【毕业学位论文】（Word原稿）右美托咪啶对神经病理性疼痛的作用机制及治疗效果脊髓背角神经元与神经病理性疼痛

1 前 言 疼痛是由组织损伤所引发的一种潜在的或实际存在的不愉快的感觉，其产生不仅包括伤害性刺激的传导，也包括大脑对刺激信息的认知，因此是一种复杂的情感 1。疼痛是临床上最为常见的症状之一，伴随着多种疾病的发生，是目前困扰人类最严重的 临床问题之一。从生物学角度上认为疼痛是一种警戒信号，是机体的一种自我保护机制，可以通过神经系统调节引起一系列针对损伤所产生的防御反应，但是当疼痛持续时间过长且又无得到相应有效的治疗时，疼痛不仅会对患者生理健康产生极大的危害，还会严重影响到患者的生活质量。 由中枢或外周神经系统 原发性疾病和 /或继发性功能损伤而引起的疼痛综合征可称为神经病理性疼痛 1。神经病理性疼痛发病机制复杂，治疗困难，目前认为有效的药物治疗仍是神经病理性疼痛主要的治疗手段 2。现阶段常用的药物如三环类抗抑郁药，抗惊厥药，阿片类镇痛药及非甾体类抗炎药等，因在疗效和剂量上以及产生的不良反应方面都存在一定问题，因而限制了它们的应用 2, 3。由于迄今为止尚无治疗神经病理性疼痛的特效药物，所以针对神经病理性疼痛发病机制的研究及将其作为药物作用靶点而进行有效镇痛药物的研发，是目前疼痛领域研究的热点与难点。 细胞主要有两种死亡形式：坏死与凋亡。细胞凋亡的概念是 1972 年由 同于细胞坏死，细胞凋亡是机体自身启动， 有细胞本身主动控制，由基因调控而使细胞自动消亡的过程，因此又称程序性细胞死亡 4。既往的实验5本课题组之前的研究表明 9, 10，外周神经损伤可引起脊髓背角神经元细胞凋亡，导致脊髓背角结构和功能的改变，使机械痛刺激与热痛刺激表现下降，产生痛觉过敏。有研究表明 11周围神经损伤可引起细胞改变，引起线粒体膜电位失 衡，导致线粒体结构及功能障碍，使得存在于线粒体内的细胞色素 C 通过线粒体上的转化通道，释放到细胞质中，继而与细胞凋亡相关蛋白因子结合形成复合物，进一步裂解及活化与细胞凋亡相关的半胱氨酸 引发一系列凋亡级联反应。通过药物干预抑制细胞凋亡，可以减轻痛觉过敏，从而达到治疗神经病理性疼痛的目的。 右美托 咪啶 （ 美托 咪啶 的活性右旋结构体，是一种新型的高 选择性 2 肾上腺素受体（ 2 2动剂，具有良好的镇静，镇痛作用及神经保护，脏器保护功能 18。右美托 咪啶 可以通过抑制突触上 2 受体，抑制去甲肾上腺素的释放及神经元的兴奋 19；抑制电压门控2 钙离子通道，阻断钙离子超载所导致的细胞凋亡 20, 21。 本实验通过建立大鼠坐骨神经慢性压迫型模型，模拟神经病理性疼痛 ，通过腹腔注射右美托 咪啶 ，观察其对神经病理性痛大鼠的痛行为学及脊髓背角神经元细胞凋亡的的影响，探讨右美托 咪啶 对神经病理性疼痛的作用机制及治疗效果，从而为神经病理性疼痛的治疗提供一定的理论依据及治疗手段。 3 背景回顾 疼痛是大多数疾病具有的共同症状，是人类共有但是个体差异却很大的一种不愉快的感觉，它既有生理感觉方面的客观性，又有心理情绪表达方面的主观性。疼痛按其发生的性质，起因及持续时间长短可分为：急性疼痛和慢性疼痛，其中后者又包括炎性疼痛，癌性疼痛及神 经病理性疼痛。目前关于急性疼痛与慢性疼痛的界限还缺乏统一的标准。比较公认的说法是疼痛超过急性病程 /损伤愈合正常时间或间隔数月或数年又复发的疼痛可称为慢性疼痛。急性疼痛又可称为生理性疼痛，大多为伤害感受性疼痛，约有 2%是与神经系统损害有关的急性神经病理性疼痛。一般急性疼痛不会转变为慢性，而神经病理性疼痛转化为慢性神经病理性疼痛的比例则很高。 1 神经病理性疼痛概述 国际疼痛研究学会将神经病理性疼痛定义为“由神经系统原发损害或功能障碍所导致的疼痛” 22, 23。神经病理性疼痛的病因包括中枢或外周神经系统受损（脊髓损伤，三叉神经痛），代谢紊乱或营养性疾病（糖尿病性神经痛），感染（带状疱疹后遗神经痛，艾滋病性神经痛），神经毒性（长春新碱 ，顺铂，放疗），缺血性（脑梗塞，脑卒中），及其他病因（恶性肿瘤 ，硬化病）等 24, 25。据调查，每 10 万人带状疱疹后神经痛的发病率大于 25%，三叉神经痛为 27%，糖尿病性神经痛发病率为 而且发病率随着年龄及基础病变的加重而增加。流行病学调查提示总人口的 6% 8%曾患具有神 经病理性疼痛特征的慢性疼痛，其中一半患者需要药物治疗或其他治疗 26。由于神经病理性疼痛产生机制复杂，持续时间长，疼痛程度重，治疗效果差，久而久之会严重影响患者生活，工作，饮食及睡眠，产生焦虑或抑郁，导致机体个系统功能失调，免疫力下降并诱发各种并发症，从而严重影响患者身心健康。因此，神经病理性疼痛是目前临床治疗的难点之一，是对 医生，科学家及整个社会的严峻考验，也是医学生物界面临的重要课题。 神经病理性疼痛是临床常见的症状之一，其病程可从数周到数年不等，其主要的临床特征有：自发性疼痛（ 即在没有可见刺激条件下产生的疼痛；痛觉过敏（ ，是指对机械刺激，冷，热刺激等伤害性刺激产生的疼痛表现出过强的，夸大的反应；痛觉超敏（ 是指对正常的，非伤害性刺激产生的触诱发痛，痛觉倒错及灼烧痛等 25, 27 4 2 神经病理性痛模型 由于神经病理性疼痛发病机制复杂，在患者身上研究与疼痛有关的神经机制有悖伦理。因此，利用相应的动物模型开展疼痛机制研究是目前的普遍趋势，好的动物模型能接近或在极大程度上模拟临床患者的病理状态与病理演变过程，为加深人类研 究认识，把握疾病规律，寻找药物作用靶点及最终有效治疗疾病提供了最佳途径。疼痛模型的建立是研究疼痛的重要手段，恰当的模型会在一定程度上推动疼痛学研究的发展。随着人们对神经病理性疼痛认识的加深，各种神经病理性疼痛模型也相继出现，为人类从细胞分子水平对神经病理性疼痛发病机制进行研究提供了有用的工具。 骨神经慢性压迫性损伤模型（ CI 1988 年， 8利用铬制肠线在大鼠坐骨神经分叉处 5度结扎大鼠坐骨神经干，结扎间距约 1 2结扎 4 道，造成轻松结扎的神经水肿，进而铬肠线嵌压肿胀的神经而形成慢性束缚性损伤，导致部分神经纤维变性坏死，即造成粗的有髓神经纤维选择性损伤，而保留大部分传递疼痛的 C 纤维。该模型的动物不仅有自发痛行为，而且还出现热痛敏，冷痛敏及机械痛敏，且操作简单，制作成功率高，手术创伤小，术后并发症少，动物存活率高，易于掌握，因此是最常用的研究神经病理性疼痛的模型之一。 骨神经部分损伤模型（ 1990 年， 0及其同事在动物麻醉状态下，用 8线将坐骨神经干紧紧结扎 1/2 或 1/3，然后检测动物痛行为表现。由于在这一水平支配外周区域的神经纤维在坐骨神经中分布是随机的，所以这种处理方法不会造成特定区域的感觉丧失，且神经损伤的纤维数量也不固定，因此难以确定哪个脊髓节短损伤严重，故其重复性和定量分析较差，从不同动物得到的结果差异也较大。 神经选择结扎模型（ 1992 年， 1创建了可以模拟人类皮肤烧灼样痛的动物模型，方法是结扎大鼠的 6 脊神经或单独结扎 神经，结扎后机械痛敏迅速出现，冷痛敏和热痛敏也会在创伤后 1 天出现，这种行为至少可以持续 4 个月。该模型将损伤神经和未损伤神经的脊髓节段完全分开，有利于比对研究初级传入纤维是否或如何参与疼痛的发生。此模型大鼠有时会出现自残现象，且操作复杂，损伤大，出血多，易感染。 5 骨神经分支选择结扎模型（ 2000 年， 2结扎坐骨神经终 末分支中的胫神经和腓总神经，保留腓肠神经分支，从而建立了坐骨神经 分支选择结扎模型，即半保留神经切断模型。该模型可观察损伤的初级传入神经元与邻近的未受损伤的初级传入神经元的变化，机械性痛敏表现显著是该模型的一个特点，热刺激可引起小鼠屈足时间延长但热痛阈改变不明显。 根节慢性压迫模型（ of 此模型是将一根细钢柱植入大鼠 间孔，压迫背根神经节，从而出现异常和自发性疼痛 33。此模型保留了外周初级传入与传出的功能，背根神经节直接受到持续且稳定的慢性压迫，因此是目前用于研究因腰椎间盘突出，椎间孔狭窄和脊椎骨折所造成的神经根性疼痛的较为理想的动物模型。 3 脊髓背角神经元与神经病理性疼痛 在对神经病理性疼痛的机制研究中发现，存在于脊髓的多种受体，通道以及胞内信号转导分子都参与了神经病理性疼痛信息的传递过程。其中，脊髓背 角神经元在疼痛的感知和传递过程中发挥着非常重要的作用。脊髓背角 是伤害性信息传入通路的第一级中转站，是疼痛信息传递与整合的初级中枢 21。 髓的解剖重构 正常情况下，低阈值的 摸感觉神经元）存在与脊髓胶质区的第和第层，高阈值的 C 纤维（痛觉神经元）位于脊髓背角的第层 34。当神经受损后， 入到脊髓背角浅层，占据 C 纤维的突触部位与二级神经元发生新的突触联系。这样正常接收高阈值感觉传入的层神经元，开始接收来自于 成正常的触觉刺激被误认为是疼痛刺激，出现异常痛敏 35, 36。 枢敏化 有实验发现，当外周神经受损引起神经病理性疼痛时 脊髓背角神经元呈现出兴奋性持续增强的表达，即中枢敏化，其特点是具有长时程增强效应（ 37。这种神经元的兴奋性从短期增强转化到 持久的增强，可能与神经病理性疼痛的维持有关。实验显示 38, 39，脊髓 体显然参与了神经元兴奋性的改变。正常情况下， 体不参与突触传6 递，因为在静息膜电位下，该受体被 阻断，此时即使谷氨酸与 体结合也不会引起离子通道的开发。由于神经受损，伤害性强制刺激引起突出后膜持续去极化，去除了 的阻断作用，使 体通道开放，引起 量内流。 度超载可以激活蛋白激酶，如 ， 性的增加，可以加强 体和非 体介导的电活动，提高脊髓背角的兴奋性递质与受体作用 40。此外 度升高还会激活 钙调蛋白敏感位点，进一步激活 生大量 作为逆行性递质，作用于突触前膜，促进谷氨酸释放。大量的谷氨酸聚集在突触间对中间神经元产生细胞毒性，进一步引起细胞凋亡 9, 41。 枢去抑制 正常情况下，抑制性中间神经元可以抑制 C 纤维中枢端释放神经递质，同时还可抑制脊髓背角神经元的兴奋性，起着抑制伤害性信息传递的作用。当周围神经受损后，脊髓背角浅层的抑制性中间神经元出现跨突触的兴奋毒性改变，发生变性。而由于神经受损，引发 流，激活蛋白激酶 以磷酸化细胞膜上的 体，使突触前膜释放的 少，使得伤害性传入刺激在脊髓背角浅层诱发的抑制性突触后电位明显下降或消失， 导致中枢抑制性中间神经元对伤害性刺激信息传递的抑制作用减弱，从而产生痛觉过敏 42, 43。 4 细胞凋亡相关蛋白因子 细胞凋亡过程中涉及到一系列的蛋白酶，由这些蛋白酶所构成的级联反应实际上是凋亡过程的核心。 白家族 凋亡信号在细胞凋亡的启动，传递和执行过程中，绝大部分需要半胱氨酸 参与 44。功能可以分为两类：第一类是起始酶，主要包括 二类是执行酶，主要包括 始酶位于细胞凋亡途径的上游，可以被自激活，一般含有一个较长的原结构域，凋亡开始时，起始酶在接收到死亡信号后能够自行激活。而执行酶位于凋亡途径的下游，一般含有较短的原结构域，它们的激活则需要起始酶的加工。 执行凋亡的主要酶类， 原（ 包括 3 个部分：原结构域（ 大亚单位（ 小亚单位（ 酶原本身的活性7 很低，但可以通过被其他酶（包括自身）切割所激活。一旦结构域及大，小亚单位之间的连结被自主切除，大小亚单位就会相互作用形成一个异二聚体，两个异二聚体再寡聚化形成一个异四聚体，这就是活化形式的 化的 据 将 物大致分为 4 类：第一类底物是经酶切后能被活化，如 身以及 2 等；第二类为酶切后底物失活，如 化亚单位，视网膜细胞瘤蛋白等；第三类为酶切后底物结构发生改变，如 A 型和 B 型细胞核 ；第四类为酶切后凋亡作用尚不清楚的底物，如聚 细胞凋亡中发挥的作用主要有以下三个方面： 1)灭活细胞凋亡发生的抑制剂，如 降解，灭活特定的核酸内切酶抑制剂，使核酸内切酶被释放出来，作用于凋亡细胞核 起 特征性降解；又如 这一过程中， 可产生促进细胞凋亡的物质； 2)直接破坏裂解细胞结构，如 裂解核纤层蛋白而引起核纤层的崩解，并导致染色质的浓缩；同时 识别并裂解几种参与细胞骨架调节的蛋白，包括凝胶蛋白，局部粘附激酶等； 3)裂解某些功能性的酶蛋白 45。 联反应中处于核心地位，不同的蛋白酶可以切割并激活 原，活化后的 作用于相应的底物，参与细胞凋亡级联反应， 活化标志着细胞凋亡进入不可逆阶段 46。 白家族 白家族是细胞中一组至关重要的凋亡蛋白。迄今为止，在哺乳动物，线虫和病毒中已发现并确定了近 20 个 白家族成员，按功能可将其划分为两大类：一类是具有促凋亡（ 能的蛋白，主要包括 ；另一类则具有抗凋亡（ 能，主要包括。 族中最先被发现的蛋白，它主要存在于线粒体膜，光面内质网及核膜，其羧基端为疏水性，含有一个由 19个氨基酸伸展成的跨膜结构。 能的发挥很大程度上依赖于其在亚细胞膜上的定位， 羧基末端作为信号锚序列插入线粒体外膜，而 离的氨基末端的大部分暴露于胞浆，借此可与胞浆内各种蛋白或其他邻近的也被锚定在线粒体膜上的与 似的分子（如 互作用。 高表达能够 阻断多种因素诱导的细胞凋亡，抑制凋亡特征的出现，包括早期信号 解，细胞的固缩，胞核的浓缩等。它不影响细胞周期的进程，不让细胞进入 M 期，而是进入 ，即它只促进细胞的存活。 制8 细胞凋亡的可能作用机制有以下几种： 1)抑制线粒体释放促进凋亡的因子，如细胞色素 C，凋亡诱导因子（ 2)细胞内抗氧化作用，活性氧损伤 是 细胞凋亡的一个诱因，而 高表达可减少氧自由基的产生和脂质过氧化物的形成；3)抑制钙离子跨膜流动； 4）抑制促凋亡调节蛋白如 细胞毒作用 45, 47。 5 脊髓背角神经元凋亡在神经病理性疼痛中的作用 细胞凋亡不仅在生理状态下，对细胞的选择，分化及衰老细胞的 清除 起重要作用，而且参与多种疾病的发生过程。 1990 年，有研究发现周围神经损伤后神经元的早期病理变化包括染色质深染及细胞塌陷皱缩，因易被深染 而被称为“黑色神经元或暗神经元”，而其进一步变性退化，最终走向死亡的结局 5。“黑色神经元”的出现表明细胞构架蛋白已被破坏，代表可逆性神 经元损伤，提示与细胞凋亡有关。 2004 年， 48发现阻断谷氨酸 体可以减少凋亡基因的表达及所谓的“凋亡状态”。 2005 年和 2006 年， 3,49和傅开元 50等也分别在神经病理性疼痛及炎性疼痛模型中发现了脊髓神经元细胞凋亡。有实验发现 51，在周围神经损伤引起的神经病理性疼痛中，给予制剂 制剂 现当抑制了 白因子活性后，能显著降低脊髓细胞死亡，降低机械痛敏与热痛敏。 本课题组之前的研究表明 9，在慢性坐骨神经压迫性损伤模型中，通过 测，在 后观察到了大鼠脊髓背角神经元细胞凋亡，这与近年来研究证实的：凋亡是外周神经损伤后脊髓神经元死亡的重要方式，这一结果相一致。 然而关于脊髓背角神经元细胞凋亡与痛觉过敏之间是否存在相一致的因果关系，目前仍未有定论。 根据现有的研究分析，脊髓神经元细胞凋亡参与痛觉敏化的形成机制可能与以下因素有关： （ 1） 抑制性中间神经元的凋亡：有研究发现 5, 6，外周神经损伤可引起脊髓中间神经元发生变性，坐骨神经结扎后脊髓背角浅层（层）的抑制性 中间神经元发生结构的改变，在光镜下观察到核深染，即为“黑色神经元”。而通过采用 标对 鼠腰段脊髓切片观察发现，脊髓背角神经细胞发生细胞凋亡，而凋亡的这些神经元细胞是能够释放抑制性递质（如 抑制性中间神经元 7。由于抑制性中间神经元的凋亡，使得脊髓背角传导痛觉的伤害性感觉神经元异 常兴奋，从而产生痛觉过敏。鞘内注射 体激动剂，可拮抗外周神经损伤所引发的痛觉过敏，进一步证明抑制性中间神经元的凋亡是引起神经病理性痛的重要因素 52。 9 （ 2） 轴突芽生的形成：芽生是未受损伤的神经元轴突生长增长，并走向损伤区域以代替退行性变轴突的一种反应，是神经损伤后进行修复的一种方式。有研究发现 53，在外周神经损伤的大鼠神经病理性疼痛模型中，脊髓背角浅层神经元发生凋亡后留下空隙，脊髓深层的未受到损伤的神经纤维可通过芽生的方式，使 轴突伸入到脊髓背角浅层，与浅层的伤害性神经元构成新的突触联系，使伤害性刺激信息传导通路发生异常放电，引起神经兴奋性升高，产生痛觉过敏或痛觉异常。通过使用 体拮抗剂 够抑制神经损伤诱导的芽生，这可能是由于脊髓背角发生的不同程度的神经元凋亡 54。 6 右美托 咪啶 的药理作用与临床应用 2 肾上腺素受 体（ 2 2泛存在于中枢与周围神经系统，刺激突触前 2通过负反馈机制，调节肾上腺素的释放；刺激突触后 2引起神经细胞膜超极化。 2过与 G 蛋白偶联，产生不同的细胞内信号转导机制，包括：抑制腺苷酸环化酶活化，降低细胞内 平；抑制蛋白激酶 A 及其所调控的蛋白质磷酸化；激活钾离子通道，使细胞膜超极化，减少神经元放电；抑制电压门控钙离子通道等 20。 右美托 咪啶 是一种新型的高选择性 2 肾上腺素受体激动剂， 其 与 2 和 1受体 亲和力之比 为 1620:1， 是另一种 2 肾上腺素受体激动剂可乐定的 8 倍 55, 56。右美托 咪啶起效 时间约 15 分钟，持续输注 1 小时可达峰 浓度，具有双相半衰期，分布半衰期约 6 分钟，清除半衰期约 2 小时。右美托 咪啶 有较高的蛋白结合率（ 94%）和较大的分布容积。 右 美托 咪啶 具有镇静，镇痛，抗焦虑，抑制交感神经活性，稳定血流动力学，有一定的脏器保护作用，能减少麻醉药用量，呼吸抑制作用轻的特点 57。美国药品与食品管理局于 1999 年批准将其应用于成人重症监护病房短 时间（ 24 小时）的镇静与镇痛。 2009 年我国食品药品监督管理局批注用于全身麻醉时的诱导和机械通气时的镇静。有报道指出，在缺血，术后急性疼痛，人类顽固性癌性疼痛以及福尔马林诱导性疼痛，角叉菜胶诱导的炎性疼痛等各种疼痛中，右美托 咪啶 都能产生有效的镇痛作用 58 10 材料 1 实验动物 健 康成年 鼠 72 只 (动物生产许可证号 : ） 2009用许可证号： 体重 180兰州大学医学实验动 物中心提供。大鼠饲养于清洁级动物实验中心，环境安静，有良好的通风 ，室温维持在 22湿度约 55%， 12 照明 /12 小时黑暗，自由摄食水，每日更换垫料。 2 主要仪器 维丝 美国 司 辐射仪 成都泰盟科技 有限公司 电子显微镜（ 日本 生物照相显微镜（ 日本 学图像分析处理系统 成都泰盟科技有限公司 3 主要试剂与药品 盐酸右美托 咪啶 注射液（批号： 10122234） 江苏恒瑞医药股份有限公司 抗鼠多克隆抗体 美国 司 抗鼠多克隆抗体 美国 司 疫组化检测试剂盒 北京中杉金桥生物技术有限公司 浓缩型 剂盒 北京中杉金桥生物技术有限公司 多聚甲醛 天津市光复精细化工研究所 2蒸水等 4 主要试剂的配制 冲液 （ 1） 液的配制： 11 A 液 2双蒸水分 溶解定容至1000 B 液 12双蒸水充分溶解定容至 1000 C 液 ： A 液 19 液 81 （ 2） 冲液的配制： 称取 9g 于 1000烧杯中。 取 C 液 500入大烧杯中，搅拌，使 全溶解。 大烧杯中加入双蒸水定容至 900 测 加适量 A 液或 B 液调整溶液至 将溶液倒入容量瓶，定容至 1000分混匀。 %多聚甲醛 （ ， 称取 40g 多聚甲醛，置于三角烧瓶中，加入 500 800 冲液 ,加热至 60，持续搅拌使多聚甲醛充分溶解，滴加少许 1 溶液清亮，最后补足 冲液定容至 1000分混匀，于 4冰箱内保存备用。 12 方法 1 实验动物分组 健康成年雄性 鼠 72 只，体重 180 220 g，采用随机数字表法，分为3 组：假手术组（ S 组）、 慢性神经病理性痛组 （ C 组）和右美托咪啶组（ D 组） ，每组 24 只。 每组大鼠又被随机分为三个亚组： 3d 组、 7d 组和 14d 组，每个亚组 8 只。 于术前 1 d、术后 3、 7、 14 d（ 3） 上午 测定 机械痛阈和热痛阈， 并于 3 时测定 行为学指标 后 每组 随机处死 8 只大鼠， 其中 6 只用于免疫组织化学方法检测脊髓背角 表达，另 2 只用 透射电镜观察脊髓背角浅层神经元超微结构 。 2 实验动物模型制作 （ 1）参照 8的方法制作 坐骨神经慢性压迫损伤模型（ 具体操作如下：大鼠称重后 腹腔注射 10%水合氯醛 350 mg/醉大鼠 ，俯卧位固定， 备皮消毒后纵向切开右下肢股骨中段皮肤，钝性 分离肌肉暴露坐骨神经 主干 ，于 接近分叉处之前的 坐骨神经干 上 用 4 弛 结扎 4 道，结扎强度以引起 后肢 肌肉轻度短暂的颤动为宜，不影响神经外膜的血运为限。 （ 2）假手术组 （ S 组） 仅暴露坐骨神经，不结扎。 （ 3） 术毕伤口局部敷以青霉素粉预防感染，逐层缝合切口 ， 术后 常规笼养 。 （ 4） 所有手术操作均由同一人完成 以保证实验一致性。 3 给药剂量与方法 D 组于 坐骨神经 结扎术毕 开始至 处死前， 腹腔注射 右美托 咪啶 50 g/1次 /d， S 组和 C 组 注射等容量生理盐水 。 4 行为学观察 般情况 在术前 1 天及手术后 2 周内，每 1观察一次，包括大鼠的的步态及术13 侧肢体的姿势，局部皮肤的改变，是否出现悬空，跛行及肌张力的改变，有无舔舐肢体的现象。 痛阈 (测定 参照文献 62介绍的方法， 采用 辐射仪， 将大鼠置于 3 的玻璃板上，热辐射光源照射右后肢足底中部，记录从照射到出现缩足反应的时间，即为热缩爪潜伏期。连续测定 3 次， 每次 间隔 5 次照射时间不超过 20 s，取其平均值。 整个测试过程中保持安静。 械 痛阈 (定 参照文献 63介绍的方法， 将大鼠置于透明玻璃箱中，底部为 1 铁丝网，采用 维丝垂直缓慢用力刺激大鼠右后肢足底部，出现躲避、抬足或舔脚动作为阳性反应，纤维丝弯曲 90无反应则为阴性。 维丝的压力值 为 g，每次至少间隔 30 s。初始刺激强度 g。若出现阴性反应，则选择高一级强度 g；若出现阳性反应，则选择低一级强度 g，依此类推，直至出现可诱发阳性或阴性反应相邻的 2 个刺激强度后，继续依序测定 4 次，采用内推法计算机械痛阈。 5 动物固定及取材 注固定 实验大鼠在术后 3、 7、 14 d 测定痛阈后， 腹腔注射 10%水合氯醛 400 450 mg/醉 ，开胸暴露心脏，由左心室经 升主动脉插管，连接灌注系统，剪开右心房作为灌注液流出口。先快速灌注生理盐水约 300清除机体内的血液，观察流出液颜色，当流出液澄清，大鼠肝脏均匀变白后，即可先快后慢灌注 4%多聚甲醛 约 300 30 分钟。 材 灌注完毕后，随即暴露两侧坐骨神经，逆行追踪暴露与之相连的腰 4腰 5（ 髓节段，取出 髓组织后，每组 6 份标本置于 4%多聚甲醛 中固定用于免疫组化化学实验， 2 份在解剖显微镜下取 右侧脊髓背角，置于 3%戊二醛中固定用于电镜 观察 。 14 6 石蜡切片的制作及免疫组 织化学染色 蜡切片的制作步骤 （ 1）固定 将 髓节段置于 4%多聚甲醛 中固定 24 小时。 （ 2）脱水 组织依次经过梯度乙醇溶液： 75% 80% 90% 95% 100%乙醇 100%乙醇。 （ 3）透明 二甲苯，两次， 30 （ 4）包埋 组织经二甲苯透明后，用冷风稍干后立即投入 54 56液体石蜡。将预先溶好的干净石蜡倒入钢制包埋筐中，后取出浸蜡后的标本，按标记的方向置入蜡溶液中，自然冷却即可。 （ 5）切片 用切片机将标本切为厚度约 3 5 m 的蜡片。 （ 6）贴片烘烤 将蜡片置 于 45 50左右的温水中使其完全伸平，然后捞至在防脱载玻片上，湿润状态下及时进入烤箱烤片。烤箱温度约 40，烤片 1小时。 疫组织化学染色法检测脊髓背角 达 依照 生物素二步免疫组化检测试剂盒说明书进行操作，标本染色步骤如下： （ 1）脱蜡 将烤好的烤片置于二甲苯，二甲苯两次脱蜡，每次 15 （ 2）水化 100%酒精 100%酒精 95%酒精 90%酒精 85%酒精 75%酒精蒸馏水，每级 3 （ 3）置于柠檬酸柠檬酸钠缓冲液（ ） 微波 15，自然冷却，用冲液及蒸馏水冲洗， 33 次。 （ 4） 3%过氧化氢去离子水孵育 10阻断内源性过氧化物酶。之后用冲液冲洗， 33 次。 （ 5）甩干后滴加一抗（ 抗鼠多克隆抗体 ， 工作液浓度前者为 1： 100，后者为 1： 300）， 4孵育 24h。 （ 6）复温 1h， 冲液冲洗， 33 次。 （ 7）滴加山羊抗兔 体 聚体， 37孵育 20 30 （ 8） 冲液冲洗， 33 次。 （ 9） 色 5 10镜下控制染色程度，以特异性染色最强而背景基本不着色为准。蒸馏水冲洗终止显色反应。 （ 10）苏木素复染 1 2馏水冲洗。 （ 11）梯度酒精脱水： 80%酒精 90%酒精 95%酒精 100%酒精 100%酒15 精，每级 3 （ 12）二甲苯，透明，每次 3 （ 13）中性树胶封片。 阴性对照：用 替一抗，其他步骤不变，结果均为阴性。 结果判定：在 学显微镜下 （ 400） 进行观察， 棕黄色染色为阳性， 性表达位于胞浆和包膜， 性表达主要位于细 胞核。采用 像分析处理系统测定 光密度值， 每个标本随机取 3 张切片，每张切片随机选取脊髓背角浅层（ 层） 6 个不同视野，取其平均值，以反映 表达水平。 7 电镜标本的制备 (1). 将 3%戊二醛固定液中的脊髓背角组织块 ，在含 二醛的 二甲砷酸钠缓冲液（ 细切，放入 4%戊二醛固定液固定 2h。 (2). 1%锇酸室温固定 (3). 50%乙醇脱水 30 (4). 70%乙醇脱水 30 (5). 95%乙醇脱水 30 (6). 无水乙醇脱水 30 (7). 氧化丙烯透明 3次，每次 10 (8). 氧化丙烯与 透脊髓组织块。 (9). 新鲜配制的 5h。 (10). 包埋的组织块逐渐加温 (与术前相比， S 组术后 异无统计学意义（ P 与 S 组比较， C 组 和 D 组3 时 短（ 与术前相比， S 组术后 异无统计学意义（ P 与 S 组比较， C 组 和 D 组3 时 低（ P与 C 组 比较， D 组 3 时 高（ P与 比较， C 组 和 D 组 3 时 低（ P与 比较， C 组 和D 组在 高（ P。 见表 2，图 2。 17 表 2 各组大鼠不同时间点机械痛阈的变化（ g, n=8， x s） 组别 1 3 S 组 组 组 S 组 较， 与 C 组比较， 与 比较， 与 比较， 2 脊髓背角 达的变化 与 S 组比较， C 组 、 D 组 3 时脊髓背角 达上调（ P与 C 组 比较， D 组脊髓背角 达下调（ P与 比较， C 组和 D 组 3 时脊髓背角 达上调（ P。见表 3，图 3，图 5。 表 3 各组大鼠不同时间点 达的变化（ n=6， x s） 组别 2 组 组 组 S 组比较， 与 C 组比较， 与 比较， 脊髓背角 达的变化 与 S 组比较， C 组 、 D 组 3 时脊髓背角 达上调（ P与 较， D 组脊髓背角 达上调（ P与 比较， C 组 和 D 组3 时脊髓背角 达上调（ P见表 4，图 4，图 6。 18 表 4 各组大鼠不同时间点 达的变化（ n=6， x s） 组别 2 组 组 组 S 组比较， 与 C 组比较， 与 比较， 透射电镜下大鼠 髓背角神经元超微结构的变化 S 组各时点大鼠 脊髓背角 神经元形态基本接近正常，细胞核呈圆形，表面光滑，偶有单个凹陷，核仁大而圆且位于核中心，核内常染色质明显，核膜及细胞膜光滑完整，核周胞质中粗面内质网、核糖体、线粒体等细胞器形态正常，分布均匀； C 组 神经元发生异常改变，其中 主要以神经元肿胀为主，胞浆内内质网、线粒体等细胞器肿胀甚至裂解，核结构基本正常或见轻度异型，核膜轻微皱缩，染色 质分布均匀或部分浓缩； 3 时神经元改变明显加重，神经元细胞有不同程度的皱缩及变形，胞核固缩，核膜凹凸不平，核仁偏向一边，染色质浓缩，形成不同形状和小小不等的团块聚集于核周边或贴于核膜，符合细胞凋亡表现；与 C 组 比较， D 组神经元形态及结构改变从术后 3 d 时起开始减轻，异型性改变程度较轻，在 核仁改变及染色质的深染与边集明显减轻，细胞凋亡有所减轻 。见图 7图 9。 19 图 1 三组大鼠热痛阈变化曲线 与 S 组比较， 与 C 组 比较， 与 比较， 与 比较， 图 2 三组大鼠机械痛阈变化曲线 与 S 组比较， 与 C 组 比较， 与 比较， 与 比较， 0 图 3 三组大鼠脊髓背角 达的变化 与 S 组比较， 与 C 组比较， 与 比较， 4 三组大鼠脊髓背角 达的变化 与 S 组比较， 与 C 组比较， 与 比较， 1 图 5 三组大鼠 术后 7d 脊髓背角 达的变化 （免疫组织化学染色 100） 22 图 6 三组大鼠 术后 7d 脊髓背角 达的变化 （免疫组织化学染色 100） 23 图 7 S 组 大鼠脊髓背角 神经元 的 超微结构（醋酸铀 10 000） 图 8 C 组 大鼠脊髓背角 神经元 的 超微结构（醋酸铀 10 000） 24 图 9 D 组 大鼠脊髓背角 神经元 的 超微结构（醋酸铀 10 000） 25 讨论 1 坐骨神经慢性压迫性损伤模型 神经病理性疼痛是由神经损伤所引起的，从神经受损到产生疼痛，神经系统经历了一系列复杂 的电，化学变化，伤害性刺激在外周初级感觉神经元经过换能，转变为电信号，经过脊髓，脑干，丘脑的传递和调制，最终在大脑皮层产生痛觉。神经病理性疼痛具有自发性疼痛，痛觉过敏及痛觉超敏的临床特征，给患者从身体到心理带来极大的伤害，因此针对神经病理性疼痛的研究是疼痛领域的热点与难点。在研究神经病理性疼痛的机制之前，建立合适的神经病理性疼痛动物模型是必需的前提。 一般来说，一种神经病理性疼痛模型的建立应具备以下几点要求 64： 保留神经病理性 疼痛的生物学特性；可对神经病理性疼痛相关联的细胞及分子进行研究；具有客观及可量化的指标；可靠性、可重复性、有效性与实用性。本实验采用的是坐骨神经慢性压迫性损伤 (型，其特点是制作相对简单稳定，制备成功的标准较明确，而且相应的痛行为学的检测方法简易可行，动物也很少有伤肢自噬现象。因此该模型是目前国内外慢性疼痛基础研究中最常用的模型之一。此模型最初在 1988 年由 创，当时使用铬制肠线轻度结扎大鼠坐骨神经干，术后动物出现明显的 自发痛，自发抬起受损侧肢体，时而舔足或甩足等一系列自我保护行为。术后 3 5d 动物开始出现痛反应，机械痛敏在 7 14d 达到高峰，持续 2 个月后痛法应表现消失，此后代之以感觉迟钝，实验动物没有出现自噬现象。该模型是首个利用检测机械痛阈和热痛阈来分析痛行为的模型，目前广泛应用于国内外对慢性神经病理性的研究。 大鼠坐骨神经解剖结构清晰，行走路线变异较少，且大鼠后足皮肤表面积的 80%都是由坐骨神经支配，本模型通过轻度机械性结扎坐骨神经干，使粗的有髓鞘纤维选择性损伤，而保留大部分传递痛觉的无髓鞘 C 类纤维。该模型在术后相关 的痛行为方面主要经历了两个阶段： 术后 1 15d，大鼠出现自发痛，热痛敏，冷痛敏和机械异常痛敏 65，在 10 14d 达到峰值；术后 15 30d，所有痛行为表现仍持续存在，但敏感程度较高峰期明显下降。 型 是神经病理性疼痛与炎性疼痛相结合的模型，通过用铬制肠线机械压迫坐 骨神经造成轴突损伤，从而产生异常放电，同时由于铬制肠线其金属质地造成压迫神经的局部炎症反应，从而导致炎症细胞释放炎性介质。因此，虽然该模型因为与人26 体外周神经损伤所导致的慢性神经病理性疼痛的症状和行为表现极为相似，但仍然存在一定的缺点。如铬制肠线对神经结扎的松紧程度取决于实验的操作者，由此所导致的神经纤维的损伤类型和数目都难以控制 66；此外，是否由于铬制肠线所含的化学物质的毒性而导致了神经纤维损伤，也存在一定的争议 67。 为了克服上述缺陷，达到理 想的造模标准，本实验对经典的 型进行了以下改进： 所有实验操作均由一个人操作完成，从而保证实验的一致性 ；用 4线代替铬制肠线进行坐骨神经干结扎，从而避免铬制肠线所含化学物质的毒性作用。 本实验结果显示：大鼠 后出现不同程度的 术侧足趾并拢并轻度外翻 、坡行、舔舐、悬空等痛行为学表现，与 S 组比较，大鼠术后 3时机械痛阈和热痛阈均明显降低，表明大鼠神经病理性痛模型制备成功。 目前，利用 型，从行为学，细胞病理生理学，电生理学以及分子生物学 等方面对神经病理性疼痛展开了一系列广泛的研究，此 模型的应用，为神经病理性疼痛的