京尼平苷对小鼠急性酒精性肝损伤的保护作用

京尼平苷对小鼠急性酒精性肝损伤的保护作用

根据之前的研究，发现京尼平酸盐可显著降低中度丙酸酯酶损害大鼠血清中的磷脂和ast活性，并增加肝脏中的gsh含量。其作用机制是抑制老鼠肝脏内细胞色素p4502e1的活性，从而降低自由基的生成率，并增加肝细胞中的gst（原还原酶）和gr（原还原酶）的活性。增加跨洲糖系统ccl3的去除能力和效率。本文从酒精性肝损伤方面对京尼平苷的保肝作用进行进一步研究。1材料和方法1.1溶液配制与hplc测定京尼平苷提取自山栀子(GardeniajasminoidesEllis)的果实,纯度经HPLC检测大于95%,用蒸馏水分别配成7.5mg/ml、5mg/ml、2.5mg/ml溶液,4℃冰箱保存备用。凯西莱(硫普罗宁片,TioroninTablets):河南省新谊药业有限公司,将凯西莱片研钵磨碎后蒸馏水溶解配成2.5mg/ml溶液,4℃冰箱保存,用时摇匀。1.2gsh和dtnb二锅头白酒:56%(v/v),北京红星股份有限公司;GSH标准品:北方同正生物公司。DTNB:上海伯奥生物科技有限公司。其余试剂均为国产分析纯。1.3动物昆明种小鼠,体重20±2g,全雄,由四川医学科学院实验动物中心提供,合格证号:川实动管质第15号。1.4灌胃密度和gsh含量72只小鼠按体重随机分为6组,每天灌胃二锅头白酒16ml/kg(约7g/kg)一次,ig白酒前3hig相应药物或等容积蒸馏水,灌胃体积均为0.2ml/10g。于造模第9天禁食12h,第10天给予白酒后4h,断头取血,同时立即取肝脏,用冰冷的生理盐水冲尽残血,滤纸拭干。将肝脏最大叶浸泡在福尔马林溶液中,用于做病理切片。称取剩余部分肝脏0.5g,加入4.5ml生理盐水制成10%肝匀浆,按试剂盒说明书方法测定肝匀浆内MDA含量,按DTNB法测定GSH含量;分离血清,按试剂盒说明书方法测定血清中ALT、AST。2结果2.1造模前后小鼠一般情况给予白酒后,小鼠先表现出兴奋状态,继而行走不稳,四肢瘫软,半小时后醉倒,呼吸急促,抽搐,此状态一直持续数小时。2～3天后,小鼠出现稀便现象,食量减少。8天后,小鼠普遍状态不好,精神萎靡不振,毛色干枯无光泽,活动减少,模型组小鼠最为严重。造模10天过程中,除正常对照组外,每组皆有小鼠死亡,死亡时间集中在造模开始后的第1～3天,而高剂量组两只小鼠的死亡时间为造模第7天,高剂量明显降低小鼠死亡率,结果见表1。表1结果可以看出给药组可以减少小鼠的死亡数,并能同时延迟小鼠的死亡时间。2.2表2显示了京尼平剂对酒精性肝损伤大鼠血清中alt和ast的影响从表2可以看出,酒精对小鼠肝细胞造成了损伤,凯西莱能明显降低小鼠血清中ALT、AST的含量。2.3不同处理匀浆中gsh含量的比较从表3可以看出,各ig酒精组小鼠肝匀浆中GSH含量明显增加,其中模型组增加最多,与其他组比较有明显差异。给药组能显著降低肝匀浆中MDA的含量。2.4模型组与阳性组各组小鼠肝组织经石蜡切片,HE染色后在100倍光学显微镜下观察,结果如图1所示。从结果可以看出:a)正常组:肝脏结构正常,清晰可见,肝索排列大致正常;b)模型组:肝细胞肿胀,肝索排列紊乱,肝窦受压,可见血管充血和灶性坏死;c)阳性组:肝脏结构大致正常,肝细胞未见明显肿胀,但仍可见管腔充血;d)给药组:肝细胞肿胀减退,未见坏死,其中给药组大剂量效果明显。3模型小鼠肝脏生化指标变化,主要有以下几种3.1有许多资料报道过小鼠急性酒精性肝损伤模型的造模方法,如赵敏等采用一次ig50%乙醇12ml/kg,禁食12h造成了小鼠酒精性肝损伤模型。苏德奇等给予小鼠15ml/kg50%乙醇溶液,12h后造成了小鼠肝损伤。朴丽花等,给小鼠ig14mg/kg56度白酒5周造成了小鼠肝细胞的损伤,王宪龄等每日给予小鼠35度二锅头白酒16ml/kg,连续10天,末次给药后24h(禁食12h)处死,造成了小鼠肝损伤。由于资料报道中小鼠酒精给予量及给予时间均不同,本实验根据要造成进行性酒精性肝损伤必须给动物过量酒精的原则,先预试了给予酒精16ml/kg,给予时间分别为1、5、10、15、20、25、30天小鼠肝损伤情况,病理切片发现,1天时小鼠肝细胞有轻微损伤,可见部分肝细胞肿胀,10天损伤最为严重,此后的15～30天情况有所好转。原因可能是乙醇中毒的肝损伤机制之一是激活氧分子产生氧自由基导致肝细胞膜的脂质过氧化,然而脂质过氧化物作用具有明显的时间-效应关系,因为乙醇在体内的代谢特点是长期接触后乙醇脱氢酶的活性代偿性增高,机体对乙醇的耐受性增加。因此本实验选用ig10天进行造模并取得了良好的效果。3.2本文结果表明,京尼平苷能够降低酒精所致小鼠的死亡率并且延长死亡时间,这可能与药物能够促进酒精代谢及加速其分解产物的消除有关。京尼平苷对小鼠酒精性肝损伤造成的血清中AST,ALT含量的升高,给药组和模型组之间无显著性差异。有资料显示,长时间给予酒精能增加肝组织胞浆谷胱甘肽(GSH)水平,使机体解毒功能增加。从实验数据可以看出,给予酒精各组小鼠肝细胞内GSH含量都有一定程度增加。但从MDA含量来看,模型组肝细胞受损伤程度是最大的,表明模型组GSH含量虽然很高,但是依然没有能够有效的减少肝细胞受损害程度;而给药组GSH虽不及模型组的高,受损害程度却远远低于模型组,说明药物在保护肝细胞免受损害方面发挥了一定的作用。至于药物是作用于GSH产生、消耗、还原中的哪个环节,还需要进一步的机理研究。另外此次实验中给予酒精各组中GSH的含量增加而非减少与许多报道不一致,除前述原因外,也可能是因为在细胞液中产生的GSH,由于线粒体内膜的流动性被破坏,而无法被转移到线粒体中发挥作用所致。此外杨洪军等研究发现大鼠连续灌胃3天0.28g/kg的京尼平苷对肝脏产生了毒性作用,其表现为肝重增加,肝指数增大;ALT,AST活性增高,TBIL含量增加;光镜下可见明显的肝细胞肿胀、坏死,大量炎症细胞浸润等形态改变。0.14g/kg的剂量下无明显变化。本实验室前期的研究工作表明京尼平苷0.15g/