保健食品毒理—仲伟鉴.ppt

1、2020/8/6,1,保健食品安全性毒理学评价,仲伟鉴 主任医师 上海市疾病预防控制中心,2020/8/6,2,主要内容,一、审评基本要求 二、毒理学试验项目的选择 三、实验动物的选择 四、样品的预处理原则 五、各试验项目应注意的要点 六、审评结论 七、毒理学安全性评价时应考虑的问题,2020/8/6,3,一、审评基本要求,1.配方 原（辅）料、用量、理化性质 2.剂量 食用方法及用量 3.工艺 规格化产品 符合配方、工艺、质量标准 4.批号 注意批号是否一致,益生菌、奶制品等保质期短的除外,2020/8/6,4,二、毒理学试验项目的选择,1.毒理学评价的四个阶段 2.普通食品及药食同源的原料

2、 3.可用于保健食品的原料 4.新原料,2020/8/6,5,1.毒理学评价的四个阶段,第一阶段： LD50,联合急性毒性，一次最大耐受量试验 第二阶段： 遗传毒性试验、30天喂养试验、传统致畸试验 其中，遗传毒性试验的组合应该考虑原核细胞与真核细胞、体内试验与体外试验相结合的原则。 第三阶段： 亚慢性毒性试验90天喂养试验、繁殖试验、代谢试验。 第四阶段： 慢性毒性试验（包括致癌试验）,2020/8/6,6,2.以普通食品及药食同源的原料生产的保健食品分以下情况： 以下情况免做毒理学试验 （1）以传统工艺加工而成，食用方法与传统方式相同。 （2）以水提物配制，服用量与常规用量相同，有关资料未

3、提示其不安全。 （3）列入营养强化剂或营养补充剂名单的化合物，其原料来源、生产工艺、质量符合国家相关要求，配方中含量也符合有关规定。 在生产加工过程中用水提工艺以外的需做毒理学试验 （1）服用量与常规用量相同 急性毒性、三项致突变试验 （2）服用量大于常规用量 还需加做30天喂养试验，必要时进行传统致畸试验和第三阶段毒性试验,2020/8/6,7,3.可用于保健食品的原料 一般只要求做急性毒性、三项致突变试验、30天喂养试验，特殊情况除外。 特殊情况：孕妇、乳母 单一成份，人参、西洋参、蜂王浆等 4.新原料 （1）定义：以普通食品和可用于保健食品范围以外的动植物或提取物、微生物、化学合成物等物

4、品的原料简称新原料。 （2）毒理学试验原则：对新原料及该原料生产的保健食品分别进行毒理学安全性评价，单一新原料生产的保健食品可替代。,2020/8/6,8,（3）试验项目选择 无食用史 需做四阶段试验 局部地区有食用史 需做三阶段试验 其中 ，100倍摄入量300倍 需做第四阶段试验 有食用史 需做二阶段试验 经评价后 下一阶段试验 广泛食用的原料 二阶段试验 食用史包括地区、年代、人群、食用量、频率等情况,确定,2020/8/6,9,已知化学物 已有权威机构进行系统的毒理学安全性评价 有资料证明所用原料与其一致 如试验结果与权威机构进行的评价不一致，需进入下阶段的试验 有新原料的保健食品 根

5、据试验结果综合分析。,二阶段试验,2020/8/6,10,三、实验动物的选择及给样量,1.根据各项实验的具体要求，合理选择实验动物 常用大鼠和小鼠，品系不限，推荐使用近交系。 2.动物应符合实验动物管理条例 清洁级或清洁级以上 动物合格证号及动物实验室合格证号 3.灌胃量 大鼠：10 ml/kgBW（若以水为溶剂，推荐20ml/kgBW） 小鼠：20ml/kgBW,2020/8/6,11,四、样品的预处理原则,1.介质的选择 应选择适合于受试动物的溶剂、乳化剂、助悬剂，要求无毒、与受试物不发生反应、稳定性好。 常用的介质有：蒸馏水、食用植物油、淀粉、明胶及羧甲基纤维素等。 2.液体类 受试物浓

6、缩倍数应符合试验要求。 浓缩方法不应破坏其有效成份，常用的有6070减压或常压蒸发、冷冻干燥。 按工艺要求。 3.袋泡茶类 处理方法与产品推荐饮用方法相同 推荐用：8090 浸泡30min 水量为受试物的10倍，提取2次，2次提取液合并浓缩至所需浓度 标明该浓缩液与受试物的比例,常压，用水,2020/8/6,12,4.含乙醇类 （1）不需浓缩的受试物 乙醇浓度15 乙醇浓度应调至15 （2）需浓缩的受试物 乙醇浓度15 浓缩后调至15乙醇浓度 在进行乙醇浓度调整时必须用原酒基 5.膨胀系数较高的受试物 选择可溶性介质 给受试物的方法：灌胃 其最高浓度最大灌胃量时达不到人体推荐量的100倍，按实

7、际达到的倍数 标明受试物的膨胀系数,2020/8/6,13,6.益生菌等微生物类保健食品 在进行 Ames试验或体外细胞试验时需将受试物灭活。 需浓缩的应采用低温干燥法或由企业提供所需浓度的受试物（附方法、技术参数）。 7.以食品为载体的受试物 （1）有营养价值 按设计量进行饲料的营养成份调整，提供详细的说明。 （2）大豆蛋白、乳清蛋白 如质量、工艺等符合食品标准和安全要求，允许去除。 如仅以该原料生产的，可申请免做毒理学试验。 8.详细说明受试物处理方法，浓度配制情况，核对受试物的给予剂量,2020/8/6,14,五、各试验项目应注意的要点,1.急性毒性试验 动物：大鼠或小鼠 体重：大鼠18

8、0200g，小鼠1822g 适应环境35天 试验前应空腹（一般禁食16h左右，不限制饮水） 剂量：一次性给予受试物或一日多次给予（间隔46h，24h不超过3次，合并1次剂量计算），设计剂量应达到人体可能摄入量100倍以上。,2020/8/6,15,2.骨髓细胞微核试验 （1）动 物：一般选用小鼠712周龄，体重2530克，两种性别，至 少各5只，环境适应35天。 （2）剂量设计： 能求出LD50 ，高、中、低剂量分别为1/2,1/4,1/8 LD50 ，低剂量组不应该出现任何毒性表现。 求不出LD50 ，高剂量 10g/kgBW 人可能摄入量的100倍 一次最大灌胃剂量 再下设中、低剂量组，另

9、设溶剂对照、阳性对照组 （3）阅片：盲法阅片，计算微核率应计数1000个以上PCE，同时计算PCE/RBC的比值。 PCE/RBC：是评价细胞毒性的指标，它的比值不低于阴性对照组的20。,2020/8/6,16,3.小鼠精子畸形试验 （1）实验动物：成年雄性小鼠 68周龄，体重2535克，适应环境35天，每组至少5只存活动物。 （2）剂量：剂量设计原则同微核试验 （3）时间：动物的处死一般在首次给样量后第35天 （3）试验结果：应详细列出畸形类型 畸形类型：无钩、香蕉形、胖头、无定形、尾折叠、双头、双尾等阴性对照组的精子异常率为0.83.4,2020/8/6,17,4.哺乳动物骨髓细胞染色体畸

10、变试验 （1）实验动物、剂量设计同微核试验 （2）每只动物分析100个中期相细胞，每个剂量组不少于1000个中期相细胞。 （3）观察项目： 染色体数目的改变 非整倍体、多倍体、内复制 染色体结构的改变 断裂、微小体、有着丝点环、无着丝点环、单体互换、双微小体、裂隙等。,2020/8/6,18,5.小鼠睾丸染色体畸变试验 （1）实验动物、剂量设计同精子畸形试验。 （2） 各组均于第一次给予受试物后的第1214天将受试动物处死、制片。 注意：性染色体早熟分离、常染色体早熟分离、细胞染色体结构畸变必须分别列表计算，其中细胞染色体结构畸变是最重要的观察指标。 6.Ames试验 (1) 试验菌株 TA9

11、7 TA98 TA100 TA102 自发回变菌落数(+S9) 90180 3050 120200 240320 (2)剂量设计：要求有5个剂量组，外加阳性对照、阴性对照、溶剂对照。 最高剂量组 5mg/皿、饱和浓度、对细菌产生最小毒性浓度。 对最高剂量组5mg/皿的正确理解 最低剂量组 0.2g/皿 每剂量组间隔5倍,2020/8/6,19,(3）受试物处理 含有组氨酸的受试物： 1）根据测得的组氨酸含量，若能诱发回复突变率增加，加设组氨酸平行对照组。 2）将受试物经XAD-过滤洗脱预处理。 对可能抑菌的受试物 根据预试验，若在5mg/皿或以下开始抑菌，需将抑菌剂量、回变列入表中，在此剂量以

12、下再设4个剂量。 含有乙醇的受试物 先将乙醇去除再进行试验。 受试物除菌方法 高压灭菌、滤膜除菌等，所选用的方法应根据工艺确定 。 （4）试验结果： 阴性结果重复2次，阳性结果重复3次。,2020/8/6,20,7. 30天、90天喂养试验 （1）动物选择 原则上选用刚断乳的大鼠，体重不应超过100g 具有特殊功能，如辅助降血脂、减肥功能、通便功能的受试物，大鼠的初始体重应适当大些。 （2）剂量设计 三个剂量组和一个对照组，每剂量至少20只动物，雌雄各半。 能求出LD50的受试物：以LD50的1025作为最高剂量组，在此基础上下设几个剂量，最低剂量组至少是人的可能摄入量的3倍。 不能求出LD5

13、0的受试物：应尽可能涵盖人的可能摄入量100倍。 体重：成人以60kg，儿童（37岁）以20kg计。 对于人体摄入量较大的受试物，高剂量可以按最大灌胃剂量或在饲料中的最大掺入量（30天，10；90天， 8）进行设计。 试验报告中应说明剂量设计的根据和计算方法。,2020/8/6,21,（3）受试物掺入： 掺入不含营养的受试物且摄入量较大（5）或掺入糖类及其它营养素应考虑调整各剂量组饲料与对照在热量、营养素等方面一致，且各种营养素的含量应符合动物饲料的有关要求。 对生理需要量与毒作用剂量相近的人体必需营养素（如VA、硒等），在按其推荐量设计剂量时，如该物质的剂量达到已知的毒作用剂量，在原有剂量设

14、计的基础上，增设去除该物质或降低该物质剂量（如降至NOAEL），联合毒性作出评价。 推荐量大的受试物可根据配方去除辅料或有资料证明安全的原料，说明处理方法、理由，且与生产工艺一致。 （4）实验操作：严格按照保健食品检验与评价技术规范（2003年版）执行，首选饲料掺入法，单笼饲养。,2020/8/6,22,（5）观察指标： 动物生长、活动的一般状况观察。 动物的体重、增重、每周进食量、总进食量、每周食物利用率。 体重、进食量、食物利用率三项指标密切相关，需综合分析与判断指标的改变是否为受试物的毒性表现。 血液学和血生化指标 血液学必测指标包括血红蛋白、红细胞计数、白细胞计数及分类，必要时测定血小

15、板数和网织红细胞数等。 血生化各项必测指标包括：谷丙转氨酶、谷草转氨酶、尿素氮、肌酐、血糖、血清白蛋白、总蛋白、总胆固醇和甘油三酯。其中血糖受禁食时间的影响较大，动物应隔夜禁食；与人相比大鼠的白蛋白/球蛋白比值变异较大，以该指标判断产品的安全性需谨慎。,2020/8/6,23,（6）大体解剖及组织病理学检查 大体解剖观察：应对所有动物进行大体解剖观察，观察异常表现。 脏器重量及脏器相对重量: 肝、肾、脾、睾丸的绝对和相对重量为必测指标；主要审查脏器的相对重量。绝对重量和相对重量均改变，则有重要的生物学意义。 应使用动物处死时的体重作为计算脏器体重比。 组织病理学检查:报告中应该是描述性的，应包

16、括正常组织和异常组织的详细病理学描述。 其它指标观察：根据受试物的性质及所观察到的毒性反应，判定是否增加其它敏感指标，如增加神经毒性指标的观察。,2020/8/6,24,六、审评结论的判定,1.认可毒理学试验：试验设计合理，操作规范，试验结果能够证明受试物的安全性。 2.属以下几种情况之一，补充资料后建议批准： （1）检验报告格式不规范，需要重新出具检验报告毒理学试验报告。 （2）数据偏离历史对照较大，需检验机构做出解释。 （3）未提供某些试验数据，需要补充提供。 3.重做试验，大会再审，属以下几种情况之一： （1）由于实验操作不规范，根据提供的检验报告无法评价产品的安全性，需要做除30天/9

17、0天喂养试验以外的毒理学试验； （2）已有数据提示可能存在安全性问题，但难以下结论，需要重复试验。,2020/8/6,25,4.对产品的安全性不予认可的情况如下： （1）毒理学评价的结果表明产品在推荐剂量下对人体具有一定的毒性，存在安全性问题。 （2）产品的原料、配方存在明显的安全性问题，如配方含有“可用于保健食品的原料”名单以外的原料，且未进行新资源食品安全性毒理学评价。 （3）选择安全性毒理学试验不符合程序规定，未完成相应阶段的毒理学试验。 （4）毒理、功能、兴奋剂与卫生学、稳定性试验样品的批号不一致。 （5）未按规定提供安全性毒理学评价资料的。 （6）30天/90天喂养试验剂量设计不合理

18、或某些指标异常，结果不可信。,2020/8/6,26,七、毒理学安全性评价时应考虑的问题,1.试验指标的统计学意义和生物学意义 在分析试验组与对照组指标统计学上的显著性时，应根据其有无剂量反应关系及与本实验室的历史性对照值范围比较的原则来综合考虑指标差异有无生物学意义。 2.生理作用与毒性作用 对实验中某些指标的异常改变，在结果分析评价时要注意区分是生理学表现还是受试物的毒性作用。 3.时间-毒性效应关系 对由受试物引起的毒性效应进行分析评价时，要考虑在同一剂量水平下毒性效应随时间的变化情况。 4.特殊人群和敏感人群 对孕妇、乳母或儿童食用的保健食品，应特别注意其胚胎毒性或生殖发育毒性、神经毒性和免疫毒性。,2020/8/6,27,5.人的可能摄入量较大的保健食品 应考虑给予受试物量过大时，可能影响营养素摄入量及其生物利用率，从而导致某些毒理学表现，而非受试物本身的毒性作用所致。 6.含乙醇的保健食品 对实验中出现的某些指标的异常改变，在结果分析评价时应注意区分是乙醇本身还是其它成分的作用。 7.动物年龄对试验结果的影响 对实验中出现的某些指标的异常改变，要