全文结论 . 46 参考文献 . 48 致 谢 . 56 作 者 简 介 . 57 文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 T. 木霉 色木霉 茨木霉 氏木霉 氏木霉 拟康氏木霉 孢木霉 绢病菌 枯丝核菌 p. 椒疫霉菌 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 1 第一章 绪论 言 随着人们环保意识日益提高，对绿色农产品的需求量增大，人们开始探索植物病害的生物防治，被用于植物病害防治的生防制剂越来越受到人们的青睐（郝林华， 2005）。在很多发达和发展中国家，大量的真菌或细菌源拮抗微生物被商业化生产用来防治植物病害。在众多的真菌生防因子中，木霉菌（ 是最有应用潜力的生防微生物之一，可用来防治多种植物病害（ 1982； 1999）。据统计全世界 25 个国家和美国 43 个州的生物防治课题中，大约 34%进行的是有关木霉的研究。这是因为木霉菌在生物防治上具有独特优势和研究的价值，它具有广泛适应性、抗菌广谱性、拮抗多样性等优点。 木霉菌属半知菌亚门，丝孢纲，丛梗孢目，粘孢菌类，是一类普遍存在的腐生真菌，常见于土壤，根围，叶围，种子和球茎等生态环境中（ 1983）。目前常见木霉属种类有哈茨木霉（ 哈氏木霉（ 多孢木霉（ 康氏木霉（ 、拟康氏木霉（ T. 绿色木霉（ 长枝木霉（ （ 2000）。在众多种类中，绿色木霉（ 1996； 纪明山， 2002；蒲金基， 2002）和哈茨木霉（ 1997； et 2002）应用较多，在植病防治方面表现较好的防治效果。木霉菌在其生长周期内可以产生三种繁殖体，包括菌丝体、厚垣孢子和分生孢子（ 1985）。有关木霉分生孢子的生物学特性、发酵工艺、制剂开发、病害防治等方面都有许多研究，生产上常用的木霉菌剂多为它的分生孢子制剂，且已有许多商品化分生孢子制剂问世，如以色列开发的哈茨木霉 湿性粉剂 国的 哈茨木霉 由于木霉厚垣孢子发酵条件较难控制，发酵周期较长，产孢量不及分生孢子大，长期以来没有受到足够的重视。本实验室经过多年发酵工艺研究，改善了木霉菌液体深层发酵产厚垣孢子的发酵工艺，发酵周期缩短至 5d 左右，产孢量达 107厚垣孢子的 研究及其制剂的开发提供了良好的研究基础。本文对绿色木霉分生孢子和厚垣孢子的萌发特性、抗逆特性、对土壤抑菌作用的敏感性、孢子的存活特性等生物学特性以及对植物病害的防治作用进行研究，以期了解木霉菌分生孢子与厚垣孢子的生物学特性差异，探讨它们作为生防制剂的优势和不足，为木霉菌生物农药的研究和应用提供理论和实验依据。 霉菌在生物防治方面的研究现状及发展 霉孢子的形态特征 木霉菌在 养基上培养菌落初为棉絮状或致密从束，颜色为白色至灰白色，无固定形状（鄢永琦等， 2000）当分生孢子成熟后，菌 自中央到边缘，渐渐变为不同程度的绿色菌落，极中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 2 少数为白色粉状。 的分生孢子梗为重复多次分枝，排列成规则的树状结构，最早形成的分枝较长，后续形成分枝随着离基部距离的增加而逐步变短。瓶梗为安瓶形至坛形，基部常常缢缩，在中间部位稍微膨大，在近顶端突然变细而形成近柱形的颈部。瓶梗的排列为轮状，位于分生孢子梗分枝的终端，有时单生，或者为涡状排列位于靠近分生孢子梗与其分枝分隔的下方。分生孢子形成于瓶形小梗上，分生孢子近球形，椭圆形，或短倒卵形，壁光滑或细胞壁上明显而 微小粗糙突起，浅 绿 色或无色， 大小 2 5 4m（杨合同等， 2002）。 木霉菌常常形成厚垣孢子，在基内菌丝上产量大，间生，或者在营养菌丝侧枝的尖端端生，圆形或椭圆形，无色至浅黄色，大小 面光滑，细胞壁有加厚现象，无性生殖产生，通常有耐不良环境条件的能力。厚垣孢子是木霉菌重要的繁殖体形式，能够确保其在土壤中繁衍（杨合同等， 2002； et 983）。尽管早在 1865 年 就描述过木霉菌的厚垣孢子（ 1939），在以后的木霉菌分类 综述中也经常提到厚垣孢子（ 939； et 1980； 1969），但有关木霉菌厚垣孢子结构的形成、生态学重要性及其与木霉菌在土壤中存活之间的关系仅有少数文献报道。 1954）观察到绿色木霉的分生孢子接种到土壤浸出液中，厚垣孢子能够很快形成。木霉属厚垣孢子在土壤中存活能力要优于分生孢子，至少能存活 20 个月（ 958）。 霉孢子的生产 自从木霉菌的生防效果得到广泛认同以来，许多研究者就对其产孢条件进行了大量的摸索，但有关孢子产生时所涉及的基因表达与生物化学过程则少有报道，仅胡东维等（胡东维 ， 2004）研究过哈茨木霉菌分生孢子发育时的超微结构和细胞化学，发现孢子发育时孢子壁由薄而光滑到厚而产疣，期间脂肪体在分生孢子和产孢细胞中不断累积，最后脂肪体沿内壁排列成一层。 木霉菌分生孢子的产生条件 要求相 对较低，条件适宜时在多种固体或液体培养基 中 都能够产生。城市垃圾、腐败的咖啡果皮、禽类的粪便以及混以牛粪的咖啡果皮、香蕉叶、甘蔗渣和麦麸等廉价物质都可作为木霉菌的固体培养基来生产分生孢子，且孢子产量都可达 1091996；朱辉， 1999； 2003； 2004)。这些材料廉价易得，方法也简单易行，可被农民采用。目前生产上常用的木霉制剂多为分生孢子制剂，因为木霉菌可在许多廉价液体培养基中产生大量的分生孢子（ et 1991； et 1991）。赵培洁、王惠中（ 1995，分 生 孢 子 形成 模 式 图 分 生 孢 子 形 成 显 微 图 厚垣 孢子 形 成 显 微 图 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 3 1998）等人做过浅层液体培养方面的研究，他们应用虫草头孢废液，添加几种中草药（青蒿、黄芩、贯众和板蓝根）作为培养基，接种哈茨木霉（ 分生孢子 进行培养，可获得 108个孢子 /皿。应用虫草头孢废液组合培养液培养哈茨木霉，其产孢量比 氏培养基都高。但液体深层发酵虽能得到大量的孢子，所得到的孢子类型为芽生孢子寿命短且生活力弱，而固体培养方法虽可得到货架期相对较长的分生孢子，但其生产周期长、菌剂含孢量低而导致成本高的弊端同样阻碍了木霉菌的实用化进程 。改善发酵工艺，采用 液固两相 进行 发酵，将含孢量为 108个 /养 24可 得到含孢 量平均为 600亿 / 赵蕾 ， 1999）。此种方法仅利用两种廉价、易得的农副产品为原料，整个工艺过程简便易行，成本低廉，且培养时间大为缩短，可为较大规模生产木霉菌剂提供参考依据。 矿质元素和维生素有助于木霉菌的生长和产孢，向培养基中添加锰、铜、铁等金属元素可明显提高木霉菌的产孢量，但高浓度的铁离子则会影响木霉的生长，产孢下降（纪明山 ， 2004；陈建爱， 2004； 1991）。对矿质元素的需求因种而异， 乏 P、K 或 S 时产孢量明显下降，而 有在缺乏 P 时产孢量才会下降（ 1991）。维生素 组合可大幅度提高木霉菌的产孢量（纪明山， 2004；陈建爱， 2004）。 真菌生防制剂的生产必须迅速且成本较低，在收获、干燥、制剂加工、贮存及运输过程中能够保持活力（ et 1992）。孢子保持较高的活性是生物防治成功的重要环节， 在改进的s 培养基中加入 汁（ 养哈茨木霉菌株 “ 1295，能够得到较多而耐干燥的孢子。环境条 件也是影响木霉菌产孢的重要因素。木霉菌的多数种类对光较为敏感，黑暗和光照交替培养木霉菌菌落可出现同心轮纹，分生孢子产生于光照阶段（ 1968），日光照射3近紫外线（ 366射 10 30s，可以诱导分生孢子的形成（ 1976）。 木霉菌厚垣孢子产生条件相对较为严格，虽然在 麦麸等固体培养基、灭菌土壤、土壤浸出液及植物碎片等基质中 都 产生厚垣孢子（ , 1984； 983） ，但没有形成大规模的发酵生产 。 应用 糖蜜玉米浆等液体培养基 接种 T. 木霉菌株 ，发酵两周， 每克干燥菌丝体可 获得 108 个厚垣孢子（ ., 1983,1984；1983） ；但发酵周期过长，限制了其发展。近年来，国内也有一些探索厚垣孢子发酵条件的报道，如 秦芸 （ 秦芸 ， 2002）就影响木霉菌厚垣孢子产生的因素进行了初步研究，发现萄糖 蛋白胨 1%， 琼脂 2%）是 生厚垣孢子的最佳培养基， 温度 30 、 产孢量较大。光照不利于厚垣孢子的产生，却有利于木霉菌分生孢子的产生（ 1968），说明环境条件影响木霉菌产孢类型。液体发酵可以通过控制培养条件来生产不同类型的孢子，马铃薯葡萄糖培养液、马铃薯蔗糖培养液等虽然都可作为生产厚垣孢子的培养基 。 但是孢子类型和产孢速度却受温度、 影响，在适于木霉生长范围内，低 、24 以下可产生厚垣孢子，最大产孢量能达到 108 个 /敬华， 2005）。但是有关厚垣孢子发酵生产的研究大都处于摸索阶段，本实验室成功开发出一种厚垣孢 子发酵培养基，接种绿色木霉菌（ T. 180r/28 培养 5d，厚垣孢子的产量可达 107产已处于中试阶段。与 厚垣孢子发酵培养基相比（ 1984； 1983），发酵周期显著缩短，孢子含量提高。 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 4 霉孢子制剂 把拮抗真菌加工成适宜形式的制剂是成功实施生物防治的又一重要环节。制剂必须易于使用，贮存和运输而且要有一定的货 架 期。在半固体培养基上生产的生物量可被用于土壤中或种子包衣处理，而液体发酵 的产物则要被加工成粉剂，可湿性粉剂或片剂等形式的制剂（ 2000）。但木霉菌的制剂与加工技术研究较少，木霉菌的大量培养技术尚处于模仿阶段，一般采用液体或半固体生产的方法，以得到大量的菌丝、厚垣孢子或分生孢子（ 1991； 1989；1996； 1984； 1990,1991； 984,1987,1989）。 人（ 1984）研究以褐煤酒糟废液作为载体和底物，接种哈茨木霉，培养 7d 后风干制成颗粒制剂， 20 贮存 4个月后发现木霉菌的成活率仍保持 90以上。 1985）将木霉菌丝加工成制剂能够有效的降低温室里棉花、甜菜和萝卜等猝倒病的发生，并且将这种木霉菌丝制剂应用于田间，防治 染的甜菜，防治效果达到 50。 （ 1991）发 明 了一种新型的生防制剂加工体系，这种体系的特点是在制剂加工过程中不必保持无菌条件，为木霉制剂的生产开辟 了 广阔的空间。应用 两种制剂（玉米芯萌发接种和菌丝粉剂），可以有效的降低西红柿 的发生。 菌丝粉制剂置于聚乙烯袋中，避光保存 3 年，菌丝仍保持活性（ 993）。 人（ 2000）比较了以滑石粉、高岭土和皂土三种惰性物质作为载体对哈茨木霉制剂货 架 期及生物防效的影响，结果表明在贮存 120d 后，以高岭土为载体的木霉制剂活性仍高达 106g，生防效果高于 50，明显优于其它两种物质作为载体的制剂。以滑石粉、叶腊石及藻酸盐作为稀释剂，且包含营养基质如麦麸的粉状木霉制剂，当其施入土壤中不仅繁殖迅速，而且比纯的分生孢子 或厚垣孢子的防病效果好，并且其制剂在土壤中可以减少许多病原菌的存活和生长（ et 1984； 985）。国内也有许多利用木霉制剂防治植物病害的例子，且取得了较理想的效果。薛宝娣等人（ 1995）用 霉的分生孢子制剂在温室条件下对黄瓜猝倒病和黄瓜疫病进行防治试验，效果分别达到 而且具有持续防效和刺激作物生长的作用。郝林华（ 2005）利用拟康氏木霉液体发酵的菌丝制剂防治大田试验，生防效果显著， 深受广大农民 欢迎，有待进一步开发成商品化的农用生物制剂。木霉菌丝型制剂含有 低分子量的抗生素类物质和病原菌细胞壁的降解酶如几丁质酶、 葡聚糖酶等（王惠中等 ， 1995），可以更有效的防治病原菌。 木霉制剂的开发大都以分生孢子为主要对象，厚垣孢子制剂的开发却未见报道，但有一些学者对木霉分生孢子与厚垣孢子干燥后贮存期的生物活性及其生物防治的效果做过研究，但不同研究得出的结论也不尽相同。 2000）等学者研究发现在初始活孢量为 108 个 /g 以上 的厚垣孢子制剂 ，经过 270d 的贮存期后，制剂中 活孢子数仍可达到 106 个 /g。 然而 2002）等研究者却发现分生孢子与厚垣孢子制剂在初始孢子量都为 108 个 /g 以上时，在贮存 150d 后，厚垣孢子制剂中的活孢量不足 106 个 /克，而分生孢子制剂 的活 孢子在 180d 后仍可保持在 106 个 /者在防治 起的鹰嘴豆根腐病时效果没有显著性差异。不同的研究者得出的结论不一样，可能是由于所用的出发菌株不同，贮存时的条件（如湿度、温度等）具有一定的差异所造成的。 当今，以木霉为基础的生物杀菌剂已经问世，利用原生质 体融合技术将一株哈茨木霉菌株成中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 5 功开发成一种商品 化 制剂 种产品主要用于种子处理来预防 起的早期猝倒病（ 992）。在以色列从木霉菌（ 筛选获得的分离菌株 加工制成商品化制剂，此种制剂有四种不同的形式： 子处理剂 剂 湿性粉剂 粒剂，可以用来防治由 和 病 原菌引起的蔬菜和其它植物的猝倒病及根腐病（ , 2000）。木霉商品化制剂种类繁多，名字不一，主要分为四种类型（ 1998）（ 1）可湿性粉剂 如 2）颗粒剂 如 000 ( 3）片剂 （ 4）水剂（分生孢子悬液） 。 霉孢子的萌发 养条件对孢子萌发的影响 尽管不少研究者对木霉孢子 的 萌发做过大量的研究（ 1973； 1983；2004； 庄敬华， 2005；），但有关木霉菌孢子萌发时所涉及的分子机制和生物化学过程却多被忽略。这可能是由于木霉菌的分生孢子在多种营养基质中都能萌发。据有关报道，木霉菌分生孢子的萌发需要提供外源营养物质（ 973），营养物质不同对孢子萌发的影响 具有差异（ 1973； 文成敬， 1995；王芊， 2002； 李雪玲， 2003；）。分生孢子经无菌水冲洗数遍后不能在无营养的蒸馏水中萌发，未洗过的分生孢子或琼脂能够为孢子的萌发提供充足的营养。分生孢子虽然能够适应较宽的 围但却表现较强的嗜酸性特点，在酸性条件下比在中性或碱性环境中萌发要好（ 高克祥， 1995； 王芊， 2002）。温度也是影响孢子萌发的重要因素，但不同的菌株所需要的最适温度范围也不一样，如喜凉的多孢木霉（ 较好地在较低的温度下萌发。 有关木霉菌厚垣孢子萌发 的特性知之甚少，新鲜的厚垣孢子在营养琼脂上萌发较好，其萌发率可达 75%以上（ et 1983），自然干燥后的孢子萌发率却下降到 13% 31%。可能是由于干燥的厚垣孢子可以保持休眠状态，一旦条件合适便会萌发。本实验室研究则发现，绿色木霉厚垣孢子即使在无营养的水中也能够快速萌发， 3h 开始萌发， 8h 萌发率可达 90%左右，此时分生孢子则刚刚开始萌发。这种现象可能是由于厚垣孢子较大，能够贮存较多的营养物质供孢子萌发时利用。 壤抑 菌 作用对木霉孢子萌发的 影响 土壤抑菌作用（ of 是指土壤中或与土壤相接触的微生物繁殖体（包括真菌、细菌、放线菌等）的萌发受到抑制的现象。对土壤抑菌作用机理的解释有营养剥夺和抑制因子两种假说，认为土壤中营养物质的缺乏或抑制因子的存在都能够影响孢子的萌发（ 1953；1977）。 2003）等就证实了土壤微生物种群中的假单胞菌是导致土壤抑菌作用的主要原因，它能够强烈抑制哈茨木霉（ 真菌孢子的萌发。 土壤的抑菌作用及其人为的解除或增强对土壤中 的土著木霉菌或引入木霉菌的生存与种群活力具有非常大的影响。土壤对木霉菌具有较强的抑制作用，而分生孢子对这种抑菌作用表现较中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 6 为敏感（ 1977； 许传坤， 2004）。由于土壤抑制孢子萌发作用的存在，延长了孢子在土壤中的存活期，却不利于生物防治活性的发挥。据相关报道，在不提供任何外源营养物质的情况下，哈茨木霉分生孢子施入土壤后可存活 110d 130d，孢子存活期的长短因菌株的不同而异。大多数的分生孢子在未开始萌发时细胞就已经溶解，或者是有的孢子利用土壤中有机质分解物所提供的有限营养物质进行萌发，但 这种萌发却由于后续营养物质的不足而停止生长随后发生细胞溶解（ 1981）。但向土壤中添加额外营养物质能够部分或全部解除土壤对木霉分生孢子的抑制作用，这种现象在中性或碱性土壤环境中表现更加明显（许传坤， 2004； , 1968）。即使同一菌株，孢子类型不同，大小不一，对土壤抑真菌作用敏感程度也不同，个体较