（分析化学专业论文）整体柱的制备及在色谱分析中的应用.pdf

论文题目：整体柱的制备及在色谱分析中的应用 专业：分析化学 硕士生：朱桃玉 指导老师：马志玲副教授 摘要 整体柱( m o n o l i t h i cc o l u m n ) 是在柱管内原位聚合或固定化具有多孔结构的连 续整体高聚物材料，然后根据需要对整体高聚物材料的表面作相应的衍生化处 理，获得用于分离分析或分离富集的整体色谱柱。与目前商品化的色谱柱相比， 整体柱具有制备方法简单、通透性好、柱前压低、活性位点利用率高、峰容量高 等优点，是近几年来发展的一种极具应用潜力的新型色谱柱。因此开展整体柱制 备、表征方法及应用的研究具有十分重要的理论意义和应用价值。 本文共分为三章，主要的研究内容和方法如下： 第一章 本章回顾了整体柱的发展历史，概述了其与传统色谱柱比较的优缺点，重点 介绍了高效液相色谱整体柱以及毛细管电色谱整体柱的制备，以及整体柱材料的 的性能评价及表征等，综述了整体柱在液相色谱以及毛细管电色谱中的应用，并 阐述了本课题的研究背景和立题意义。 第二章 本章报道了以甲基丙烯酸缩水甘油f l 目( g l y c i d y lm e t h a c r y l a t e ，g m a ) 为单体、 二甲基丙烯酸乙烯酯( e t h y l e n ed i m e t h a c r y l a t e ，e d m a ) 为交联剂，环己醇 ( c y c l o h e x a n o l ，c y o h ) 和正十二醇( d o d e c a n o l ，d o o h ) 的混合液为致孔剂，在 偶氮二异丁腈( a z o b i s i s o b u t r y o n i t r i l e ，a i b n ) 的引发下制备了4 6 m m i d 5 0 m m 和4 6 m m i d 1 5 m m 整体柱，然后在该整体柱基质表面固载牛血清白蛋白 f b o v i n es e r u ma l b u m i n ，b s a ) ，成功制备了高效亲和色谱整体柱，并分别应用于 组氨酸对映体的分离及l 型色氨酸的在线快速萃取，萃取率达到9 8 。同时探 讨了整体柱基质的聚合条件：单体以及致孔剂用量、聚合温度等，以及固载蛋白 过程中各因素：不同的固载方法、反应温度、时间以及蛋白浓度等对整体柱性能 的影响。 第三章 本章报道了以g m a 为单体，e d m a 为交联剂，环己醇和十二醇的混合液为 致孑l 剂，在a i b n 的引发下制备了毛细管电色谱整体柱( 1 0 0 p , mi d ) ，并在其表 面固载b s a ，然后应用于毛细管电泳分离组氨酸对映体。同时还探讨了单体用 量、致孔剂用量对毛细管整体柱孔结构及其渗透性能的影响。 关键词：整体柱，亲和液相色谱，毛细管电色谱，快速萃取，手性分离 i i t i t l e ：t h ep r e p a r a t i o na n da p p l i c a t i o ni nc h r o m a t o g r a p h y o fm o n o l i t h i c m a j o r ：a n a l y t i c a lc h e m i s t r y n a m e ：z h ut a o y u s u p e r v i s o r ：a s s o c i a t ep r o f e s s o rm az h i l i n g a b s t r a c t am o n o l i t h i cs t a t i o n a r yp h a s ei st h ec o n t i n u o u su n i t a r yp o r o u ss t r u c t u r e p r e p a r e db yi ns i t up o l y m e r i z a t i o no rc o n s o l i d a t i o ni n s i d et h ec o l u m nt u b i n g a n d i fn e c e s s a r y , t h es u r f a c ei sf u n c t i o n a l i z e dt oc o n v e r ti ti n t oas o r b e n tw i t h t h ed e s i r e dc h r o m a t o g r a p h i cb i n d i n gp r o p e r t i e s m o n o l i t h i cs t a t i o n a r yp h a s e s h a v ea t t r a c t e dc o n s i d e r a b l ea t t e n t i o ni nl i q u i dc h r o m a t o g r a p h ya n dc a p i l l a r y e l e c t r o c h r o m a t o g r a p h y i nr e c e n t y e a r s d u et ot h e i r s i m p l ep r e p a r a t i o n p r o c e d u r e ，u n i q u ep r o p e r t i e sa n de x c e l l e n tp e r f o r m a n c ea n ds oo n ，e s p e c i a l l y f o rs e p a r a t i o no f b i o p o l y m e r s s o ，i ti sp r a c t i c a la n dc o n d u c t i v et oh a v eas t u d y o nt h ep r e p a r a t i o n ，c h a r a c t e r i z a t i o na n da p p l i c a t i o no f m o n o l i t h s t h i sp a p e ri n c l u d e st h r e ec h a p t e r s ，t h ef o l l o w i n ga r em a j o rc o n t e n t sa n d m e t h o d s c h a p t e r1 t h i sc h a p t e rr e t r o s p e c t e dt h ed e v e l o p i n gh i s t o r yo fm o n o l i t h i c ，a n d s u m m a r i z e di t sa d v a n t a g e sa n dd i s a d v a n t a g e s t h ep r e p a r a t i o no fm o n o l i t h i c u s i n g i n h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) a n dc a p i l l a r y e l e c t r o c h r o m a t o g r a p h y ( c e c ) w a s i n t r o d u c e di nd e t a i l ，a n dh o wt o c h a r a c t e r i z et h em o n o l i t h i cw a sa l s oi n t r o d u c e d i na d d i t i o n ，t h ea p p l i c a t i o n so f m o n o l i t h i ci nh p l ca n dc e cw e r ep r e s e n t e d ，a n dt h eb a c k g r o u n da n d i m p o r t a n c eo f t h i sp r o j e c tw e r ea l s os h o w e d 1 1 1 c h a p t e r 2 t h i sw o r kp r e p a r e dh i g hp e r f o r m a n c ea f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y ( h p a c ) m o n o l i t h so f4 6 m m i d 5 0 m ma n d4 6 m m i d 15 m m c o n t a i n i n gg l y c i d y l m e t h i a c r y l a t e ( g m a ) a sm o n o m e r , e t h y l e n ed i m e t h a c r y l a t e ( e d m a ) a sl i n k i n g r e a g e n t ，t h em i x t u r eo fc y c l o h e x a n o l ( c y o h ) a n dd o d e c a n o ( d o o h ) a sp o r o g e n ， a z o - b i s - i s o b u t r y o n i t r i l e ( a i b n ) a st h ei n i t i a t o r , a n da p p l i e dt h e mt os e p a r a t i o n o fh i s t i d i n ea n du l t r a f a s to n - l i n ee x t r a c t i o no f l - t r y p t o p h a n ，w i t h 9 8 e x t r a c t i o no fl t r y p t o p h a nw a sa c h i e v e d i n a d d i t i o n ，t h ep o l y m e r i z a t i o n c o n d i t i o n si n c l u d i n gm o n o m e ra n dp o r o g e nc o m p o s i t i o n ，t h et e m p e r a t u r ea n d s oo na n dt h ei m m o b i l i z a t i o nc o n d i t i o n si n c l u d i n gt h ec o u p l i n gt e m p e r a t u r e ， p r o t e i nc o n c e n t r a t i o na n ds oo nw e r ea l s oe v a l u a t e d c h a p t e r3 c e cm o n o l i t h sr 1 0 0 i r t mi d ) b a s e do nac o p o l y m e ro fg m aa n de d m a w e r ed e v e l o p e df o rs e p a r a t i o no fd ，l - h i s t i d i n e b o v i n es e r u ma l b u m i n ( b s a ) w a su s e da sm o d e ll i g a n d sf o rt h i sw o r k t h em o n o m e ra n d p o r o g e n c o m p o s i t i o n u s e d d u r i n gp o l y m e r i z a t i o n s h o w e d s i g n i f i c a n t e f f e c t so n m o n o l i t hm o r p h o l o g y , a n dt h ee f f e c t sw e r ed i s c u s s e di nt h i sw o r k k e y w o r d s ：m o n o l i t h i c ，a f f i n i t yl i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ， c e c ，u l t r a f a s t e x t r a c t i o n ，c h i r a ls e p a r a t i o n i v 中山大学硕士学位论文 第一章绪论 色谱整体柱( m o n o l i t h i cc o l u m n ) 是在柱管内原位聚合或固定化具有多孔结构 的连续整体高聚物材料，然后根据需要对整体高聚物材料的表面作相应的衍生化 处理，获得用于分离分析或分离富集的整体色谱柱。自1 9 6 7 年k u b i n 掣l l 首次尝 试用聚2 一羟乙基甲基丙烯酸酯凝胶制备分离蛋白质的低压排阻色谱柱，到1 9 8 9 年 h i 6 m n 将制备的聚丙烯酰胺整体柱应用于分析物的分离 2 1 至今，色谱整体柱作为 一种新型的色谱柱迅速发展起来。 1 1色谱整体柱的性质 对于传统的色谱填充柱，人们为了提高柱效而使用越来越小的填料。而对于 高效液相色谱而言，随着填料粒径的减小，柱前压则急剧上升。虽然制各1 2 “m 填料的方法已经非常成熟，但由于高效液相色谱柱前压的限制，使其实际应用受 到限制。目前，高效液相色谱最广泛使用的色谱填料仍为3 5 1 j m 的填料。毛细 管电色谱( c a p i l l a r ye l e c t r o c h r o m a t o g r a p h yc e c ) 的驱动力是电渗流，其不存在高 效液相色谱柱前压的问题，但柱子填充和封口制作却十分繁琐，现有的大多数毛 细管封口技术往往会导致毛细管内产生气泡从而增大基线噪声、甚至发生电流中 断等问题。开管柱毛细管电色谱( o p e n t u b u l a rc a p i l l a r ye l e c t r o c h r o m a t o g r a p h y o t c e c ) 使用在毛细管管壁涂布或键合的固定相，虽然可以解决封口问题，但 其柱容量低、检测困难，限制了它的发展。 整体柱又称整体固定相( m o n o l i t h i cs t a t i o n a r yp h a s e ) 、棒柱( r o dc o l u m n ) 、 连续床( c o n t i n u o u sb e d ) 等 3 1 。色谱整体柱的孑l 隙由高聚物颗粒中的孔隙和颗粒间 的缝隙组成，通过控制聚合条件可以获得具有理想孔径分布的色谱整体柱。由于 其孔隙分布合理，比表面积大，在高效液相色谱使用过程中具有通透性好、柱前 压低及活性位点利用率高等优点，当被分离样品流经色谱整体柱时，可以减少涡 流扩散和纵向扩散 4 1 ，提高柱效；同时可以大大减少分析时间。整体毛细管色谱 柱应用于c e c ，无需对毛细管进行封口处理，克服了由于封口技术不佳导致的一 系列问题。将整体毛细管色谱柱应用于o t c e c ，大大提高了柱容量，解决了由于 样品的进样量小导致的检测困难问题，同时提高了色谱柱的峰容量，使复杂样品 中山大学硕士学位论文 的分离分析成为可能。 另外，整体色谱柱可以原位制备，省去制备填料和装柱等步骤，也可以同法 制成聚合物颗粒后再装柱1 5 1 ；多孔高聚物易于制各，柱子的长度和直径在一定程 度上不受限制；聚合反应混合物中的单体可以灵活选择以得到不同性质的整体柱 基质；易于在多孔的聚合物表面作相应的衍生化处理，以获得不同类型的整体色 谱柱【6 _ 7 】。通常可以根据多孔高聚物表面的化学性质，对溶剂和溶质的保留、孔 隙率、孔径分布和硬度等指标评价作为分离介质的多孔高聚物。 1 2色谱整体柱的制备方法 目前色谱整体柱按照多孔高聚物材料主要分为两大类，即无机整体柱和有机 聚合物整体柱。前者主要是将硅氧化物直接烧结在柱内或者用溶胶一凝胶法在柱 中反应获得，后者则是由有机聚合物单体在柱管内原位聚合而得。这两类色谱整 体柱都可应用于高效液相色谱和毛细管电色谱。 1 2 1 高效液相色谱中整体柱的制备 无机整体柱和有机聚合整体柱都可应用于高效液相色谱。目前无机整体柱主 要是以硅胶作为基质的硅胶整体柱，根据其制备方法的不同又可以分为溶胶一凝 胶硅胶整体柱和以填充柱为基础的硅胶整体柱两类。有机聚合物整体柱通过选择 不同的聚合单体获得不同种类的多孔高聚物，多孔的聚合物表面作相应的衍生化 处理，以获得不同类型的有机聚合物整体色谱柱。 1 2 1 1 无机整体柱 液相色谱中传统的填充柱常使用硅胶作为填充基质，锆、钛、铝的氧化物使 用较少钔。近十几年发展起来的无机整体柱通常利用有机硅化合物，如四甲氧基 硅烷和四乙氧基硅烷，在醋酸水溶液中水解，随后在致孔剂( 如聚乙二醇) 存在下 制得具有大孔结构的硅胶整体柱。 硅胶整体柱是以硅胶为基质的无机整体柱，具有理想的机械强度，比表面积 大，适合分离小分子混合物1 9 ，在孔结构方面表现出明显优势，具有大孔和中孔 结构，孔隙率 8 0 【1 0 】。其缺点是抗溶剂性能差，适用的p h 范围较小。根据制 2 中山大学硕士学位论文 备方法的不同，硅胶整体柱又分为溶胶一凝胶整体柱和以填充柱为基础的硅胶整 体柱。 1 2 1 1 1 溶胶凝胶整体柱 溶胶凝胶整体柱是以烷氧基硅烷为主要原料，在催化剂、致孔剂存在下， 通过水解、缩聚反应实现溶胶凝胶化而形成的具有x 2 t l 结构的整体床层，通过改 变反应物配比，控制整体床层的大孔和中孔孔径。随着溶胶一凝胶技术的不断成 熟【l l - 1 2 】及超纯a l c o x y s i l i c a 制备技术的建立【1 3 _ 14 1 ，溶胶凝胶整体柱的研究也得到 相应的发展。 m i n a k u c h i 掣1 5 1 首先将溶胶一凝胶法应用于硅胶整体柱的制备，其步骤是：四 甲氧基硅烷在酸性或碱性条件下水解( 有机酸水解或有机碱水解) ；水解的硅四 面体结合形成s i 一0 - s i 键；经过高温老化( 一般不小于6 0 0 。c ) ，使聚合反应完全、 骨架坚硬。利用溶胶一凝胶法制备硅胶整体柱的难点是多孔整体聚合材料在聚合 过程中会收缩1 6 】。因此，在制作过程中，通常首先在模具中先制得的整体硅胶 聚合材料，然后截成适当长度装至聚四氟乙烯的柱管中。为了保证柱子准直，通 常柱内径小于1 0 n u n ，柱长不超过1 5 c m ，而聚四氟乙烯包裹的硅胶整体柱可以耐 受高达12 0k g c m 2 的压力。 整体硅胶材料和整体有机材料一样，可通过化学修饰或改变原料( 使用不同 性质的聚合单体) 获得不同用途的整体柱。整体硅胶基质表面的硅羟基是化学修 饰的靶点。m i n a k u c h i 掣1 5 】用十八烷基二甲基( ，n - - - 乙基胺基) 硅烷与硅羟基 反应得到用于反相高效液相的c j 8 整体硅柱。m c c a l l e y 1 7 1 比较了传统的填充柱与 m e r c k 公司反相整体硅胶柱分离中性和碱性化合物的情况。实验表明，高流速分 离中性样品时，整体柱的理论塔板高度小于5 岬填料填充的色谱柱；在酸性及室 温下，高流速分离弱碱性和强碱性样品时，理论塔板高度仍低于填充柱，但拖尾 明显； m a s s o l i n 等1 8 采用m e r c k 公司的整体硅胶氨基柱，以，j r 一二琥珀酰亚胺碳 酸酯为连接臂，制备了青霉素g 一酰基转移酶的酶反应器，并用它研究了2 芳氧基 脂肪酸甲酯及其类似物的在线酶催化不对称反应和分离。 溶胶一凝胶硅胶整体柱的研究主要集中在避免干燥老化过程中的开裂及对碱 性溶质的非特异性吸附等问题，寻找最佳的制备条件提高柱效，延长使用寿命。 中山大学硕士学位论文 硅胶整体柱制成连续床层在干燥和老化过程中易开裂，严重影响柱效，并且制备 过程较为复杂；以硅胶作为基质的硅胶整体柱在分离极性溶质，特别是碱性溶质 过程中，会与溶质产生强非特异性吸附作用，影响分离度；另外，其还会导致生 物大分子变性、失活；整体柱的化学稳定性相对较差。造成上述不良结果的主要 原因是源于硅胶中所含的杂质金属离子，以及在化学修饰或键合时因位阻等原因 而导致的在硅胶表面上残存的或新生的硅羟基，针对这一问题展开的研究也较 多。根据两性金属氧化物可以减弱碱性化合物与色谱柱内壁的作用力，研究者将 焦点集中在两性金属氧化物( 如二氧化钛、二氧化锆等) 包覆硅胶整体柱上【1 9 - 2 1 】， 以期解决碱性化合物分离过程中的拖尾问题，s h i z - g 等用二氧化锆包覆硅胶整体 柱然后用磷酸盐和十八烷基磷酸修饰，在c e c 模式下成功分离了对二氨基联苯 的碱性化合物。马小东掣2 2 1 通过研究温度、p h 等对凝胶化过程的影响，确定了 最佳制备参数，采用改进的溶胶一凝胶工艺，在一定程度上解决了溶胶凝胶整体 柱残留硅羟基的问题。 作为有机聚合物整体柱的补充，硅胶整体柱在小分子物质分离方面的应用前 景更加广阔。 1 2 111以填充柱为基础的硅胶整体柱 以填充柱为基础的硅胶整体柱是先将填料填充到柱管中，再通过其他技术 如：溶胶一凝胶技术、聚合技术或高温烧结形成整体柱。 m a r i a t 1 2 3 】等将十八烷基硅烷( 0 d s ) 微粒加入溶胶溶液中超声形成悬浮液， 使溶胶凝胶化和o d s 固定化一步完成，由于o d s 微粒存在于连续床层中，所以 大大减少因内部压力差异而引起的柱裂缝，但方法的不足使得o d s 微粒在整体 柱内的均匀分布变的困难。 t a n gq i n g l i n t 2 4 等首次应用超临界c 0 2 将以硅胶为基质的o d s 微球填充到毛 细管柱中，然后经溶胶一凝胶化，所得整体柱的大孔硅胶之问及其与毛细管柱内 壁的交联状况良好，并在c e c 模式下发现硫脲的传质阻力大大减小，其认为是 硅胶基质中的小孔和毛细管柱的填充空隙被硅溶胶部分填充所致。 c h i r i c a 等【2 5 1 通过有机基质截留固定反相填料制备整体柱，首先填充填料然 后注入聚合混合物经聚合反应固定填料，可以得到柱效较高的整体柱。 以填充柱为基础的整体硅胶柱在机械强度和稳定性方面得到改善，但由于增 4 中山大学硕士学位论文 加了填充过程，使整体色谱柱的制备变得复杂，而且在制备过程中键合固定相会 受到较大的影响，尤其是高温烧结可能会破坏键合固定相，这需要进行二次键合， 使制各过程更加复杂。 1 2 1 2有机聚合物整体柱 有机聚合物整体柱的制备是将单体混合物及致孔剂注入到柱管中，经热、紫 外光或y 一射线引发使单体混合物在柱管内聚合，然后用合适的溶剂除去柱体内的 致孔剂和残留的单体。在聚合混合物中加入特定的单体或在聚合后进行化学修饰 可以改善色谱柱的选择性。 这类整体柱与硅胶整体柱相比，具有选材广泛、p h 应用范围宽以及制备简 单等优势，因而近几年得到迅速发展。 聚合物整体柱根据材料和功能分类，主要包括分子e 1 i g 整体柱、聚甲基丙烯 酸酯类和聚苯乙烯类整体柱和聚丙烯酰胺类整体柱等。 1 2 1 2 1 分子印迹整体柱( m o l e c u l a r l yi m p r i n t e dp o l y m e r sm o n o l i t h ，m i p m ) 分子印迹技术是一种使所得聚合物的作用点对目标分析物具有预定识别选 择性的聚合物制备技术。 闰伟英口6 1 等以4 氨基吡啶为印迹分子原位合成整体柱。他们的研究表明有 机添加剂的含量对印迹聚合物的印迹识别能力影响很大，甚至能改变混合物的流 出顺序。 为了提高柱效和柱选择性，邹汉法【2 7 1 等选择极性相对较低的甲苯和十二醇 混合物作为复合致孔剂，单步制备了辛可宁印迹手性整体柱。等度洗脱中非对映 异构体辛可宁与辛可尼丁的色谱峰较宽，在梯度洗脱中得到大大的改善。同时他 们发现升高温度可以提高分离因子。h u a n g x i a o d o n g 等阻2 9 1 通过采用不同柱长的 整体柱分离非对映性和对映性混合物，发现柱长对分离因子没有明显的影响，这 说明可以使用更短的整体柱完成分离，短的色谱整体柱可以有效地降低柱前压， 增大流动相的流速，实现快速分离分析。 z h a n g m i n l i a n 3o 】等以苯乙烯、甲基丙烯酸缩水甘油酯、甲基丙烯酸为单体， 二乙烯基苯、三丙烯异氰尿酸酯为交联剂，异神经酰胺i i i 为模板分子通过原位聚 合制各了分子印记整体柱，发现以神经酰胺为模板分子制备的整体柱孔径更 中山大学硕士学位论文 小，对模板分子的分离性能更好，但柱前压有所升高。 分子印迹整体柱对单体的要求是能提供共价键或非共价键。目前研究的单体 种类比较单一，多数采用甲基丙烯酸，进一步的研究有望在开发新型聚合单体、 寻找更合适的交联剂、致孔剂以及探索更加合理的聚合条件等方面开展。 1 2 1 2 2聚丙烯酸酯类整体柱 聚丙烯酸酯类整体柱主要以甲基丙烯酸酯、2 丙烯酰胺2 甲基丙烷1 一磺酸、 甲基丙烯酸缩水甘油酯( g l y c i a y lm e t h a c r y l a t e ，g m a ) 为单体，乙二醇二甲基丙烯 酸酯( e t h y l e n ed i m e t h a c r y l a t e ，e d m a ) 、亚甲基双甲基丙烯酸酯为交联剂，1 丙 醇、1 ，4 丁二醇、甲醇、环己醇、壬醇等一种或多种混和醇溶液为致孑l 剂 3 1 - 3 4 】。 在聚合过程中所加致孔剂的种类和比例以及反应单体的种类和比例对整体 柱的性能有很大影响，多数研究都是在固定的反应单体比例下进行。p a v e lc 等【3 5 】 考察不加a m p s 时，不同比例的甲基丙烯酸丁酯和e d m a 以及不同比例单体混 合物和致孔剂下整体柱的性能，并找出了最佳条件。 c o u f a l p 等【36 】分别用自由基引发和热引发两种方法制备了聚甲基丙烯酸酯 类整体柱，并得出两种方法制备的整体柱在选择性和柱效方面相当，但通过自由 基弓1 发聚合反应制备是在常温下进行，所以制备更简单易行。 部分聚丙烯酸酯类整体柱表面具有环氧结构，可以进一步修饰使具有不同的 选择性，而且可以在p h 2 1 2 范围内使用，扩大了应用范围。例如，以甲基丙烯酸 缩水甘油酯为单体的聚合物易于引入离子基团而制备离子交换色谱柱，并且衍生 化试剂的选择范围也可大大扩展。目前，有关这一体系的报道主要涉及利用氨基 化合物( 如乙二胺 3 7 - 3 8 】、肽口9 1 ，甚至是蛋白质【删) 与环氧基团反应，或者在酸性 条件下环氧开环成为二醇等。聚甲基丙烯酸缩水甘油酯一亚乙基二甲基丙烯酸酯 的体系研究最早是s v e c 等【3 7 l 报道的，该体系的典型制备方法是：单体( 甲基丙烯 酸缩水甘油酯：亚甲基二甲基丙烯酸酯= 6 0 ：4 0f v ，v ) 与致孔剂环己醇：十二 醇= 9 0 ：1 0 ( v ) 以4 0 ：6 0 ( v v ) 混合后，加入引发齐e j ( a z o b i s i s o b u t r y o n i t r i l e a i b n ) ，通氮除氧后注入不锈钢柱，在5 5 聚合1 2 h 。反应完成后，将柱子接到 h p l c 泵上，在4 5 用t h f 将聚合物中的残余试剂洗出。利用聚合物中的环氧基 团，采用两种衍化方式：( 1 ) 泵入0 5 m o l m l h 2 s 0 4 ，水浴6 0 反应3 h ，这样得到 含二醇官能团的多孔聚合物；( 2 ) 注入2 m l - - - 7 胺，加热反应，得到含卜( ，n 一 6 中山大学硕士学位论文 二乙基胺) 一2 一羟基丙基官能团的离子交换色谱柱可分离蛋白。在胺化制备的3 根柱中，5 5 。c 下反应3 h ，聚合物的氮含量最高为1 2 6 m m o v g ；5 5 。c 下反应l h ， 氮含量是0 6 7 m m o v g , 2 0 。c t 反应5 5 h 氮含量只有0 2 7 m m o l g 。整体柱中活性基 团含量高，被分离物质的保留时间长，对于离子交换类色谱整体柱而言，需要用 离子强度更大的流动相才能实现完全分离；整体柱中活性基团含量过少，分离效 率变差；只有整体柱中活性基团含量适当，使用离子强度相对较小的流动相就可 达到良好的分离。整体材料如果发生溶胀，不会影响材料的外观尺寸但会降低孔 径，使柱前压升高。 s v e c 等【3 9 通过测定苯和聚苯乙烯的保留时间分别为o 6 3 和0 6 0 m i n 且峰形很 锐，说明柱子中没有明显的分子排阻现象并且几乎不含小孔。利用所得的弱阴离 子交换色谱柱可以分离蛋白质，聚脱氧腺苷酸( 1 2 1 8 个重复单位) 和聚胸腺嘧啶 核苷酸( 1 2 2 4 个重复单位) 4 1 】。h a h n 掣3 9 1 先用十肽与g m a 反应，再将产物作为 单体之一与甲基丙烯酸缩水甘油酯和亚乙基二甲基丙烯酸共聚，制得亲和色谱整 体柱。 罗权舟等【4 0 1 将蛋白质a 用两种方式连到聚合物上：( 1 ) 将制好的基质分别与 己二胺、戊二醛反应，再与蛋白质a 反应得到含有1 1 个碳原子隔臂的蛋a a 高效亲 和色谱柱；( 2 ) 将制好的基质直接水解，再用新配的高碘酸钠氧化，最后与蛋白a 作用制得不含隔臂的蛋a a 高效亲和色谱柱。实验证明聚合物基质的疏水作用很 弱，无隔臂柱子的非特异性吸附很低。连接隔臂有一定的非特异性吸附，在流动 相中加入1 5 的乙腈后可以消除疏水作用的影响。合成的蛋a a 高效亲和色谱柱 的稳定性良好，使用半年后性能基本未发生改变。卫引茂等【4 2 1 提高g m a e d m a 的比值( 7 5 2 5 ) ，用乙二胺打开环氧基团后再接上氯乙酸，得到弱阳离子交换柱。 1 2 1 2 3聚苯乙烯类整体柱 聚苯乙烯类整体柱以二乙烯基苯为交联剂，单体有苯乙烯、对氯甲基苯乙 烯等，以偶氮二异丁腈为引发剂，甲醇、乙醇、丙醇、甲苯等为致孔剂。 聚苯乙烯体系用于离子交换树脂的制备已经发展得相当成熟，优点是硬度高 且性质稳定。聚苯乙烯一二乙烯基苯整体柱多用于分离蛋白质或核酸( 单链和双 链) 。f r 6 c h e t 等m 郴1 利用所制的聚苯乙烯整体柱研究了柱上沉淀一再溶色谱 ( o n c o l u m np r e c i p i t a t i o n r e d i s s o l u t i o nc h r o m a t o g r a p h y ) ，并分离了苯乙烯的寡聚 中山大学硕士学位论文 物和高聚物。 制备聚苯乙烯整体柱的方法是h 6 】：单体( 苯乙烯：二乙烯基苯= 5 0 ：5 0 ( v v ) ) 与致孔剂( 癸醇) 按4 0 ：6 0 配比，加入1 f w w ) a i b n ，通氮气除氧后， 将混合物注入不锈钢柱子，聚合反应在7 0 * ( 2 下反应2 4 h 。然后，除去塞子，将柱 子接至f l h p l c 泵上，多孔聚合物中的致孔剂和可溶性物质被四氢呋喃洗出。他们使 用了苯乙烯基乙酸酐( s t y r e n ea c e t i ca n h y d r i d e ) 替代苯乙烯：将二乙烯基苯、 苯乙烯基乙酸酐及新型引发剂2 , 2 ，5 一t r i m e t h y l 一3 一( 1 一p h e n y l e t h o x y ) - 4 一p h e n y l 3 - a z a h e x a n e 和致孑l 剂( 高级脂肪醇和甲苯的混合物) 混合均匀并脱气，注入柱管 后油浴下聚合。反应结束后立即用冰水浴冷却，用四氢呋喃冲洗2 4 h 后在6 0 下 真空干燥。另外他们还讨论了反应动力学、孔性状和致孔剂的影响。f r 6 c h e t 等通 过实验比较了聚苯乙烯整体柱与聚苯乙烯填充柱的差异。在分离结果相当的情况 下，整体柱的柱前压低，流速一柱压的线性范围约为填充柱的1 0 倍；提高流速， 整体柱的分离效果不会变差。 由于聚苯乙烯固定相由s p 3 碳连接的苯环构成，这种构象具有理想的疏水性， 可以直接用于反相色谱，经不同功能单体化学修饰的聚苯乙烯整体柱可以扩大其 应用范围，因此聚苯乙烯整体柱有很好的发展前景。 1 2 1 2 4聚丙烯酰胺类整体柱 目前对聚丙烯酰胺类整体柱的研究相对较少，采用的功能单体主要有丙烯酰 胺、n 异丙稀酰胺、甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酸酯、哌嗪双丙稀酰胺和亚甲基双 丙烯酰胺。当前研究主要集中于在有机相中制各丙烯酰胺整体柱。 聚丙烯酰胺体系是典型的水相聚合体系，也有在有机相聚合的报道。其特 点是：单体易溶于水，有良好的生物兼容性，适合分离生物大分子；柱中的凝胶 颗粒上虽然没有孔来增加传质，但其直径小，表面粗糙，所以表面积大，结合位 点多；凝胶颗粒间靠共价键结合，流动阻力小；可通过压紧柱子降低孔隙体积来 提高分离效果；分离效果往往随流速的提高而提高，表明因e d d y 扩散造成的区带 展宽减小了。h j e r t 6 n 等1 4 7 。4 8 1 最先利用这一体系制备整体柱。制备聚丙烯酰胺整体 柱时，交联剂的比例较高，还要加入硫酸铵以促使相分离，产生供流动相流过的 流通孔。 1 9 9 4 年，h j e r t 6 n 等 4 9 1 对聚丙烯酰胺整体柱中流通孔的性质受聚合反应条件 中山大学硕士学位论文 的影响进行了研究。以甲基丙烯酰胺为单体，哌嗪二丙烯酰胺为交联剂，以硫酸 铵作为致孔剂在磷酸钾缓冲液( p h = 7 o ) 中聚合。聚合引发剂为过硫酸铵，加速 剂为，一四甲基乙二胺。实验显示，温度、缓冲溶液种类、引发剂和 加速剂的浓度，及致孔剂的量影响孔径的分布。研究发现，单体总浓度高于3 5 ( m v ) 时整体柱就开始丧失其机械强度，并导致流动相有极高的流动阻力。通过降 低引发剂和加速剂( 如过硫酸铵s n n ，mn7 ，n 四甲基乙二胺) 的浓度来增加聚 合物的链长，可以部分克服这个不足。致孔剂硫酸铵在单体混合物中的作用是通 过增加生成的聚合物链之间的疏水相互作用而在凝胶基质中形成流通孔，增加其 浓度可以进一步降低流动阻力。 水相聚合的聚丙烯酰胺质地软，且孔径分布范围较大。高流速的冲沈可以 将柱子压紧( 柱的最终长度大约只有原来的1 1 0 1 1 5 ) ，从而提高机械强度，减 小孔径分布，提高柱效。聚合物溶液中加入丙烯酸可以得到阳离子交换色谱柱； 加入n _ 烯丙基二甲基胺可以得到阴离子交换柱，3 5 m m 长的阴离子交换柱可以在 l o m i n 内分离5 种蛋白质，并且分离效果不受流速的影响。细内径阴离子交换柱 ( 7 0 m m 0 3 m m i d ) 在3 0 m i n l 勾能完全分离肌红蛋白、核糖核酸酶a 、卵白蛋白、a 一 糜蛋白酶原a 、r - 藻红蛋白5 种蛋白质；加入丙烯酸丁酯则可得到疏水相互作用 色谱( h y d r o p h o b i ci n t e r a c t i o nc h r o m a t o g r a p h yh i c ) 柱。 f r 6 c h e t 等将单体( 丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺) 溶解于二甲亚砜和醇的 混合物中，无须压柱即可一步制得坚硬的整体材料。当然，水溶性的过硫酸铵必 须用油溶性的自由基引发剂偶氮二异丁腈( a i b n ) 代替。作者在5 0 。c 条件下，将 丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺溶于二甲基亚砜( d i m e t h y ls u l p h o x i d e ，d m s o ) 与醇的 混合物中，除氧后加入a i b n ，在6 0 水浴中反应2 4 h ，聚合产物干燥后利用压汞 法测定孔径。实验证明孔径在1 0 0 0 n m 左右可以得到合适的流速，同时柱压较低。 控制聚合条件，如交联剂及致孔剂的比例、致孔剂的组成、反应速度( 由反应温 度和引发剂的浓度决定) ，可以得到理想的孑l 径。二甲亚砜对丙烯酯胺和甲叉双 丙烯酰胺具有良好溶解性，实验中选其作为致孔剂之一。致孔剂的另一个组分则 要求有长烷基链来促进相分离。致孑l 剂的组成和各成分的比例决定了单体可能的 浓度和相分离的时间。致孔剂中，用聚丙三醇时得到大于1 2 0 0 n m 的孑l ，其中甲 叉双丙烯酰胺的比例为3 0 时得到最大的孔径。 中山大学硕士学位论文 与无机整体材料相比，有机整体材料可以一步制得，但聚合过程中整体材料 存在纵向收缩，即在柱头或柱尾产生空隙。这个问题可以通过向聚合混合物中加 入已聚合好的微粒，或进行二次聚合来解决。在使用过程中，有机整体材料可能 会随着流动相的改换而发生可逆的溶胀和收缩，从而改变柱压；聚合温度提高、 反应时间延长以及减少致孔剂的用量都可以提高聚合物的机械强度；使用短而粗 的柱子也可以减少压力的负面影响。无机材料整体柱的制备较为繁琐，周期较长； 聚合过程中整体材料是横向收缩，通常在模具里制成后再装到管套中；与有机相 整体柱相比，整体硅胶柱的物理、化学性质稳定，在使用过程中流动相的选择范 围广，硅骨架的硬度高，不会出现使用过程中柱子被压缩的现象。 1 2 2整体柱在毛细管电色谱中的制各 毛细管电色谱( c a p i l l a r ye l e c t r o c h r o m a t o g r a p h y ，c e c ) 柱一直是发展微柱分离 技术的关键环节。根据固定相的形态，毛细管电色谱柱一般可分为填充柱、开管 柱和连续床层柱( 整体柱) 三类。毛细管电色谱填充柱的制作过程比较繁琐，色谱 柱两端封口的制作特别困难，而且缺乏重复性。此外封口容易引起气泡的产生， 使基线噪声增大、甚至造成电流中断等问题。c e c 开管柱在一定程度上解决了 封口问题，但存在容量低、检测难度大等缺点，难以得到广泛应用。整体柱具有 无需制作塞子、通透性好、柱内空间利用率高等优点，有着巨大的潜在应用价值。 到目前为止，已有大量的文献报道有关毛细管整体柱，大致可以归纳为聚合 物整体柱和粒子固定整体柱两类。大孔径聚合物整体柱的制各和之前阐述的液相 色谱整体柱类似。单体被注入毛细管中并原位聚合成棒状结构，同时必须引入电 荷基团结合在聚合物表面以产生电渗流。因此，在毛细管整体柱的制备中，注入 混合物及聚合过程是与常规的液相色谱整体柱有一定区别的。聚合物整体柱在制 备时需浇注等附加程序，而这附加程序是为了将聚合物紧紧地结合在毛细管内壁 上，这些附加过程在常规液相中是不需要的。因而，液相色谱整体柱制备中的经 验方法不能直接用于毛细管电色谱中整体柱的制备，我们必须分清两者之间的差 别。第二类毛细管电色谱整体柱，粒子固定整体柱，只应用于毛细管电色谱中。 大量研究采用各种不同的方法将传统的填充材料注入到毛细管中，通过原位聚合 形成连续的整体柱。 1 0 中山大学硕士学位论文 1 2 2 1聚合物毛细管整体柱 聚合物整体柱包括有机聚合物整体柱和无机聚合物整体柱，无机聚合物整体 柱一般指硅胶聚合整体柱。有机聚合毛细管整体柱主要集中于聚丙稀酰胺类、聚 甲基丙烯酸酯类和聚苯乙烯类这三种。无论哪种聚合物，聚合的过程都是大致相 同的。图1 1 阐述了有机聚合物毛细管整体柱的整个制备过程。制备过程主要包 括三个部分：毛细管内表面的前处理、毛细管内大孔径整体柱基质的制备和基质 的修饰。基质的制备以及修饰和液相色谱过程大致相同，但从图1 - 1 可以看出毛 细管整体柱和液相整体柱的制备还存在着很多不同之处。空毛细管的前处理、凝 胶部分填充、电荷基团的交联等在毛细管整体柱的制备过程中都是必要过程，而 在液相整体柱的制备过程中却是不需要的。 聚合完成后，必须除去整体柱中未反应的致孔剂和其它物质。这个过程可以 通过机械泵( 如液相泵) 来完成。用高压泵来冲洗整体柱的一个缺点是一些软的 整体柱基质会受到损坏，同时因为过高的压力也会给长毛细管整体柱的处理带来 困难，过强的背压甚至会损坏刚硬的整体柱基质。因而，软或过长的整体柱基质 用这种方法制备是不理想的。此外，冲洗过程也可以通过c e c 中的电渗流来完成， 聚合完成后把毛细管两端插在缓冲溶液中，在两端加一定的电压冲洗一段时间 后，亲匣应的单体、交联剂、引发剂或者催化剂就可以通过e o f 或者电泳除去。 当电流稳定后，毛细管整体柱就可开始用于化合物的分离分析。 整体柱基质制各完成后，基质表面可根据实际需要进行修饰。与高效液相色 谱( h i 曲p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ，l c ) 一样，可直接把色谱分离中所 需要的官能团，如疏水基团键合到基质表面。此外，也可交联带电基团以产生 e o f 。 e r i c s o n 等5 川通过这三个步骤制各了毛细管电色谱整体柱。首先聚合而成了 刚性基质，然后键合上右旋糖苷硫酸盐，最后c 1 8 共价交联到连续柱床上。其他 一些作者也报道了采取两个步骤合成c e c 整体毛细管柱。而更多个步骤合成整体 柱则过于消耗时间，同时也难以控制整个过程。在实际操作中，基质的制备以及 修饰可一步完成，将两种功能单体，其中一种用作色谱分离，另一种用作带电基 团的交联，和制备整体柱基质的功能单体混合，然后注入到毛细管中通过原位聚 合即可得到毛细管整体柱。 中山大学硕士学位论文 无机大孔聚合物整体柱主要是硅胶基质整体柱，一般通过溶胶凝胶方法来 制备。该过程与有机聚合物整体柱的制备过程类似。c e c 硅胶基质整体柱的制 备，首先需对毛细管进行预处理，这是制备整体柱中非常关键的一步。石英毛细 管内壁通过氢氧化钠、盐酸处理后，硅羟基被暴露出来，可进一步与整体柱基质 形成稳定的s i o s i 共价键连接，使基质紧密附着于管壁上。硅胶整体床层在毛细 管内制备完成后，可以直接作为色谱固定相，或通过衍生化的方法在孔表面键合 上不同的官能团，以实现不同的分离模式，满足样品对选择性和分离效率的需要。 目前，利用s o l g e l