肝硬化患者外周血TLR、CD14表达及其与内毒素血症的关系.doc

肝硬化患者外周血TLR、CD14表达及其与内毒素血症的关系 作者：杨少奇 王莉 黄睿 杨芝红 杨力【摘要】 目的 探讨肝硬化患者外周血单个核细胞(PBMC)表面CD14、TOLL样受体(TLR2、TLR4)的表达情况及其与内毒素血症的关系。方法 分别采用显色基质鲎试剂试管法和流式细胞术检测50例肝硬化患者和30例健康志愿者外周血内毒素浓度及PBMC表面CD14、TLR2、TLR4的表达。结果 肝硬化患者外周血内毒素浓度及PBMC表面CD14、TLR2、TLR4的表达高于正常对照组(P<0.05);肝硬化合并腹水患者外周血内毒素浓度及PBMC表面CD14、TLR2、TLR4的表达高于肝硬化无腹水患者(P<0.05);肝硬化患者外周血内毒素浓度与PBMC表面CD14、TLR2、TLR4的表达呈正相关(P<0.05)。结论 肝硬化患者外周血内毒素浓度及PBMC表面CD14、TLR2、TLR4的表达均高于正常人，内毒素及内毒素受体CD14、TLR2、TLR4协同作用介导机体炎症反应，可能导致肝硬化患者病情进一步加重。 【关键词】 肝硬化;内毒素血症;Toll 样受体 内毒素血症是肝硬化患者发生严重并发症，甚至致死的重要原因之一，至今其预防和治疗效果不甚理想。内毒素的致病机制主要是依赖内毒素相关受体介导的，Toll受体2(TLR2)、Toll受体4(TLR4) 、CDl4是现已发现的内毒素相关受体1。本研究通过检测肝硬化患者外周血血浆内毒素浓度及单个核细胞表面CD14、TLR2、TLR4的表达，进一步明确TLR的表达与内毒素血症的关系。1 材料与方法1.1 研究对象宁夏医科大学附属医院2008年12月1日-2009年3月1日收住院的乙肝肝硬化患者50例，其中男37例，女13例，年龄25-75 岁，平均(50.6214.16)岁。所有乙肝肝硬化患者病例均符合2000年西安会议病毒性肝炎防治方案的诊断标准12。肝功能分级采用Child-Pugh分级法，其中Child-Pugh A级28例，B级16例，C级 6例。并将患者根据有无腹水分两组，其中肝硬化合并腹水者27例，无腹水者23例。同期随机选择30例健康人作为正常对照，其中男21例，女9例，年龄2380 岁，平均(52.2614.46)岁。1.2 标本来源80例研究对象清晨空腹采集外周血3mL。其中2mL外周血注入抗凝管中，流式细胞技术检测备用;1mL外周血注入加有1mL血液抗凝剂的无热原试管中，制成二倍稀释液。离心取上清液待检内毒素浓度。1.3 检测方法采用显色基质鲎试剂试管法检测内毒素浓度(东方鲎鲎试剂由厦门市鲎试剂实验厂有限公司生产);采用流式细胞术检测PBMC表面TLR2、TLR4、CD14的表达(CD14抗体由美国BD公司生产，TLR2、TLR4检测试剂由美国eBioscience生产)，检测结果用平均荧光强度的几何均数表示。1.4 统计学方法所有实验数据均由自动分析后获取，应用SPSS 11.5统计学软件建立数据库并分析。计量资料参数采用均数标准差表示;两样本均数比较采用t检验;多个样本均数比较采用方差分析;两变量关联性采用Pearson相关性分析。2 结果2.1 外周血内毒素浓度检测结果经统计学处理，肝硬化患者外周血内毒素浓度(0.0430.023)EUmL-1显著高于正常对照组(0.0270.018)EUmL-1(P<0.05);肝硬化合并腹水患者内毒素浓度(0.0550.033)EUmL-1显著高于肝硬化无腹水患者(0.0300.020)EUmL-1(P<0.05)。2.2 BMC表面CD14、TLR2、TLR4的表达经过统计学处理，肝硬化患者PBMC表面CD14、TLR2、TLR4的表达显著高于正常对照组(P<0.05);肝硬化腹水患者PBMC表面CD14、TLR2、TLR4的表达显著高于肝硬化无腹水患者组(P<0.05);肝硬化无腹水患者组与正常对照组有升高趋势但差异无统计学意义(P>0.05)，见表1(如图1-4，见封3)。表1 各组间PBMC表面CD14、TLR2、TLR4的表达肝硬化组与对照组比较*P<0.05;腹水组与无腹水组比较#P<0.05。2.3 外周血内毒素浓度与PBMC表面 CD14、TLR2、TLR4表达的相关性通过Pearson相关性分析，肝硬化患者外周血内毒素浓度、PBMC表面CD14、TLR2、TLR4的表达呈显著正相关性。内毒素浓度与CD14、TLR2、TLR4的表达呈正相关(r分别为0.369、0.461、0.521，P<0.05);CD14与TLR2、TLR4呈正相关(r分别为0.481、0.498，P<0.05);TLR2与TLR4呈正相关(r=0.53，P=0.002)。3 讨论肝硬化患者由于存在肠道细菌菌群紊乱、门体分流等因素容易导致内毒素血症产生，内毒素(Lipopolysaccaride，LPS)激活kupffer细胞等产生 TNF-、IL-6等炎性因子，从而加重肝脏及其他相关脏器的损害2。内毒素血症与肝硬化患者的自发性腹膜炎、肝肾综合征、肝性脑病等并发症的产生有关。本研究采用显色基质鲎试剂(试管法)检测肝硬化患者内毒素浓度，结果表明：与健康人比较，肝硬化患者内毒素水平升高，肝硬化合并腹水患者组内毒素浓度高于肝硬化无腹水患者组。说明肝硬化患者存在内毒素血症，并且内毒素与肝硬化发病及病情进展相关。肝硬化患者肠道通透性增加，肠道菌群产生的内毒素通过血循环进入肝脏及外周血，内毒素与内毒素结合蛋白(LBP)结合，通过内毒素信号转导，引起下游的炎症因子分泌，炎症因子可能会引起机体免疫系统的紊乱，导致肝纤维化的发生或肝硬化进一步加重。内毒素可通过肝星状细胞分泌细胞因子产生炎症反应，内毒素本身又可能直接加重肝脏组织的损伤。肝硬化腹水的形成与内毒素血症逐渐加重有关，进一步说明内毒素与肝硬化发病及疾病进展相关。TLR2、 TLR4、 CD14等是在宿主抗病原微生物的免疫应答中起重要作用的内毒素相关受体分子，是内毒素诱导炎症反应的始动环节3。其中TLR2、TLR4 是内毒素信号向细胞内转导的“门户蛋白”。TLR2、TLR4 、CDl4大量表达于外周血单个核细胞表面。研究显示TLR的表达与肝硬化患者内毒素血症及炎性因子的产生相关4-6。本实验采用流式细胞术检测PBMC 表面CD14、TLR2、TLR4的表达，发现乙肝肝硬化患者的表达明显高于正常人，并且腹水患者PBMC 表面CD14、TLR2、TLR4的表达高于无腹水患者，内毒素浓度与CD14、TLR2、TLR4的表达成正相关。本研究提示CD14、TLR2、TLR4 在肝硬化的发生发展中可能有重要作用，其原因可能是肝硬化患者内毒素水平升高，大量的内毒素进入血液，与单个核细胞接触，引起单个核细胞对内毒素的应激和敏感度增加，导致 TLR表达的升高，TLR识别内毒素，启动炎症信号的跨膜转导，激活转导途径，诱导细胞产生大量的炎性细胞因子，这些细胞因子在肝纤维化和肝硬化的发病中起着重要作用7。本研究中，肝硬化患者随着PBMC 表面CD14的表达增加，TLR2 显著增加。随着CD14的表达增加，TLR4 也显著增加，进一步提示CD14、TLR2、TLR4能够介导多种重要病原体成分与细胞的反应，是引起机体炎症反应的关键分子8-9。综上所述，内毒素及内毒素受体CD14、TLR2、TLR4协同作用介导机体炎症的反应过程，可能参与肝纤维化或导致肝硬化进一步加重。本研究为肝硬化的临床治疗提供新的思路和策略，从减少内毒素的角度，或阻断内毒素信号传导途径，减少促炎细胞因子的产生，将有可能改善或延缓疾病的进程。随着 Toll 样受体与肝硬化研究的进一步深入，针对 Toll 样受体靶向调节的药物将对肝硬化的临床治疗开辟新的方向10。【参考文献】 1 Janssens S，Beyaert R.Role of Toll-like Receptors in Pathogen RecognitionJ.Clinlcal Microbiology，2003，637-646.2 Wiest R，Garcia Tsao G.Bacterrical translocation BT in cirrhosisJ.Hepatology，2005，41(3)：422-433.3 Akira S，Takeda K，Kaisho T.Toll-like receptors：critical proteins linking innate and acquired immunityJ.Nat Immunol，2001(2)：675-680.4 Manigold T，Bocker U，Hanck C，et al.Differential expression of toll-like receptors 2 and 4 in patients with liver cirrhosisJ.Eur J Gastroenterol Hepatol，2003，15(3)：275-282.5 Riordan SM，Skinner N，Nagree A，et al.Peripheral blood mononuclear cell expression of toll-like receptors and relation to cytokine levels in cirrhosisJ.Hepatology，2003，37(5)：1154-1164.6 Eriksson AS，Gretzer C，Wallerstedt S.Elevation of cytokines in peritoneal fluid and blood in patients with liver cirrhosisJ.Hepatogastroenterology，2004，51(56)：505-509.7 Paik YH，Lee KS，Lee HJ，et al.Hepatic stellate cells primed with cytokines upregulate inflammation in response to peptidoglycan or lipoteichoic acidJ.Lab Invest，2006，86(7)：676-686.8 尉秀清，崇雨田，文卓夫.慢性乙肝和慢性重型乙肝患者血单核细胞Toll样受