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文档简介
中药指纹图谱研究技术中华中医药学会中药化学分会委员周玉新内
容一、中药指纹图谱技术概述二、中药指纹图谱研究指导原则三、指纹图谱研究的相似度计算四、中药指纹图谱的研究方法与思路五、中药指纹图谱研究示例演示(实验)一、中药指纹图谱技术概述(一)
中药指纹图谱与中药质量(二)
中药指纹图谱研究方法学(三)
中药指纹图谱技术的发展1.中药指纹图谱与中药安全、有效、稳定的关系(一)
中药指纹图谱与中药质量指纹图谱稳定性可控性安全性有效性2.国内中药质量评价现状
植物学方法:
植物化学方法:
分析化学方法:
药理学方法:
分子生物学方法:原植物鉴定,显微鉴定等理化鉴定仪器分析,色谱分析等
生物鉴定法,生物等效等
DNA指纹鉴定3.国外植物药质量评价概况煉标准制剂:五味子银杏
人参
西洋参甘草
黄芪
贯叶连翘煉定量测定结合主成分比例煉固定产地以生产质量恒定制剂煉多种分析手段和方法包括药材、中间体等指纹图谱4.中药指纹图谱的意义煉是全面反应中药所含内在化学成分的种类与数量,进而反映中药的质量,尤其在现阶段中药的有效成分绝大多数没有明确,采用中药指纹图谱的方式,将有效地表征中药质量和稳定性煉有利于中药及其产品进入国际市场5.中药指纹图谱建立的原则煉系统性:煉特征性:煉稳定性:指纹图谱所反映的化学成分,应包括中药有效部位所含大部成分的种类,或指标成分的全部指纹图谱中反映的化学成分信息(具体表现为保留时间或位移值)是具有高度选择性的,是这些信息的综合结果指纹图谱在规定的方法与条件下应能作出相对一致的指纹图谱色谱特征的稳定性:色谱条件稳定性:特征峰特征区
特征参数不同仪器的验证
不同实验室的验证不同操作者的验证6.指纹图谱研究目的☆品种鉴别--真伪☆基源鉴别--产地☆药用部位的鉴别--根、茎、叶、花、果☆提取工艺☆药材炮制☆限量成分的控制☆一致性--不同批次的产品.7.
建立中药指纹谱所面临的问题煉品种多、产地多;采收、加工不一致-化学组分与含量不同(产品品质优劣不同)煉有效组分种类繁多、含量相对少;非有效组分成分复杂、含量高-分析检测困难(质量控制指标不统一)煉基础研究薄弱煉药材GAP建设滞后8.
对
策煉加强GAP药材种植基地建设煉加强中药种植与加工、炮制的规范化煉加强中药化学成分的基础研究煉应用现代分析技术手段进行中药指纹图谱研究9.
中药指纹谱研究过程中面临的问题煉仪器设备煉技术人员煉研究经验系统性问题稳定性问题特征性问题(二)
中药指纹图谱研究方法学
色谱法液相色谱法(LC)气相色谱法(GC)薄层扫描法(TLC)毛细管电泳法(CE)
其它质谱法(MS)及色谱与质谱联用X-衍射法近红外法(NIR)等(三)
中药指纹图谱技术的发展煉
应用范围煉
仪器设备与软件煉
指纹图谱标准二、
中药指纹图谱研究指导原则(一)目的和要求(二)中药指纹图谱标准起草说明(三)中药指纹图谱标准的建立(一)目的和要求煉中药质量研究和质量标准的一个重要内容煉加强中药质量管理、提高中药质量、保证药品安全、有效、稳定、可控煉固定原料药(中药材)品种、产地和采收季节的前提下,需制定原料药(中药材)和注射剂的指纹图谱(二)中药指纹图谱标准起草说明名称、汉语拼音按中药的命名原则制定来源(产地、采收期、炮制)药
材:产地、采收期、炮制中间体:提取工艺或提取物的来源供试品溶液的制备有效成分(专属性成分、指标性成分)的理化性投质并结合检测方法的要求提取工艺参照物溶液的制备 对照品内标物标准提取物中药指纹图谱检测方法的验证检测方法测定方法、仪器、试剂、测定条件验证专属性(空白试验)精密度试验(RSD<3%)重复性与重现性试验(S<0.95)稳定性试验(S<0.95)系统适应性试验指纹图谱的相关性(三)中药指纹图谱标准的建立注意事项所有成分应在2小时左右洗脱,并提供2小时的指纹图谱可建立各个组分的指纹图谱可建立多种方法的指纹图谱可选择典型样品的指纹图谱,或标准提取物的指纹图谱,或具有代表性的勾兑样品的指纹图谱作为标准指纹图谱2.指纹图谱标准的建立(1)药材、中间体指纹图谱标准为企业内控标准,列入起草说明(2)10批供试品(3)标准的规定:供试品的指纹图谱与对照提取物(标准提取物的指纹图谱一致;或供试品的指纹图谱与对照指纹图谱(标准图谱)一致;或通过对各特征峰的位置(相对保留时间、比移值等)、丰度(积分面积或峰高)及相对丰度、光谱特性(颜色)等综合参数的描述予以确定。3.
指纹图谱标准书写格式液相色谱法【指纹图谱】
照高效液色谱法(中国药典一部附录VID),结合指纹图谱的要求测定。色谱条件及系统适用性试验
如以对照品做系统适用性试验,则参照中国药典书写格式。如以随行对照提取物做系统适用性试验,则只书写所用仪器、色谱柱型号及有关参数和各项具体试验条件。对照品溶液的制备供试品溶液的制备如有对照品则照中国药典书写格式。精密吸取供试品溶液、对照品溶液(或对照用提取物溶液)各XX
l,分别流入液相色谱仪,测定。本品指纹图谱的主要特征
供试品指纹图谱与质量标准所附的对照指纹图谱(或随行对照提取物指纹图谱)经计算软件计算,相似度大于
XX,符合要求(或相似度小于
XX,不符合要求)。三、指纹图谱研究的相似度计算(一)、指纹图谱相似度评价原则与方法(二)、指纹图谱相似度计算原理(三)、指纹图谱相似度评价软件(一)、指纹图谱相似度评价原则与方法原则:整体性、模糊性、特征性方法:直接观察、计算机辅助相似性计算(二)、指纹图谱相似度计算原理引用参数数据获取途径相似度算法1.
引
用
参
数①保留时间(RT)②峰高(He
i
ght)③峰面积(Ar
ea)④峰面积百分比(Ar
ea%)⑤相对保留时间(Ra
t
i
o
of⑥积分相对比值(Ra
t
i
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Ti
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,
RRt
)Ar
ea,
RA)2.
数据获取途径图形/图像转化成ASCI
I数据截片数据色谱数据3.
相
似
度
算
法相关系数算法夹角余弦算法优化算法(三)、指纹图谱相似度评价软件软件开发原则市售/常用软件简介相似度软件使用过程中应注意的问题1.
软
件
开
发
原
则(1)
系统独立性(2)计算方法的科学性
(3)数据接口通用性(4)操作过程及应用的实用性2.
市售/常用软件简介(1)浙江大学(2)中南大学陈一宇教授梁逸增教授(
3)
沈阳药科大学
毕开顺教授李华教授(4)西北大学(5)二军大
(6)Wa
t
er
s3.
相似度软件使用过程中应注意的问题(1)
数据接口与数据类型(2)
数据的校正(3)
算法的选择四、中药指纹图谱的研究方法与思路(一)、研究方案设计(二)、样品的选择与收集(三)、供试品的制备(四)、指纹图谱色谱条件研究的思路(五)、相似度值的研究与指纹特征(一)、研究方案设计资料收集与整理文献、工艺资料、质量标准方案的设计研究对象-有效成分研究方法的选择-色谱法(HPLC
GC
TLC)及其它方法研究内容-根据技术要求的规定:包括“名称、来源、制备、检测方法、标准规定及起草说明”(二)、样品的选择与收集要求:10个批次道地药材与GAP基地药材典型性与代表性离散样品的剔除(三)、供试品的制备依据:有效组分的物理化学性质生产或提取工艺检测方法的需要(四)、指纹图谱色谱条件研究的思路高效液相色谱法
HPLC气相色谱法
GC1.高效液相色谱法HPLC检测波长的选择
(简)柱温的选择
(略)进样量
(简)色谱柱的选择
(重点)检测成分的选择
(重点)流动相(梯度表)的选择
(重点)(1)
检测波长的选择示例:蜂胶(Be
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Pr
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07
0mA
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0
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0
06
0
0波长选择:=280nm(4)
色谱柱的选择选用市场上较常见的填料所填充的色谱柱,例如:E
k
a-Nob
e
l的
K
r
oma
s
i
C18(5
m),其分离效果好、性能稳定,无论是国产填充的
Kromasi色谱柱,还是国外公司填充的Kromasi色谱柱,在分离效果上基本相同。因此对于大多数中药注射剂,可选用Kromasi色谱柱。如选用乙腈-缓冲溶液,应根据缓冲溶液的特点,选用相应的色谱柱:①如为酸性缓冲溶液,可选用Zor
baxSB-C18色谱柱(pH<2);②如为碱性缓冲溶液,可选用Eclipse
XDB-C18色谱柱(pH>6)。示例:不同的色谱柱对三七总皂苷的分离效果3
0
04
0
05
0
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Wa
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le
ng
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nm
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.D)*VWD1
A,
Wa
ve
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th=203
nm
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.D)mAU140mi0102030405060700204060(5)
检测成分的选择(重点)示例:何首乌1
0
0
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2
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95
209
013011031.
.
.
.
..531
0.239035.20246.83150.94951.696何首乌生品的液相色谱图(全局图)1
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01
5
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011.12715.55317.66220.21422.33325.83451.696何首乌生品的液相色谱图(局部放大图)min01
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120.75621.15322.00423.42724.20325.50126.19631.12035.25246.625m
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9
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1
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.
05
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3.
4.
.
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2
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D)m
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4.
.3
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ng
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2
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3
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.
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.
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4
.
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688021.46821.86623.71724.27531.41747.05352.010图9上海制首乌指纹图谱m
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D
)1600217.
.17218.12619.37320.22222.11022.74824.48646.919北京良方药业制首乌m
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.4
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7
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.
.
.
.6
8.
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1111
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1
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.
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.7742
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23
3.
.7
35
39
024.70626.67627.76531.44747.074北京金象药店制首乌m
A
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.
D
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0
02.83310.60911.22611.50011.90321.694北京寿春堂药店制首乌指纹图谱(6)
流动相(梯度表)的选择主要影响因素起始浓度梯度速率流速梯
度
表指纹图谱流动相梯度优化时间顱min水%(H+/OH-)*乙腈%*Ⅰ01000552080600100Ⅱ01000407030606040Ⅲ08020406040605050Ⅳ06040403070600100*为体积百分比(V/V)初始色谱条件时间(min)水%(H+/OH-)乙腈%01000600100时间(min)水%(H+/OH-)乙腈%01000552080600100初始色谱条件的设定依据及目的依据:化合物极性大小。如未知时,假设有效组分中包含各种极性的成
分。目的:快速确定主要或大部分化合物被洗脱时流动相的组成,为优化条件的选择提供依据。优化条件的选择选择依据:初始色谱图、梯度洗脱表及一定的经验示例:(1)淫羊藿总黄酮(40%)提取物钩藤总生物碱黄连药材知母总皂苷1
5
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0
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ng
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0淫羊藿提取物第一次优化后的色谱图梯度速率:初始:100/60min=1.7/min优化:0~1.7CH3CN%CH3CN%MinMin初始条件CH3CN%CH3CN%Min三七人参西洋参Min起始浓度:根据初始色谱图中主要色谱峰被洗脱时的流动相组成,相应减少~20%。流速:0.5~2.0
ml/min2.
气相色谱法(1)影响色谱峰分离程度的因素色谱柱的类型载气流速起始柱温升温速率(2)研究示例样品:广藿香油指纹图谱研究过程方案设计1.检测方法色谱方法广藿香油为广藿香药材经水蒸汽蒸馏而得到的挥发油,均为易挥发组分,拟采用气相色谱法(GC)。仪器:Agi
l
ent
6890
GC色谱柱的选择可供选择的色谱柱:极性
非极性
中等极性进样方式的确定手动
自动
顶空2.
供试品溶液的制备取广藿香油适量,加醋酸乙酯溶解,即得。注:对于非极性毛细管色谱柱,如供试品溶液中含少量的少,最好干燥后进样。2.
色谱条件的摸索(1)对梯度速率及流速进行微调-由粗到精F
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A,
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(GHX_TE
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