第二章一般组织化学技术

标本制备技术 :组织化学的基本要求： 保持组织细胞良好的形态结构。 具备高度的特异性。 应有一定的灵敏性。4. 可重复性。5. 生物反映的产物必须在原位沉淀、色深、不溶和具有稳定性的特点。组织切片技术 :（一）冰冻切片： 速冻：干冰 丙酮（酒精）法：液氮法：2. 蔗糖浸泡法：（二）石蜡切片：是经典而最常用的技术。步骤： 共 5大步骤： 取材 固定 脱水 浸蜡、包埋 切片玻片处理和涂胶：（三）振动切片：（四）塑料切片：（五）超薄切片：用于电镜组织化学。（六）碳蜡切片：组织化学的基本程序一、选题：确定研究对象（内容）。依据前期研究和文献资料 。二、选方法：原则：应尽量简单，特异性和灵敏度高，易得结果，结果可靠性强。三、准备阶段：1. 试剂、药品 :2. 动物 :3. 实验（模型） :4. 标本制备（备用） :四、组织化学反应：五、观察、记录及结果统计分析：六、查文献写论文：一般组织化学技术一、酶组织化学（ 一）基本概念及分类特点 ： 酶蛋白是大分子，而一般催化剂为小分子。 酶具有高效的催化能力，其催化效能比一般催化剂高很多倍。 酶催化反应条件温和，近中性和常温下即可发生酶催化反应。 酶对催化的底物具有高度的专一性。 酶分子结构多种多样，其活性受体内多种因素的调控分为六类：a. 氧化还原酶类：b. 转移酶类：c. 水解酶类：d. 裂合酶类：e. 异构酶类：f. 合成酶类 :（二） 酶的保存及影响酶催化反应的因素1.酶浓度的影响：2.底物浓度的影响：3.激活剂浓度的影响：4.抑制剂的影响：根据抑制剂对酶的抑制作用不同：不可逆性抑制：可逆性抑制：竞争性抑制：非竞争性抑制：反竞争性抑制：5. PH值对反应的影响：最适 PH值常表现于三个方面：一是对 Vmacr反应速度的影响。二是对 Km或对底物与酶的亲和性的影响。三是对酶稳定性的影响。确定最适 PH的方法：一是查阅文献，根据前人的经验， 预实验印证（碱性磷酸酶 9.2，酸性磷酸酶 5.0）。二 是 实验测定最适 PH值。6. 温度的影响 :一是温度能影响酶分子结构的稳定性及其与底物分子之间的亲和性。二是温度能影响酶底物复合物分解速度。三是温度能影响激动剂或抑制亲和性。（三） 显示酶的组化方法及原理在酶的显示方法中，从原理讲，可分 两大类：一类是显示酶的活性 酶组织化学方法：属于 一般组化方法 。二类是显示酶的本质，即酶蛋白的存在及存在部位 免疫酶组织化学 。在酶组织化学中 ，根据其反应原则，显示酶的方法， 可分为两类：1.沉淀反应法 ：主要用于显示分解酶类。又分两类： 金属阳离子沉淀法：S 生成物中有基团 +金属离子结合 沉淀（有色）。 偶联偶氮沉淀反应法：S 生成物中有基团 +重氮盐 不溶的有色沉淀（偶氮染料）。2. 电子传递法 ：主要显示氧化酶和脱氢酶。（四）组化中常用的酶类1. 标准和要求 :（ 1）酶的纯度较高，容易获得且价格低廉。（ 2）当酶与抗体或抗生物素蛋白结合后，酶的活性不变。（ 3）结合后的酶分子在液相中能保持稳定。（ 4）内源性酶的活性应受到最大限度的降低，使之不能干扰与特异性抗原相关的染色过程。（ 5）酶反应的产物性质稳定，容易被检测。2. 常用酶：（ 1）辣根过氧化物酶（ HRP）： 常用 HRP标记抗体。显色原有： DAB： H2O2 H 2O +O +DAB 原位棕黄色沉淀。 AEC： 氧化后玫瑰红色沉淀，易溶于醇。 CN： 氧化后蓝色沉淀，易溶于醇及有机溶剂，且易扩散。 H-Y试剂：氧化后蓝黑色沉淀。（ 2）小牛肠 碱性磷酸酶（ CIAP）：显色原有： 固红 TR： 产物呈鲜红色。固蓝 BB： 产物呈亮蓝色。均易溶于醇和有机溶剂，故及时处理切片。 新碱性品红 （ NF）：产物呈红色 ,不易溶于醇和有机溶剂，其显色强度高于固红 TR 和固蓝 BB 。（ 3）葡萄糖氧化酶（尼腺曲霉菌素源）常用的显色原有： 2-P-碘酚 -3-P-硝基苯 -5-酚氯化四氮唑（ INT）： 产物呈红色，易溶于有机溶剂。 氮蓝四唑（ NBT）： 产物呈蓝黑色。现用于双重染色。 四硝基氮蓝四唑（ TNBT）： 产产物呈灰褐