当归补血汤煮出汁激活成熟T淋巴细胞胞外信号控制激酶的研究.doc

当归补血汤煮出汁激活成熟T淋巴细胞胞外信号控制激酶的研究摘要: 当归补血汤（DBT）源自紫云英类和当归类植物根部。这种中药煮出物已经被证实能够刺激T淋巴细胞增殖。然而这种激活的机理尚不得而知。在成熟T淋巴细胞中，当归多糖的应用能够显著诱导细胞的增殖，白细胞介素2，4，6的释放以及胞外信号控制激酶（ERK）的磷酸化。对ERK抑制剂的预处理阻止了DBT诱导免疫反应。另外，DBT的多糖富集片段对成熟T淋巴细胞具有显著作用，这表明DBT多糖在控制免疫反应中扮演了重要角色。关键词 当归补血汤，紫云英属植物根部，当归类植物根部，T淋巴细胞，细胞原浆移动，ERK.1 介绍在数以千计的中国传统中草药中当归仅由两种草药构成。公元1247年中国人李东玉在其著作内外伤编获论中第一次记载了当归补血汤。李认为当归补血汤应该包括以下内容：10钱紫云英根，2钱当归。一钱大约相当于3克。在传统中医里，当归补血汤是用来治疗女性更年期综合症的。患者遵医嘱服下当归补血汤（DBT）来提升她们的“气”（生命活力）并促进血液循环。紫云英根作药用已经证实具有增强免疫力，保肝，抗糖尿病，阵痛，祛痰等作用。此外，当归因其能够促进血液循环常用来调节月经不调和改善机体免疫。虽然对这两种草药单一的生化分析早已进行了， 但对DBT中两种草药复合作用机理尚未研究，这无疑阻碍了复合中草药发展成为抗击疾病和机体功能失调有效手段的进程。通过确定DBT中的生化组成，我们得以确定一个最优提取比例，有趣的是，这个比列与古代配方的比例RA：RAS=5：1是一致的。另外，在弄清了DBT中RA类衍生物：毛蕊，芒柄花素，RAS类衍生物：阿魏酸，藁本内酯的数量后，我们得以建立DBT的标准。DBT的免疫管理（“气”功能中的一种）是由这里决定的。之前的研究显示DBT的使用能够刺激T淋巴细胞的扩散，然而对这种刺激起作用的分子尚不得而知。为了揭示这种古老草药煮出汁的作用机理，我们用DBT处理成熟的T淋巴细胞，之后分析了包括白细胞介素IL-2，4，5，6，8，10，13，巨噬细胞群落刺激因子（GM-CSF），伽马干扰素，肿瘤坏死阿尔法因子以及胞外信号控制激酶等10中细胞因子。此外我们还鉴定了DBT多糖的作用以及DBT诱导细胞因子释放的信号通路。2 材料与方法2.1 DBT的制备与标准化我们于2002年收集来自中国陕西省的3年生黄芪植物根部和来自甘肃省的2年生的冬虫夏草根部。将RAS和RA以5：1的比例加入并在涡流中混匀而得到DBT。将混合物与8升水共煮两小时并提取两次。提取的方法遵照古代配方进行，此配方已被证实是最优提取方法。RA与RAS的分离样本也采用同样的提取方法。用70%乙醇处理DBT提取物沉淀可以将DBT多糖分割成富多糖片段和贫多糖片段两部分。在4000个g的离心加速度下离心20min即可将这两种片段分离开来。富集多糖片段占总干重的18%。将这两种片段用冻干法干燥并在-80摄氏度下保存。DBT的标准化通过使用高效液相色谱法（HPLC）分析阿魏酸，毛蕊，芒柄花素以及藁本内酯的含量来完成。分析纯级试剂和HPLC级试剂来自德国达姆施塔特地区（Darmstadt）默克公司（Merck）。一套沃特斯（Waters）HPLC系统包括600台泵，717个自动采样器（auto-sampler），1台紫外可见光电二极管（UV/VIS Photodiode），以及用于全程分析的2996个检测器。色谱分离是用乙腈作为溶剂A以及0.01%磷酸作为溶剂B在DELTA-PAKC柱（粒径为4.7微米，3.9mmx150mm）内并在流速为1.0ml/min的流动相以及室温下进行的。2.2 T淋巴细胞的成熟与增殖试验人类T淋巴细胞来自Ficou-Hypaque捐赠的新鲜健康血液细胞。纯化的t淋巴细胞在RPIM-1640的环境下经过两次清洗再投入密度为100000个每格共有96格的成熟盘。其中有六成的t淋巴细胞是为了做XTT试验的标准曲线而进行培养的。成熟的t淋巴细胞分别用DBT,RA,RAS,RA与RAS的混合物以及植物凝血素（PHA）处理3天。用25微升注射器将混合的XTT溶液注入每个方格中，在含空气95%和二氧化碳5%的饱和水溶液下经过四小时培养使其成熟。在450纳米条件下测量其吸光率。细胞数量由标准曲线决定。在阻碍试验分能够析中，MEK抑制剂U0126用二甲基亚砜溶解并于其他药物加入前3小时加入。用TPA作为ERK激活剂。2.3 细胞素抗体试验与ELISA成熟t淋巴细胞不同细胞分泌物的检测由镭射生物（Ray Biotech）完成。简要来说，抗体对对抗不同的细胞活素后会在人造的细胞活素试验器具上留下斑点。用DBT处理t淋巴细胞3天。在试验过程中持续加入100ul的条件培养液两小时以测量细胞活素的分泌量。再加入共轭生物素基本抗体一小时使用GenePix professional 4200A扫描可知碎片在555nm的光波下被激活并发散出565nm的光波。使用GenePix Pro 5.0软件分析成像，并按照之前试验校准的标准曲线为细胞活素定量。t淋巴细胞分泌的IL2,IL6,IL10的量在稍后使用电子生物科学仪ELISA kit测出。再将t淋巴细胞用DBT处理3天。用100微升注射器收集每个方格中的条件培养液，按照协议IL2,IL6,IL10的数量测定由ELISA得制造商测定。最终经校核后可知盘中物质吸光率为450nm。2.4 ERK1,2磷酸化的测定 用DBT对成熟t淋巴细胞各自处理0，10，20，30，45，60min。为了分析抑制剂的作用，在加入药剂前先让所有成熟t淋巴细胞的血清“挨饿”3小时。在药物处理结束后立即将细胞投入细胞溶解缓冲仪（125ml Tris-HCL,2%SDS,10%甘油，PH6.8），其中的蛋白质使用SDS-PAGE法进行分析。在4摄氏度的条件下用抗ERK12磷酸化抗体和ERK12抗体处理12小时即可识别出已磷酸化的ERK12,免疫复合物用ECL法分析。蛋白质的含量通常利用美国伯乐工具盒采用布拉德福方法进行测定。统计数据由版本1的PREMER程序实现：基本变量和控制变量的差异按学生t测试的结果进行划分：P0.05较显著,P0.01显著,P0.005非常显著。3 结果3.1 DBT校准通过发现两种化学标记（毛蕊异黄酮和芒柄花）在RA的数量和另外两种化学标记（阿魏酸和藁本）在RAS的数量，我们能够使最优的DBT标准化。标准化的DBT应当是：每1克干DBT包含0.186毫克毛蕊，0.155毫克异黄酮，0.351毫克阿魏酸和0.204毫克藁，这符合我们先前的校准5,7。从提取效率的计算，我们发现DBT的产量在这个重量比为32 3（n=5）。这些参数为其余生化实验确定化学标准和最佳DBT的混合物。3.2 DBT促使T淋巴细胞再生为了揭示DBT可能具有的免疫调节功能，将DBT、RA、RAS和RA + RAS的液态提取物（先各自煮沸，然后按5:1的比例混合在一起）培养应用到人类T淋巴细胞，促使细胞增殖。各组都显示对T细胞的增殖有明显的刺激效应（如图1）。不同的草本精华有着不同的剂量要求。在剂量为0.1毫克/毫升，DBT的显示出最大效应，而且效果明显高于其他组。提取物浓度更高时就不会显著促进细胞的再生，这显示了饱和效应。 相比之下，增加RA+ RAS混合液（先各自煮沸），对T淋巴细胞增殖的促进作用则小得多。图1:从RA,RAS以及DBT中提取物对T淋巴细胞的成熟作用.将不同剂量的DBT,RA,RAS或者RA+RAS加入待成熟的T淋巴细胞处理3天.以PHA为正面控制.用百分数的形式表示细胞的增殖并与没有加入上述物质的细胞做比较.3.3 DBT促进T淋巴细胞的细胞活素生成运用来自于DBT、RA、RAS和RA + RAS的液态提取物，可以在3天之内创造出成熟的T淋巴细胞。药物催生的T淋巴细胞释放细胞活素（IL - 2和IL - 4和IL - 5和IL - 6和IL - 8和IL - 10和IL - 13，GM - CSF的，干扰素- c和肿瘤坏死因子- a的药物），是由细胞活素抗体排列所决定的。通过比较受控制的成熟细胞可以看出，IL - 2，IL - 6和IL - 8和IL - 10的释放量明显受到DBT的影响（如图2A）。在四种细胞活素当中，IL-2，IL - 6和IL - 10的显示出相对DBT的特殊性，即不受RA，RAS或RA+RAS的诱导，因此它们被选来作进一步分析。DBT的处理会引起IL-2的释放量增加至3倍，IL - 6的释放量增加至120倍和IL - 10的释放量增加至20倍。有趣的是，用RA，RAS或一个简单的RA和RAS混合物进行处理，并不能改变的细胞活素的释放量，这表明将两种草本提取物煮沸是必不可少的环节。IL - 4和IL - 5和IL - 13，GM - CSF，干扰素- c和TNF - a的水平不受DBT，RA，RAS和RA+RAS处理的影响。IL - 2，IL - 6和IL - 10的释放量用酶联免疫吸附测定法分析进行量化。图2B和C显示经DBT的处理后细胞活素的释放量的剂量反应曲线。3种细胞因子的反应相当类似，即都是在浓度为0.1mg/ml DBT时，诱导产生的释放量最高；IL-2的最大诱导生成量为4倍，IL-6为20倍，而IL-10为8倍。通过对细胞活素排列分析结果进行比较，可以发现，酶联免疫吸附测定法分析的结果显示了一个较低的数值，它能利用两种不同的检测系统的敏感性进行计数。图2 A:向细胞因子阵列中加入条件培养液检测含量不同的细胞因子. B,C:采用ELISA法对条件培养液进行检测得到的细胞因子数量(白细胞介素IL-2,IL-6及IL-10).3.4 DBT诱导ERK磷酸化 ERK是有丝分裂原激活蛋白激酶（MAP）的一员，它在T淋巴细胞增殖过程中发挥着关键信号的作用，ERK的激活决定于产生DBT的细胞。通过对磷酸化过的ERK和其他所有ERK使用抗体特效药，我们揭示了在成熟T淋巴细胞中ERK1（44 kDa）和ERK2（42 kDa）的磷酸化过程：DBT的应用能使这两种磷酸化作用增强（如图3A和B）。DBT应用30分钟之后，ERK的磷酸化量最大，为先前的10倍，但对ERK的激活是短暂的，处理60分钟后就会完全回到活性较低的水平。TPA，作为一个对照量被使用，能诱导ERK1 / 2的磷酸化过程更加持续，这比DBT更可靠。DBT诱导的ERK在30分钟时将被先前处理的成熟细胞完全阻断（如图3C和D）。 为了进一步探讨DBT的免疫调节作用是否与ERK1 / 2的磷酸化有关，我们对在U0126处理之前用DBT处理过的T淋巴细胞中的细胞活素释放量进行测试。DBT诱导的T淋巴细胞增殖过程完全被U0126阻断（如图4）。与此同时，由DBT诱导，IL - 2，IL - 6和IL - 10的释放也被U0126预处理所阻断（如图4）。这些结果有力地证明，MEK抑制剂的预处理作用可以充分制止DBT对T淋巴细胞的免疫调节作用，这显示了ERK在调解DBT的免疫反应的关键作用。图3: DBT诱导ERK磷酸化 A在加入BT之前先让T淋巴细胞处于血清饥饿状态3小时。用特制抗体使全部的以及被磷酸化了的ERK1/2都释放出来。使用TPA作为正面控制。B用密度标定法确定由A中所得的磷酸的数量。C磷酸法测定经过A处理后的成熟T淋巴细胞的数量，二甲基亚砜作为对照。D用密度标定法确定由C所得的磷酸的量。图4：DBT的诱导免疫调节作用是借助ERK1 / 2完成的。T淋巴细胞在处理前预装了缓冲处理（0.1二甲基亚砜）或者是U0126，之后用DBT处理它3天。用XTT法检测T淋巴细胞的增殖，用ELISA法测定细胞因子数，如图3那样。3.5 DBT的多糖是免疫的催化剂 为了确定DBT的内中触发上述免疫活性的活性成分，取两小部分：多糖丰富（18干重）和多糖耗尽（干重的82）。多糖丰富的一小部分，当应用到成熟T淋巴细胞时，其免疫激活作用表现出明显的增加。在浓度为50 毫克/毫升的多糖丰富的一小部分里，细胞增殖受刺激增加逾50，比多糖较少的部分高出5倍（如图5A）。与此同时，富含多糖的部分在刺激细胞活素释放方面显示了更高的激活效应。在浓度为50 毫克/毫升的多糖丰富的一小部分里，释放出的IL-2，IL-6和IL-10分别增加了4倍，20倍和6倍，分别为（如图5B-D）。相比之下，多糖少的部分只能轻微诱导细胞活素释放。 通过应用多糖丰富的部分，成熟T淋巴细胞中的ERK1（44 kDa）和ERK2（42 kDa）的磷酸化程度均提高了（图6A和B）。类比DBT的作用，在使用DBT多糖丰富部分30分钟之后，ERK磷酸化量为最大诱导量的12倍。DBT多糖的作用也完全被用U0126预处理过的成熟细胞阻隔（如图6C和D）。相比之下，多糖少的部分则没有在ERK的磷酸化过程中显示激活（图6A和B）。DBT的信号通道类似于其多糖，并指导多糖在触发免疫反应中所发挥的作用。图5：DBT多糖诱导T淋巴细胞增殖以及细胞因子的释放。T淋巴细胞分别用富含多糖和不富含多糖的片段处理3天。A：用百分数表示的细胞增殖图，富含与不富含的比较。B-D：用ELISA法测定的在条件培养液内的细胞因子的释放图。图6：DBT多糖诱导T淋巴细胞中ERK的磷酸化。将T淋巴细胞分别用富含多糖片段和不富含多糖片段处理3天。A：用特定的抗体使总的和被磷酸化的ERK2/1被释放。用TPA作为正面控制。B用密度标定法确定由A中释放的磷酸化的量。C用磷酸法测定A中除之前用U0126预处理过3小时之外的所有成熟T淋巴细胞。D用密度标定法确定C中的磷酸量。4 讨论 DBT，一个古老的中药煎剂配方，其RA和RAS的重量比为5:1，相比RA或RAS或RA + RAS的提取物（分开煮沸然后按5:1混合在一起），DBT在刺激成熟T淋巴细胞方面效果要好得多。与这种功能相仿，细胞活素排列分析揭示了由于受DBT刺激，一组特定细胞活素包括IL-2，IL-6和IL-10正被成熟的T淋巴细胞释放出来；细胞活素的释放不是单单由RA或者RAS，抑或是RA+RAS触发的。此外，成熟T淋巴细胞中RA+RAS的刺激作用不够，说明把这两种草药放在一起沸腾是必不可少的;当然，这种DBT的制备方法长期以来一直为中医师所推崇。除了T淋巴细胞的效用，正确的RA、RAS重量比也已在乳腺癌，巨噬细胞和成骨细胞中被证明发挥着作用。 为什么DBT需要两种药草在5:1的比例下一起煮沸？DBT的发明者，李东垣，金代、元代（从1115至1368年）四大著名中医之一，写下的规定，也许这是他临床运用经验的积累。中医药的理论框架是五行：金，木，水，火，土。五行代表了我们的身体各器官并且互相协作以保持身体的平衡。李东垣坚信身体的强壮与脾和气有关；而这两者又与免疫功能相关。根据易经（古代中国的哲学书）的记载，地球代表五这个数字。因此，李认为，当RA和RAS按5:1配比时，DBT应该会对更年期的益气养血有最好的效果。 两种可能的假设可以解释DBT这种独特的生化功能。首先，DBT的可能含有新的化学物质或者相比纯RA或RAS提取物更大数量的活性成分，RA和RAS在一起煮沸可能提高了新化学物质的溶解度，并且新化学物质只溶于DBT。这些额外的化学物质可以解释DBT的特殊效用。另一