（园林植物与观赏园艺专业论文）大百合组织培养植株再生技术研究.pdf

摘要 本试验以大百合( c a r d i o c r i n u mg i g a n t e u m ) 的鳞片为外植体材料进行组织培养植株再生 技术研究，通过正交设计、全面组合设计，结合方差分析、新复极差分析、多重比较等统 计方法，确定植株再生的可能途径以及适宜的培养条件，以期获得有关大百合组织培养的 一套完整技术体系。结果表明： 1 大百合鳞片的组织培养，以3 月份取材最好，外植体污染率低，愈伤组织形成率高， 有利于大百合的快速繁殖；鳞茎中层下部鳞片污染率低，诱导启动和分化能力强，是最佳 的外植体材料。 2 初代培养：培养基m s + b a 2 0 m g l + k t l 0 m g l + n a a 0 1 m g l + i b a 0 3 m g l 的效果较 好，诱导率最高可达到8 5 9 6 ，能够获得分化能力强的小鳞茎芽。 3 继代培养：以m s + b a l 5 m g l + n a a 0 3 m g l 为增殖培养基最好，增殖系数6 2 1 ，大 于2 c m 芽分化率可达5 4 8 0 ；培养时间对小鳞茎芽的增殖与分化也有显著影响，3 0 3 5 d 继 代1 次有利于芽苗的生长，增殖系数高；继代次数也是重要影响因素，继代8 代以内为好。 4 生根培养：最佳生根培养基为1 2 m s + i b a 2 0 r a g l + 活性炭0 1 ，生根率达9 6 8 7 ， 平均根数7 2 条，平均根长5 8 c m ，粗壮，植株生长健康。 5 大百合试管苗的各部位均可诱导分化出小鳞茎芽，以鳞茎盘的诱导率最高，达 9 2 7 4 ，其次是鳞片和叶片，诱导率最低的是根段：小鳞茎芽叶片的分化能力也是鳞茎盘 鳞片 叶片 根段。 6 炼苗移栽：大百合组培苗移栽以1 5 锯末+ 1 5 珍珠岩+ 3 5 腐殖土的基质为最好，移栽 成活率最高，可达8 0 ；不同季节对试管苗进行移栽，以春季4 p 份移栽成活率最高，为 8 3 7 2 。 关键词：大百合鳞片组织培养植株再生 s t u d i e so nt e c h n i q u eo ft i s s u ec u l t u r ea n dp l a n tr e g e n e r a t i o ni n c a r d i o c r i n u mg i g a n t e u m l u y a n ( d i r e c t e db yp 唾w a n gy o n g - q i n g & p r o f z h u a n gp i n g ) 墨o l l e g eo f f o r e s t r ya n dh o r t i c u l t u r e ，s i c h u a na g r i c u | t u r a lu n i v e r s i t y , y a 黼，s i c h u a n , 6 2 5 0 1 4 ) a b s t r a c t i nv i e wo fs t u d y i n gt h ep m b a b t ew a yo ft h ee x p l a n tr e g e n e r a t i o na n ds u i t a b l ec o n d i t i o no f c u l t u r ef o rt i s s u ec u l t u r ea n dr a p i dp r o p a g a t i o ni nc a r d i o c r i n u m g i g a n t e u m ，8s e r i e so f e x p e r i m e n t sw e r ee s t a b l i s h e di nw h i c ht h es c a l e sw e r ee m p l o y e d 。b ym e a n so fo r t h o g o n a l e x p e r i m e n td e s i g n ，a n a l y s i so f v a r i a n c ea n dm u l t i p l ec o m p a r i s o n s ，m o s tf a v o r a b l ec o n d i t i o n sf o r p l a n tr e g e n e r a t i o nw e r ef o u n di n c l u d i n gb a s i cm e d i a , c o n c e n t r a t i o n sa n dt y p e so f 窭a n lg r o w t h r e g u i a t o r sa n dt h ed o s a g eo f a c t i v a t e dc h a r c o a l 1 套er e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： ( 1 ) a si n o c u l a t i o ne x p l a n t ，t h em i d d l es c a l e so fc a r d i o e r i n u mg i g a n t e u mw e r eb e t t e rt h a n o t h e rp a r t so ft h es c a l e s ，i nw h i c ht h ep l a n tc e l l sd i v i d e da n df o r m e dt h ec a l l u sm o r ee a s i l y , e x p l a n t si s o l a t e d i nm a r c ha n ds e p t e m b e rh a dh i g h e rc a l l u sf o r m a t i o nr a t ea n dl o w e r c o n t a m i n m i o nr a t e 2 ) p r i m a r yc u l t u r e ：m s + b a 2 。0 m g l + k t l 0 m l - v ：n a a 0 1 m g l + i b a 0 3 m g r lw a st h e b e s ti n i t i a t i o nm e d i u mi nw h i c ht h er a t eo fi n i t i a t i o nw a s8 5 。9 6 ，a n dl a r g en u m b e r so f b u d s c o u l db ed i f f e r e n t i a t e d + ( 3 ) s u b c u l t u r e ：t h eb e s ts u b c u l t u r em e d i u mw a sm s + b a l 。5 m g l + n a a 0 3m g l 。w h e r e t h es u b c u l m r c dp l a n t l e t sg r e ww e l la n da f t e r3 0 - - 3 5d a y so f s u b c u l t u r e ，t h em u l t i p l i c a t i o nr a t e w a s6 ，2 t ；t h ed i f f e r e n t i a t i o nr a t eo ft h es h o o t sl o n g e rt h a n2 e r aw a s5 4 ，8 0 。s u b c u l t u r e g e n e r m i o nh a de f f e c to np r o p a g a t i o na n dd i f f e r e n t i a t i o no fs h o o 毽a n di th a db e r e tn o te x c e e d t h ee i g h t hg e n e r a t i o n ( 4 ) r o o t i n gc u l t u r e ：1 2m s + i b a 2 + 0 m g l 。十a c 0 1 w a st h eb e s tr o o t i n gm e d i u m ，i nw h i c h t h em o t h gr a t ew a s9 6 + s 溉，t h en u m b e ro f r o o t sw a s7 , 2 ，蛙站a v e r a g et e r e t ho f r c 咚tw a ss g e m ； t h er o o t e ds e e d l i n g sg r e wv e r yw e l t 鹭s h o o t sc o u l db er e g e n e r a t e df r o mv 赫o u sp a r t so fp l a n t l e t , b u tt h eb u l bb a s a lp l a t e 槲 h i g h e rt h a no t h e rp a r t sa n dt h ei n i t i a t i o nr a t ew a s9 2 7 4 箍 t r n l a n f i n g ：t r a n s p l a n t i n gs u b s t r a t ew i t h1 1 5 s a v l u s t , l l s p e r l i t e ，a n d3 1 5 h u m u sw a s t h eb e s t , w h e r et h es u r v i v a lr a t ec o u l dr e a c h8 0 a n di t sb e s tt ot r a n s p l a n tt h ep t a n t l e t si n s p r i n g ，i nw h i c ht h es u r v i v a lr a t ec o u l d b e8 3 ，7 2 。 薮e 萝w o r d s ：c a r d i o c r i n u m 垂g a n t e u n 堇；s c a l e ；t i s s u ec u l t u r e ；p l a n tr e g e n e r a t i o n 论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的成果。 尽我爱酝，除了文中特裂热以蠡注彝致落戆缝方外，学位论文中不锈含其稳令人袋集蒋曩 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它教育机构的学位或证书 掰凌瘸过静毒孝辩。与我一丽工释熬同志对本研究掰骰熬任褥嚣献筠巴在论文中俸了明确豹 说明并表示了谢意。 研究生签名：v 惫丰毛 口r 年月 7 嗣 关于论文使用授权的声明 本人完垒了解瑟埘农韭夫学有关绦餐、使麓学位论文的瓶定，即：学梭有权僚留并潮 网家有关部门绒机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和媸阗，可以采用影印、 缩印或乎i 描等簸制手段保存、汇编学位论文。同意西j | 农业大学可以用不嗣方式在不同媒 体上发表、传播学位论文的全部或部分魔蜜。 骚变嶷签名： 冯孛色 导；攀签名 a 蒯 艿年6 胃7 嚣 魄引彳昂 四川农业大学硕士学位论文 1 前言 百合花( l i l y ) ，简称百合，清香晶莹、气质高雅、寓意美好，自古就受到人们的喜 爱和赞颂。欧洲的许多国家视百合为纯洁、光明、自由和幸福的象征，是圣母玛利亚的表 象。在中国，百合与中国文化有着不解之缘，是中国传统的十大名花之一i ij ，观赏、食用 和药用百合的栽培历史在中国非常悠久。百合具有很高的观赏价值和经济价值，不论是切 花还是盆花品种，在国内外市场上均占有极其重要的地位，是目前国际上十分受欢迎的名 贵花卉 “。 百合( l i l i u m ) 在植物分类学上属于单子叶植物中的百合科( l i l i a c e a e ) 植物，为多年生 球根花卉，原产于北半球的温带和寒带地区，少数产于南半球的寒带及热带。在我国，百 合主要分布在东南、西南、华南、华东及川、滇、甘肃、陕西、山西、河南等地的高山峡 谷之中，而栽培品种则遍及全国各地。百合作为园艺植物的最初记载是在1 6 2 9 年，古代所 记载和应用的百合多为野生种。1 9 世纪末，欧美一些国家从我国和日本引入栽培种，百合 才开始盛行全球范围内大规模的栽培p 】。第二次世界大战后，美国、新西兰、澳大利亚等 国家在百合的栽培技术、品种改良等方面都有显著的发展，新的园艺品种和远缘杂交种层 出不穷。中国是百合属植物的自然分布中心，对世界百合种质资源和优良品种选育贡献巨 大。全世界百合属植物约有9 4 个种，起源于我国的有4 7 个种、1 8 个变种，占世界百合属植 物的一半，其中3 6 个种、1 5 个变种为我国特有种。按英国皇家园艺学会( r h s ) 和北美百 合协会( n a l s ) 对百合栽培品种的分类方法，8 类栽培杂种系中有4 类利用了原产中国的 种质资源【4 】。百合种类多，自然分布广，花型花色各异，杂交新品种不断涌现。另外，还 有许多观赏价值较高的野生百合仍然生长在深山密林中未被人们发现，有待于我们继续发 掘利用，培育出更多具观赏价值的优良品种。 吾合传统的繁殖方式主蒙是分淋( 小鳞茎) 繁殖，然而一椿健壮的百合谯良好的栽培 条 牛下，逶誊每年只自霉到l 3 个燮薮鳞蒸，繁骧系数援低，露要长期豹藿羚繁殖爨造成 病毒积累，种球退化严重，影响百食的生长和观赏价值。虽然有些百合品种可用鳞片扦插 繁殖【5 硼，僵扦插后的鳞片容易腐烂，所馥并不常篇。大多数静切花百台都为杂交品种，由 予杂磅腥与胚乳的不寒秘，杂砖殛翳发生晕款黢寅【8 l ，帮锼繁胬出势予，套瞧繁殪矮代也 会出现性状分离，丧失原品种所具有的独特观赏价值，并且播种苗生商周期较长，很难满 四川农业大学硕士学位论文 足生产上的需要【”。因此，在百合的引种栽培、优良品种快速繁殖、脱毒复壮以及新品种 的选育方面，组织培养都是很有用的方法，不但大大提高了产量和品质，还降低了成本， 具有显著的经济效益】。 大百合( c a r d i o c r i n u mg i g a n t e u m ) ，又名水百合，是百合科大百合属( c a r d i o c r i n u m ) 特 别耐寒的种，因其植株的巨大性，显著区别于百合属植物而得名旧。1 8 2 4 年，d r ，w a l l i c h 在尼泊尔的谢奥波伦( s h e o p o r e ) 首先发现大百合这种植物，并命名为l i l i u mg i g a n t e u m 。随 后，h o o k e r 在1 8 5 2 年英国植物杂志上对该种作了详细的植物学性状描述。b a r o nh u g e l 在喜 马拉雅地区印度的旁遮尔( p e e lp u n j a l ) 、克什米尔等地也发现了此种大百合。大百合植株粗 壮挺拔，花朵洁白硕大，美丽芳香，栽植群体的观赏效果极为壮观，在欧洲首次亮相就引 起轰动，获得了“百合王子”的美誉”】。鉴于大百合与百合属植物的诸多不同，e l w e “1 8 7 7 ) 和m a k i n o ( 1 9 1 3 ) 均将此种l i l i u m 属中划分出，定名c a r d i o c r i n u mg i g a n t e u m 。我国植物 志第十四卷已确定此名 1 钔。大百合属植物全球仅有3 种，我国产2 种，分别是大百合和乔麦 叶大百合( c a r d i o c r i n u mc a t h a y a n u m ) 。然而长期以来，这种极具观赏价值的野生花卉，却一 直未受到世人的重视。近几年来，经过引种驯化和人工栽培，已成为一种优良的观赏栽培 植物 1 ”。有鉴于此，进行大百合离体培养快速繁殖技术的研究，探索通过组织培养方法加 快大百合的繁殖速度和提高繁殖系数，对保护这一珍贵的野生花卉的种质资源以及在园林 绿化中大规模的推广应用具有重要意义。 2 文献综述 2 1 大百合的生物学特性及观赏价值 大疆台主簧分布予喜马撞雅出酝，在我国分布广泛，资源十分丰富。我鞠的酲川、云 南、贵州、湖鼹、湖北、陕程、山鼹等中低t h e 、海拔较寒的褰绿阕时转、攀绿落时蠲叶 混交林年日针阔混交林带都有铝的踪迹，主簧生长在士壤疏松、月段沃阴激的林下、灌从旁或 国满溪流两牟。大百合耐寒褴强，毒温凉、潮漫、多云雾的气候，要求微酸髓至中靛雨富 食奄枕腰、深熙、裁 水良好熬土壤。大百念对光照条 串要求较懿，忌强光童魅，强光下镶 株生长不良，叶片枯蒸，花朵变小溅畸形，植株袅过早地进入休眠期，大大降低了观赏效 聚。通鬻，丈褥台的熬个生筏羯都努颓豫诞蠢充麓的永矜采l 雹瓣供应。炎熟的夏季羹，茏 其要注意增加空气湿度，降低气温耜土温，以促避花朵繁茂和毅鳞茎的更耨生长。 四j i l 农业大学硕士学位论文 大百合植株高约3 米，茎粗壮直立，圆筒状，绿色，中上部带有紫红色。鳞茎卵圆形， 直径可达1 2 厘米以上，贮藏丰富的营养。叶片互生，宽大呈心形，长2 5 3 0 厘米，宽2 0 2 5 厘米；基部叶片宽卵圆形，茎生叶向上渐小，靠近花序的几片为船形；网状脉。总状花序 有花6 - - 2 0 朵；花狭喇叭形，白色，形似铁炮百合，花筒带绿色，花被片略外卷，内面带紫 色或紫红色条纹。花期5 7 月。果实卵球形，好象一颓颗绿色的宝石嵌在花茎的顶端。大 百合观赏价值很高，既可盆栽摆设于高雅之堂，观赏其独特的风姿；亦可单株或几株点缀 于花坛、花境中自成园林一景，或群植形成宏大的园林场景，烘托出热闹的节庆气氛。大 百合的花茎粗壮，硬度大，不失为一种鲜切花的好材料，大型花序如果用于大型花篮的制 作，也非常壮观【l ”。总之，大百合健美挺拔、气宇轩昂的风姿，是一般种类的百合无法与 之相媲美的，应该把具有“百合王子”美誉的大百合作为中国百合庭院栽培的首选物种，为 园林绿化增添一道新的亮丽风景线。 2 2国内外百合组织培养研究筒史 吾会凝繁弯技术鹣搽索最睾舞鲶予2 0 毽鳃5 0 年l 弋。1 9 5 0 年，d o b r e a u x 等人簧浚鼹缝自 百合( 上i l i u mc a n d i d u m ) 的花蕾成功地诱导出小鳞茎。髓后，r o b b ( 1 9 5 7 年) 成功地进行了2 个 种百合鳞片的培养并发表了百合鳞片组织培养的文章。8 0 年代初，国外学者t a k a y a m a 【l “”】 窝i v a n o v a 螬啪营经黠嚣舍的缝织臻葵侮过多年豹连续擐遂。滋a 9 0 每谯嚣，t o s h i k a z u m a t s u m o t o 2 ”、n i i m i t 2 2 1 、i g n a te v ai p t 2 3 1 等继续对百合迸彳亍离体快速繁殖研究。国内8 0 年代开始对百合进行研究，我国学者杨乃博o ”、煲济明伫”、王攀秫闭、谷祝平1 、李耿光 【麟、汪蠢良馨越等较晕逡开震了吾金魏壤织培莽工终，残殛避霉燮爨大耋酶小攮撩，莠芷零 她开了藐，为百合组织培养研究奠定了基础。此错，百合的组织培养继续深入发展，据不 完全统计，已培养成功的百合的种殿杂种约有3 0 - - 4 0 种。新培育出的杂交种还猩不断增多。 总之，露台缓织培养接术在生产上懿疲爱，馒吾台绶裁内实瑷了蹩产住、工厂健与亵鑫纯。 目前，百合已成为继世界五大切施( 月季、番猫竹、菊花、唐菖蒲、非洲菊) 之后的 一支新秀，是近年来豳际上最畅销的花卉种类之一。如：百合谯犄兰的球根类花卉生产中 名捌第2 像，簿禳总瑟捩约4 0 0 0 h m 2 ，年产百合鳞蒸1 8 亿个，7 0 娃上供是日【3 。羲藿近年 来百合的生产和消费墩逐步增长，播韩国1 9 9 3 年统计，从荷兰避口的百合鳞熬菇约3 8 1 0 万 个，合1 9 7 万美元，生产的百合主要出口日本，切拢百合生产是韩国花卉生产中效益最好 四川农业大学硕士学位论文 的一种。相比之下，中国百合切花生产发展的晚一些。虽然上海、北京、辽宁、云南等地 区有一定的栽培规模，但产量少，主要供应本地区和国内市场，而且栽培技术、切花质量 和保鲜技术方面与国外相比均存在较大的差距。由于百合的切花品种具有引人注目的颜色 和形态，同时还具有抗病性、耐插性和高产性，商业价值大，因此，国外大多数学者进行 组织培养研究的主要对象是切花百合类。1 9 8 2 年s t i m a r t 等【3 】 报道麝香百合鳞片的组织培 养：1 9 9 5 年，j o u n gh y a n gy o u n g 等口2 】研究不同的外植体、植物生长调节剂、以及培养环境 对“卡萨布兰一t ( c a s a b l a n c a ) ”鳞片组织培养的影响。在国内，学者们除了对切花百合进行研 究外，药用百合和食用百合的研究也比较多。温春秀等f 3 3 】研究了新铁炮百合的离体快速繁 殖；罗丽萍等【3 4 】报道了龙牙百合的组织培养技术；刘芬等对兰州百合花丝组培诱导完整 植株进行研究。此外，利用组培技术对百合进行新品种的选育也有很多研究。y o s h i t o a s a n o 3 6 】应用胚培养获得1 1 个新的百合杂交种；k e i i e k io k a z a k i 等【3 7 1 采用改良培养基进行胚 培养获得东方百合和亚洲百合的杂交种；我国的黄济明f 3 8 1 采用胚离体培养获得一定数量的 麝香百合1 0 n g l i f l o r u m ) 玫红百合a m o e n u m ) ，王百合( lr e g a l e ) 攻红百合杂种胚，有 效地aj e t a 缘杂交的不育性。d o n g ，s h e n gh a r t 掣堋以亚洲百合品种( c 口 p c f f c 甜柚神为 材料，通过花药培养获得单倍体愈伤组织，再进行秋水仙素处理获得双单倍体。鲍惟钊【删 用含有秋水仙素的诱导分化培养基对百合的鳞片小块培养获得了多倍体；张兴翠以兰州 百合为材料，采用浅层浸泡和药棉嵌入两种方法获得百合四倍体植株。总丽言之，组织培 养技术的应用对百合的快繁、品种复壮、加快优良品种的培育，挽救珍稀濒危种类等方面 起到了重要作用。 分板掌握的资料可以蓊出，燃内外学者主簧致力予以下几个方麟的磅究：( 1 ) 不同终撼 体的焙养。外植体的选择是组培快繁初代培养成功与否的关键因素。鳞片是最早用于百含 缝培挟繁并觏褥赘葫的井植 奉 4 2 , - 4 5 ，学错稍对于鳞片步 穰傣捺彀韦手擎节、潦适宜的取材部 位、姚檀体的大小以及鳞片的接秘方式等都进褥了深入的研究。般认为取毒季傣眠屠即 将萌幼的鳞片作为外植体诱导成活率高，鳞片下部靠近鳞茎盘的部位的启动率高于其它部 位 4 6 - 4 7 1 ，这一点在大帮分酌吾台鳞片培养中褥剜证实。其次怒花器留培养，如花獯【鹩】、花 丝【4 9 1 、花药【删等等，特别楚未授粉的花器官培葬和人工授耪磁的花器官培莠对培商百合凝 品种殿保持母本优良特性有重大研究意义。其它外植体材料，如胚f 5 1 2 1 、珠芽5 3 喇】、叶片 【5 5 】、菱段等瞧都鸯成功静缀遘，获霉了完整豹撩檬。( 2 ) 培葬鏊类鳖和激素浓度配琵。适寂 四川农业大学硕士学位论文 的培养基是培养百合成功的基础，用于百合组织培养的培养基主要是m s 培养基，且取得了 较好的效果，十分适合百合的组织培养。激素的种类、浓度以及不同的配比组合对百合芽 的诱导、继代增殖与分化起着主导作用。在百合的组织培养过程中，b a 和n a a 配合使用 有利于提高诱导率。适宜浓度的b a 和n a a 搭配可使诱导率高达1 0 0 ；在以鳞片为外植体 的培养中，若激素搭配适当可直接由鳞片诱导生出小鳞茎芽而不经过愈伤组织阶段悼。丁 兰 5 7 1 在以新铁炮百合的鳞片为外植体进行诱导时发现，b a 是鳞片诱导小鳞茎芽培养过程 中不可缺少的激素成分，但浓度不能过高，否则会产生大量的愈伤组织，小鳞茎芽的诱导 率也明显降低。细胞分裂素( c y t o k i n i n ) 和生长素( a u x i n s ) 在百合的继代培养中适宜搭配对促 进芽的分化和生长有重要作用。细胞分裂素应用最多的是b a ，其次是k t 和2 i p ，生长素则 多采用n a a 、i b a 、2 , 4 - d 等。在实际的组织培养过程中，一般用较高浓度的细胞分裂素与 低浓度的生长素搭配，这样既能提高芽苗的增殖速度又能保证芽苗的健壮生长。( 3 ) 培养条 件的影响。光照、温度、糖浓度等条件对百合小鳞茎的形成也有一定的影响，国内外不少 研究者为此做出了贡献。范慈惠1 5 s 报道了不同光源对百合珠芽培养的影响，发现红光能促 进百合的生长和分化；暗培养有利于鳞茎芽的分化，昼夜变温的条件下百合增殖生长的更 好。t a k a y m a 等研究了百合鳞片组培形成小鳞茎过程中鳞片生理年龄、活性炭、糖浓度等 对培养效果的影响口”。新美芳二研究了光照时间( 0 、8 、1 6 、2 4 h ) 和培养温度( 2 0 3 0 c ) 对 鳞片分化小鳞茎的影响【删。s c a r a m a z z i 等6 1 1 提出经4 低温处理4 。6 周的小鳞片，可提前 1 2 - 2 0 天分化出小鳞茎。王爱勤【6 2 等认为糖的浓度对百合试管结鳞茎有一定的影响，1 0 的糖浓度可促进小鳞茎的生长。 2 3 大百合的繁殖方式及组织培养研究现状 大百合的繁殖方式和其它的百合植物一样，主要是分球( 新鳞茎) 繁殖，但这种繁殖 方法会导致鳞茎逐年变小退化，且繁殖速度极为缓慢，不宣频繁地分栽。采用组织培养快 速繁殖的方法，可以加快繁殖速度，而且容易保持原品种的优良观赏特性，对保护这一珍 贵的野生花卉资源具有熏要的理论意义和实践意义。 由于大百合长期以来一直都是处在野生状态，多年来末受到世人的重视，因此目前国 内外尚未见有关大百合组织培养技术的报道。不过。近年来经过中国科学院华西亚高山植 物园的努力，大百合的人工栽培研究已经取得了良好的基础，完成了大百合生物学、栽培 四川农业丈学硕士学位论文 学及商业化过程的全部技术方法研究，并建立了年产1 0 0 万种球的研究开发基地，为大百 合在我国各地城市园林绿化应用提供了理论依据和技术支持。因此，在此基础上进一步 研究大百合的快速繁殖，建立大百合组织培养的整个技术体系及全套工艺流程对于大百合 的工厂化生产显得尤为重要。 综上所述，大百合用途广泛，应用形式多种多样，是一种观赏价值与商业价值极高的 园林植物，其应用发展前景十分广阔。为了满足日益增长的市场需求，本研究将在前人研 究的基础上，致力于大百合的诱导启动、增殖、分化以及炼苗移栽等系列工作，全面、系 统地探讨适合大百合组织培养的各项因素，以期建立一整套大百合的组织培养与快速繁殖 技术体系，为实现大百合的工，一化育苗奠定技术基础，并为大百合的产业化与商品化提供 技术参考和科学依据。 3 试验材料和方法 3 1 试验材料 试验材料为大百合的更新鳞茎，取自中科院植物研究所华西亚高山植物园，试验于 2 0 0 3 年7 月在四川农业大学园艺植物种质资源改良实验室进行。 3 2 技术路线 在查阅有关文献的基础上，根据试验的耳的和计划，着重研究大百合的鳞片荐生植株 技寒环繁，礁定适寰蕊薹零培莠萋类型、檀椿霉生软憨途径玖及逡念韵螓葬条 串。善宠 诱导分化，辩扩大增殖。诱导生根培养，最后炼糟移栽。运用正交、全面组合设计安排实 验。采用方差分析、极差分祈、多霞比较簿统计方法寻找大百合组织培养最镶的培养方案。 是俸技7 蓉鼹线妇圈l 绣示： j 大裁+ 一成活夺营一宪整毽抹炼蕾+ 一魏内生壤 图1大百合组织培莽技术路线 f i g 1 t h et e c h n i q u er o u t eo f t i s s u ec u l t u r ei nc a r d i o c r i n u mg i g a n t e u m 一一 四川农业大学硕士学位论文 3 3 试验设计 3 3 1 外植体的筛选 外植体的材料类别、取材季节以及消毒方法是组织培养关键技术之一，本研究在预备 试验阶段，首先进行材料选取的实验。 外植体的采集：以大百合生长健壮、无病虫害的更新鳞茎为材料，取材时间为2 0 0 3 年 7 月、9 f l 、11 月，2 0 0 4 年3 月、5 月。接种外植体为百合鳞茎的各层鳞片。 外植体的消毒：将鳞茎置冰箱硅j 4 c 下贮藏乳8 周后取出，去掉最外面一层腐烂、褐化 的鳞片，再将根系切除。先用湿纱布轻轻擦洗鳞茎表面，然后将鳞瓣剥下，放入洗衣粉溶 液中浸泡5 m i n ，流水冲洗2 h ，置于超净工作台上；先用7 5 的酒精消毒8 一l o s ，再用0 1 的升汞消毒1 0 - 1 2 m i n ( 中间更换2 次消毒液) ，无菌水冲洗4 - 5 次后，将各层鳞瓣( 分为外层、 中层、内层) 切成上、中、下三部分，然后再将每部分切成0 5 c r u x 0 5 c m 大小的方块，再放 入无菌水中冲洗掉渗出液，用无菌滤纸吸干表面水分，接种到预先准备好的诱导培养基中 培养。每个三角瓶接种3 个鳞片，每次接种2 0 瓶。 基本培养基：m s + b a l 0 m g l + n a a 0 0 5 m g l + 蔗, , 糖3 0 9 l + 琼脂5 5 9 l ，p h 值为5 6 5 8 。 观察内容：污染率和愈伤组织形成率( 每7 天记录一次，2 0 天后统计结果) 。 培养条件：如无特殊说明，均为培养温度( 2 3 士2 ) ，光照强度1 5 0 0 2 0 0 0 l u x ，光照时 间l 扛1 4 h - d 。 污染外植体数 污染率= 接稀井檀体总数 形鼗惑荡缝缓争 獠镕数 愈伤组织形成率。 未污染外植体总数 3 3 2 初代培养 麓袋壤葬楚理黉壤甥篷绞培券浚速繁魏造程戆基毽，其嚣钓是建嚣蓥无瞧繁整絮，势 使外植体初步发育起来。这一阶段的培养效果因檬物的种性、外植体的种类和培养纂成分 丽异。许多植物在由外植体鼯成小植株的= j 建程中，必须缀由愈伤组织稃分化形成根、茎、 时或题状体( e m b r y o i d ) 。在嚣合熬鳞片缝织壤莠孛，羞激素搭酝褥当，霹不缎盎愈伤缀缓 阶段，而直接从鳞片诱导出小的鳞篓芽，然后长成小植株，也有直接诱导出究整小械株的 四j i 农业大学硕士学位论文 成功报道 6 3 。 本试验采用正交设计探索激素k t 、n a a 、b a 、i b a 对大百合诱导形成小鳞茎芽的适 用量，采用5 因素4 水平的正交设计l 1 6 ( 4 5 ) ，见表1 。 将消毒后的中层鳞片下部靠近鳞茎盘的部分切成o 5 c m x o 5 c m 左右进行接种，每处理 每次接种2 0 瓶，每瓶接3 个鳞片。 基本培养基：m s ，附加琼脂5 5 9 l ，蔗糖3 0 9 l ，p h i 5 6 5 8 。 观察内容：小鳞茎芽形成情况。 表1 初代培养正交设计方案l 1 6 ( 4 5 ) t a b 1 o r t h o g o n a le x p e r i m e n td e s i g no fp r i m a r yc u l t u r e k tn a ab a i b ak t n a ab ai b a 1 ( o ) 2 ( 0 1 ) 3 ( 0 3 1 4 ( 0 5 ) 1 2 1 ( 0 ) l ( o ) 1 2 ( 0 5 ) 2 ( 0 ，1 ) 2 3 ( 1 0 ) 3 ( 0 2 ) 3 4 ( 2 0 ) 4 ( 0 5 ) 4 234 143 9 3 ( o 5 ) l o3 1 l3 1 3 4 ( 1 0 ) 1423 1 4423 14 72 341 21 54 3241 82 432 11 6 44i32 3 3 3 继代培养 在裙代蘩葬戆基缓上获褥静势莹数量不多，还嚣要透过辩培莠基豹霉次城整，避一步 扩大繁殖，充分发挥组织培养快速繁殖的优势。本研究采用4 因索3 水平的正交设计l 9 ( 3 4 ) ， 见表2 。 每处理每次接差孛2 e 糕，每叛接j 孛3 令芽，2 次燕复。 基本培养旗：i 2 m s 、m s 、改良m s ( 其它成分不变，硝酸镄减半) ，附加琼脂5 + 5 9 l ， 2 1 4 4 3 2 叭 ： 新 ， 2 3 4 5 6 四川农业大学硕士学位论文 蔗糖3 0g l ，p h 擅5 函5 8 。 激豢：b a 、n a a 。 观察内容：芽苗增殖分化情况、4 0 d 芽总数、高于2 c m 芽数。 4 0 d 时芽墓憨数 芽瀵蘧系鼗= 蠢予2 c m 芽分化奉一 接种芽数 高于2 c m 芽数 4 0 d 芽惑数 表2 继代培养正交设计方案l 9 ( 3 4 ) t a b 2 o r t h o g o n a le x p e r i m e n td e s i g no fs u b c u l t u r e t r e a t m e n tc o n c e n t r a t i o no f b a c o n c e n t r a t i o no f n a am e d i u ma b s e n c e i i ( o 2 ) 1 ( o 1 )i ( m s ) l 2 l 2 ( 0 。3 ) 2 0 2 m s ) 2 31 3 ( 1 o ) 3 n a a i b a k t 。鼓- f 遴步黯表5 数据遴行寿蒺努辑， 结果见表6 。 四川农业大学硕士学位论文 表6初代培养小鳞茎芽分化的方差分析表 t a b 6 a n a l y s i so fv a r i a n c eo fs m a l lb u l bs h o o t si n i t i a t i o ni np r i m a r yc u l t u r e 变异来源 自由度平方和均方 f f 。 v a r i a n c es o l i c e d f s sm s k t32 4 8 4 9 8 2 8 31 9 6fo0 5 ( 3 ，3 ) = 9 2 8 n a a 33 3 4 5 9 5 1 1 1 5 3 2 b a i b a 4 4 9 2 3 0 1 0 9 7 1 7 1 4 9 7 4 33 5 3 9 + + 3 6 5 7 2 8 6 4 误差3 1 2 6 9 44 2 3 1 总和1 59 3 1 0 8 5 由表6 的方差分析结果可以看出，激素b a 对大百合小鳞茎芽的诱导分化有极显著的影 响，n a a ：对t j 、鳞茎芽的诱导分化有显著性影响，激素i b a 和k t 对实验结果的影响无显著性 差异。不同浓度的b a 和n a a 对小鳞茎芽形成率的影响见图3 、图4 。 一6 0 舞 褂 警4 0 莰 黎2 0 懿 、0 00 5l 2 b a 浓度( r a g l ) 豳3不同浓度b a 对小鳞茎芽形成率的彰嫡 f i g 3 e f f e c t s o ns m a l ls h o o t s f o r m a t i o nr a t e o f d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n so f b a 培养基中b a 的浓度对小鳞篓芽的分化有很大影响，在定的浓度范围内，随着b a 浓 度静升高，大百合小鳞茎芽分纯率呈上升的趋势 茎墨整2 壁垒! 里! ! ! 麓! ! 壁堕! 苎茎! ! 塑黧! c o n c e a t r a f i o no f l l 3 矗n o 。o f r o o t s 的50 ，0 t 孰袭2 3 霹以看出，i b a 2 0 m g l 擞撤数轰多，乎均为5 2 3 条，不加i b a 时象校数最少， 只有0 9 3 条。i b a 2 o m g l 和i b a l o m g l 之间差异不晨著，但郝岛i b a 0 m g l 麓异显著。 表2 4 活性炭3 承警飙复辍差检骏袭 t a b 2 4s s rt e s to f a ci n3l e v e l so nn o ，o f r o o t so f p l a n t l e t s _ _ _ _ - - _ _ _ _ _ _ 一 i i i i i i i i i i 。 q i i i i ( i _ 一 活性炭( )生根数( 条) 差异显祷性d i f f e r e n c es i g n i f i c a n c el e v e l a cn o o f r o o t s 0 0 50 0 1 0|4：7a a 0 3 3 4 3a a b 0 1 7 0 bb _ _ - - - - _ - _ _ - - _ _ _ _ _ _ _ _ - _ - _ _ - _ _ _ _ _ - _ _ - - _ - _ _ _ _ _ _ _ _ - _ _ - l l l - _ - _ _ _ - _ _ _ - _ _ - 一i i l lj i j 1 l i _ _ - 一 四川农业大学硕士学位论文 从表2 4 可以看出，活性炭0 1 时生数最高，平均为4 7 7 条，不加活性炭时的生根数 最少，只有1 7 0 条。活性炭0 1 和活性炭o _ 3 之间差异不显著，但都与活性炭0 在0 0 5 水平上差异显著，活性炭0 3 与活性炭0 在0 0 t 水平上差异不显著。 c 根据表1 8 平均根长的数据资料列方差分析表2 5 。 表2 5平均根长的方差分析表 t a b 2 5 a n a l y s i so f v a r i a n c eo f a v e r a g el e n g t ho f r o o ti nr o o t i n gc u l t u r e v a r 变异i a n c e 来源s o u r c e 自由a f 度平妒均方m s f 值凡 船 。8“ i b a2 1 5 9 37 9 6 51 3 8 5 *foo s ( 2 ，4 ) = 6 9 4 活性炭 2 9 9 54 9 7 5 8 6 5 *foo l ( 2 ，4 ) = 1 8 0 0 误差e 4 2 3o5 7 5 总和82 8 1 8 寝2 5 表明，i b a 帮活性炭辩平均攒长酶彰晦都燕显著的。迸一步对i b a 帮活性炭进 行多霾比较，采用鞭复极蒺检验( s s r ) ，缝合袭2 5 结果列s s r 表2 6 秘表2 7 。 表2 6 i b a 3 水平新复极差检验袭 t a b 2 6s s rt e s to f i b ai n3l e v e l so nl e n g t ho f r o o to f p l a n t l e t s 扶表2 6 可以着出，i b a 2 0 m g l 平均狠长骚长，为3 9 3 c m ，不翔i b a 时裰最短，只有 0 7 c m 。i b a 2 0 m g l 与i b a i 。0 m g l 之闻差异不显萋，但与i b a o m g l 在o 。0 5 水平上垮蓑 异显著；i b a 2 ，0 m e j l 和i b a l o m g l 在o 叫水平上差异不显著，但与i b a 0 m g l 差异显著， i b a l o m g l 与i b a o m g l 在o o 承平上差异不显著。 四川农业大学硕士学位论文 表2 7活性炭3 水平新复极差检验表 t a b 2 7s s rt e s to f i b ai n3l e v e l so nl e n g t ho f r o o to f p l a n t l e t s 从表2 7 可以看出，活性炭0 1 时平均根长最长，为3 5 7 c m ，不加活性炭的培养生成 的根最短，只有1 0 3 e m 。活性炭o 1 与活性炭0 3 之间在o 0 5 水平上差异不显著，但与 活性炭0 差异显著；活性炭o 1 、活性炭0 3 在0 0 1 水平上差异不显著，与活性炭0 差异显著，活性炭o 3 与活性炭0 在o 0 l 水平上差异不显著。 综合生根培养所有的试验数据和上述的分析结果，可以看出。大百合的生根比较容易， 适当降低无机盐的浓度有利于生根。生长素是生根培养不可或缺的因素，活性炭的用量则 对根形成的质量起着重要的作用。i b a 和活性炭对大百合生根的影响明显，i b a 的水平变 化对生根率、生根数和根长的影响大于活性炭的影响，以1 2 m s + i b a 2 0 r a g l + 活性炭0 1 作为生根培养基为好，生成的根比较多，均匀而且粗壮，植株也长势良好。有的大百合单 苗或小鳞茎在培养很长时间后也可在不加激素的培养基上生出2 3 条毛状根( 图版1o ) 。 4 5 取组培苗的各部分进行实验 敬缝培蘩瓣各帮分进镗诱导实验，不霜部辍对夺鳞茎芽豹诱导分纯彩旗差冥缀大( 袭 2 8 ) 。 液2 8无菌荫不同部位的诱导分化情况 无菌茁部位平均诱导率( )平均势纯，j 、鳞整芽数( 个) ! 型i ! ! p ! 垫! ! 鲢! ! 型熊i ! ! ! 燮 婪! ：! ! ! 里! ! ! ! ! ! ! 鳞片 7 6 3 7 a b a b4 8 b b 时片 4 s 。2 6 b b3 6 c c 鳞茎盘 9 2 7 4 a a6 2 a a 裰段8 1 8 e c 12 d d 袭2 8 试验结果震强，大露台试譬莹的各邦缎均霹诱导分铯