食品药品化妆品微生物检测概要

食品药品化妆品微生物检测概要4.培养基细菌：卵磷脂吐温80营养琼脂第2页,共39页，2024年2月25日，星期天原理蛋白胨和牛肉膏粉提供氮源、维生素、和生长因子，氯化钠维持均衡的渗透压卵磷脂和吐温80中和防腐剂并能子啊乳浊液中分散物质的功能，卵磷脂能中和季铵盐，吐温80可中和酚、六氯酚、福尔马林，两者可中和乙醇，琼脂是培养基的凝固剂大多数细菌能还原TTC,使之能易于形成辨别的红色菌落，TTC能缓减某些杂菌生长。第3页,共39页，2024年2月25日，星期天霉菌：孟加拉红培养基第4页,共39页，2024年2月25日，星期天原理

蛋白胨提供碳源和氮源；葡萄糖提供能源；磷酸二氢钾为缓冲剂；硫酸镁提供必须的微量元素；琼脂是培养基的凝固剂；氯霉素可抑制细菌的生长；孟加拉红作为选择性抑菌剂可抑制细菌的生长，并可减缓某些霉菌因生长过快而导致菌落漫延生长。

第5页,共39页，2024年2月25日，星期天操作步骤不同类型样品的检样制备。液体样品：水溶性的液体样品，可量取10ml加到90ml有玻璃珠灭菌生理盐水中，如样品不少于10ml。仍按10倍稀释法进行。如为5ml则加45ml灭菌生理盐水，混匀后，制成1：10稀释液。油性液体。取样品10ml，先加5ml来菌液体石蜡混匀，再加10ml灭菌的吐温80，在40~44℃水浴中振荡混合10min，加入有玻璃珠灭菌的生理盐水75ml（在44~44℃水浴中预温），在40~44℃水浴中乳化，制成1：10的悬液。第6页,共39页，2024年2月25日，星期天膏、霜、乳剂半固体状样品。亲水性的样品，称取10g，加到灭菌的带玻璃珠加有90ml灭菌生理盐水的锥形瓶中，充分振荡混匀，放32℃水浴静置15min。用其上青液作为1：10的稀释液。疏水性的样品，称取10g，放到灭菌的研钵中，加10ml灭菌液体石蜡，研磨成粘稠状，再加10ml灭菌吐温80，研磨待溶解后，加70ml灭菌生理盐水，在40~44℃水浴充分混合，制成1：10稀释液。固体样品，称取10g，加到灭菌的生理盐水稀释瓶中，振荡混匀，使其分散混悬后，放30~32℃水浴中，15min后取出，充分振荡混合，再放到30~32℃水浴中静置15min，取上清液作为1：10的稀释液。如有均质器，上述水溶性膏、霜、粉剂等，可称10g样品加到90ml灭菌生理盐水，均质1~2min；疏水性膏、霜及眉笔、口红等，称10g样品加到90MLSCDLP液体培养基，或1g样品加1ml灭菌液体石蜡、1ml灭菌吐温80、7ml灭菌生理盐水，均质3~5min。第7页,共39页，2024年2月25日，星期天细菌与霉菌图鉴细菌霉菌第8页,共39页，2024年2月25日，星期天食品微生物限度检查方法介绍食品微生物检验的指标食品在食用前的各个环节中，被微生物污染往往是不可避免的。评价食品被微生物污染的程度，要采用微生物检验指标采进行。常采用的微生物检验指标为三项细菌指标，即细菌数量(主要是菌落总数)、大肠菌群最近似数(MPN)和致病菌。第一节菌落总数

一、菌落总数的概念及卫生意义食品中细菌数量越多，则食品腐败变质的速度就越快，甚至可引起食用者的不良王应．如有人认为细菌数量达到100—1000万个／g时食品就可能引起食用者的食物中毒。菌落：指细菌在固体培养基上生长繁殖而形成的能被肉眼识别的生长物，它是由数以万计相同的细菌集合而成。细菌数量的表示方法由于所采用的计数方法不同而有两种：菌落总数和细菌总数：第9页,共39页，2024年2月25日，星期天1、菌落总数指一定数量或面积的食品样品，在一定条件下进行细菌培养，使每一个活菌只能形成一个肉眼可见的菌落，然后进行菌落计数所得的菌落数量。通常以lg或1ml或lcm2样品中所含的菌落数量来表示。按国家标准方法规定，即在需氧情况下，37℃培养48h，能在普通营养琼脂平板上生长的细菌菌落总数，所以厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌，由于现有条件不能满足其生理需求，故难以繁殖生长。因此菌落总数并不表示实际中的所有细菌总数，菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等。

第10页,共39页，2024年2月25日，星期天02、细菌总数指一定数量或面积的食品样品．经过适当的处理后，在显微镜下对细菌进行直接计数。其中包括各种活菌数和尚未消失的死菌数。细菌总数也称细菌直接显微镜数。通常以1g或1m1或lcm2—样品中的细菌总数来表示。菌落总数测定是用来判定食品被细菌污染的程度及卫生质量，它反映食品在生产过程中是否符合卫生要求，以便对被检样品做出适当的卫生学评价。菌落总数的多少在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣

二、菌落总数的常规检验方法菌落总数的常规检验方法(GB4789．2-84)：一般将被检样品制成几个不同的10倍递增稀释液，然后从每个稀释液中分别取出1mL置于灭菌平皿中与营养琼脂培养基混合，在一定温度下，培养一定时间后（一般为48小时），记录每个平皿中形成的菌落数量，依据稀释倍数，计算出每克（或每ml）原始样品中所含细菌菌落总数。基本操作一般包括：样品的稀释——倾注平皿——培养48（24）小时——计数报告第11页,共39页，2024年2月25日，星期天（一）样品的处理和稀释：1．操作方法：1）、以无菌操作取检样25g（或25ml)，放于225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内，经充分振要或研磨制成1：10的均匀稀释液。固体检样在加入稀释液后，最好置灭菌均质器中以8000~10000r/min的速度处理1min，制成1：10的均匀稀释液。2）、用1ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混合均匀，制成1：100的稀释液。3）、另取1ml灭菌吸管，按上项操作顺序，制10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次即换用1支1ml灭菌吸管。

第12页,共39页，2024年2月25日，星期天2．无菌操作：操作中必须有“无菌操作”的概念，所用玻璃器皿必须是完全灭菌的。所用剪刀、镊子等器具也必须进行消毒处理。样品如果有包装，应用75%乙醇在包装开口处擦拭后取样。操作应当在超净工作台或经过消毒处理的无菌室进行。琼脂平板在工作台暴露15分钟，每个平板不得超过15个菌落。

3．采样的代表性：如系固体样品，取样时不应集中一点，宜多采几个部位。固体样品必须经过均质或研磨，液体样品须经过振摇，以获得均匀稀释液。

4．稀释液：样品稀释液主要是灭菌生理盐水，有的采用磷酸盐缓冲液（或0.1％蛋白胨水），后者对食品已受损伤的细菌细胞有一定的保护作用。如对含盐量较高的食品（如酱油）进行稀释，可以采用灭菌蒸馏水。第13页,共39页，2024年2月25日，星期天操作简介示意图第14页,共39页，2024年2月25日，星期天食品细菌培养基细菌培养基营养琼脂：用于药品和药品中细菌总数计数

第15页,共39页，2024年2月25日，星期天霉菌培养基马铃薯葡萄糖琼脂：马铃薯浸出粉有助于霉菌生长，葡萄糖提供能源，营养琼脂提供凝固剂，氯霉素抑制细菌的生长第16页,共39页，2024年2月25日，星期天食品中不得检测出的细菌和霉菌细菌包括沙门氏菌,志贺氏菌，致谢大肠埃希氏菌等霉菌包括黄曲霉、寄生曲霉、杂色曲霉等第17页,共39页，2024年2月25日，星期天药品微生物限度检查方法介绍第18页,共39页，2024年2月25日，星期天微生物限度检查法：检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。是判定药品受到微生物污染程度的重要指标，也是对生产企业的设备器具、工艺流程、生产环境和操作者的卫生状况进行卫生学评价的综合依据之一。药品的生产、贮存、销售过程中的检验，原料及辅料的检验，新药标准制订，进口药品标准复核，考察药品质量及仲裁等，除另有规定外，其微生物限度检查均以本标准为依据。第19页,共39页，2024年2月25日，星期天检查项目细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌的检查。第20页,共39页，2024年2月25日，星期天检测药品种类1、制剂通则、品种项下要求无菌的制剂及标示无菌的制剂应符合无菌检查法的规定。2、口服给药制剂3、局部给药制剂

3.1.用于手术、烧伤及严重损伤的局部给药制剂无菌

3.2.眼部给药制剂：

3.3、耳、鼻及呼吸道吸入给药制剂

3.4、阴道、尿道给药制剂

3.5、直肠给药制剂

3.6、其它局部给药4、含动物组织（包括提取物）的口服给药制剂5、有兼用途径的制剂应符合各给药途径的标准6、霉变、长螨者以不合格论7、原料及辅料第21页,共39页，2024年2月25日，星期天供试品的抽样及检验取量一般采用随机抽样方法，抽样量应为检验用量的3倍量（以备复试）。贵重药品检验量可以酌减（至少要够各种菌检查用的溶液）。所有剂型的检验量均需取2个以上包装单位（中药密丸、膜剂，需取自4丸、4片以上）。固体及半固体（粘稠性供试品）制剂检验量为10g。液体制剂检验量为10ml。膜剂除另有规定外，中药膜剂检验量为50m2,化学药及生化药膜剂检查量为10cm2。抽样时，凡发现有异常或可疑的样品，应选取有疑问的样品，但明显破裂的包装不得作为样品。凡能从药品、瓶口（外盖内侧及瓶口周围）外观看出长螨、发霉、虫蛀及变质的药品，可直接判为不合格品，无需再抽样检验。第22页,共39页，2024年2月25日，星期天供试品的保存供试品在检验之前，应保存在阴凉干燥处，勿冷藏或冷冻，以防供试品内污染菌因保存条件不妥引起致死或繁殖。供试品在检验之前，应保持原包装状态，严禁开启。包装已开启的样品不得作为供试品。第23页,共39页，2024年2月25日，星期天平板菌落计数法供试液制备（10倍递增稀释）注平皿倒培养基摇合（45℃营养琼脂玫瑰红钠琼脂

YPD琼脂培养基）倒置培养（30～35℃48小时；25～28℃72小时）菌落点数（30～300个30～100个）菌数报告（10条原则）第24页,共39页，2024年2月25日，星期天供试液的制备（1）乳化剂、分散剂、中和剂及其用量应证明是有效的，并对微生物无毒性。水浴加温时，温度不超过45℃，时间不超过30分钟。供试液从制备到加入培养基，不超过1小时。供试液的体积：最终体积为100ml。第25页,共39页，2024年2月25日，星期天供试液的制备（2）稀释剂：

pH7.0氯化钠－蛋白胨缓冲液肠溶制剂

pH7.6磷酸盐缓冲液、pH6.8磷酸盐缓冲液非水溶性供试品乳化剂：5g司盘80、3g单硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80的无菌混合物（事先配制好、灭菌消毒）。十四烷酸异丙酯萃取或过滤第26页,共39页，2024年2月25日，星期天供试液的制备（3）液体供试品取供试品10ml，置灭菌锥形瓶中，加入稀释剂至100ml，摇匀，作为1:10供试液。含王浆或蜂蜜的液体制剂和滴眼剂直接用供试品作为供试液。固体、半固体或粘稠供试品，称取供试品10g，置于匀浆杯或适当灭菌容器中，加入稀释剂至100ml，用匀浆仪（3000-5000r/，2—4min）、振荡器或乳钵研磨等方法混匀。胃溶胶囊加稀释剂后置45℃±1℃水浴振摇，肠溶胶囊加无菌磷酸盐缓冲液后45℃±1℃水浴振摇。第27页,共39页，2024年2月25日，星期天供试液的制备（4）非水溶液性供试品软膏剂、乳膏剂、称供试品5g（5ml），加到含已灭菌溶化并45℃保温的乳化剂的烧杯中，用无菌玻棒搅拌混匀后，慢慢加入45℃左右的稀释剂85ml，边加边搅拌，使供试品充分乳化，作供试液（1:20）。油剂取供试品10ml，加入无菌聚山梨酯—805–8ml，摇匀，再加入稀释剂至100ml。栓剂，称取供试品10g，置灭菌锥形瓶中，加适量稀释剂，置45℃水浴保温10min，使溶，加入灭菌聚山梨酯805—8ml，振摇使之乳化，再加稀释剂（稀释剂和聚山梨酯80总量为100ml），摇匀。第28页,共39页，2024年2月25日，星期天供试液的制备（5）气雾剂，将供试品置冰箱（4--8℃）1h，取出，用碘伏棉球（也可用乙醇棉球）擦拭试品开启部位周围，然后以无菌钢锥钻孔并插入容器中，勿移出钢锥，以转动方式使容器抛射剂全部抛出。以无菌注射器吸出全部溶液，按标示量补加稀释剂至足量（若含非水溶性成分，加适量无菌聚山梨酯—80液）此液即为供试品原液。膜剂将药膜剪成碎片，置灭菌锥形瓶中，加入稀释剂至100ml，于45℃±1℃水浴中保温，振摇使溶。茶剂，取供试品10g，置灭菌锥形瓶中，加入稀释剂至100ml，振摇30s,以灭菌纱布过滤，（如为袋泡茶，可直接取2袋，以称样结果按1：10加稀释剂，浸泡30min）。以上供试品如吸水膨胀，或粘度过高，可增加稀释剂，制成1:20—1:100供试液。

第29页,共39页，2024年2月25日，星期天供试品溶液的制备（6）（含抑菌成分的供试品）稀释法：10ml供试液种入较大体积的培养基中，一般不超过1000ml

离心沉淀法：3000rpm，30min，底部2ml稀释至10ml。500rpm,5min，上清液再离心集菌薄膜过滤法：0.45um的滤膜，冲洗3次，每次至少100ml

中和法：磺胺类100ml增菌液中含1%的对氨基苯甲酸1ml

砷、汞类100ml硫乙醇酸盐培养基洗必泰类100ml增菌液中加适量的聚山梨酸80等表面活性剂沉降法：自然沉降5min，取上层液置100ml增菌液中第30页,共39页，2024年2月25日，星期天供试液的稀释（10倍递增稀释法）10g100ml1:101ml10ml1:1001ml10ml1:1000至少3个稀释级，每递增1个稀释级，必须更换吸管。管内混合吹打不少于10次，吸液在液面下2.5cm处，放液在液面上1cm处，延内壁缓缓吹出全部溶液，然后将吸管放入消毒液缸内。第31页,共39页，2024年2月25日，星期天注平皿在进行10倍递增稀释的同时，以该稀释级吸管，吸取各种稀释液各1ml至每个灭菌平皿中（从高稀释级至低稀释级吸液时可用1支吸管），每一稀释级注2-3个平皿（此时一般为左手执平皿，将盖半开，右手执吸管），注平皿时，将1ml供试液慢慢全部注入平皿中，管内无残留液体，防止反流到吸管尖端部。同时作阴性对照（待各级稀释液注皿完毕后，用1支1ml吸管取稀释剂各1ml，分别注入4个平皿中。其中2个作细菌数阴性对照；另2个作霉菌、酵母菌数阴性对照，如另用YPD琼脂测定酵母菌数时，则再增加2个平皿作酵母菌数阴性对照。

第32页,共39页，2024年2月25日，星期天倒培养基摇合将预先配制好的培养基（细菌计数用营养琼脂、霉菌、酵母菌计数一般用玫瑰红钠琼脂，含蜂蜜、王浆液体制剂另用YPD琼脂）熔化、冷至约45℃时，倾注上述各个平皿约15ml，以顺时针或反时针方向快速旋转平皿混匀，注意，混匀时切勿将培养基，溅到皿边及皿盖上，置操作台上待凝。第33页,共39页，2024年2月25日，星期天倒置培养