中药有效成分及其类似物对乙酰胆碱酯酶的抑制作用

中药有效成分及其类似物对乙酰胆碱酯酶的抑制作用研究鲍雅丹马林**基金项目：中山大学化学与化工学院第三届创新化学实验基金项目（批准号：02002）资助第一鲍雅丹（1980年出生），女，中山大学化学与化工学院材料化学专业99级中山大学化学与化工学院有机化学研究所，广州51027摘要本研究对从中药提取的有效成分及合成的一系列类似物进行了抑制乙酰胆碱酯酶的活性测试.发现具有苯环或共轭结构的化合物对乙酰胆碱酯酶有显著的抑制作用，特别是吲哚喹啉化合物19c的抑制效果最好(IC50=4.8μM)，可以作为治疗阿尔茨海默氏病的先导药物。关键词乙酰胆碱酯酶抑制剂IC50动力学阿尔茨海默氏病(Alzheimer’sdisease,AD)是常见的一种中枢神经系统退行性病变，发病率较高。主要临床表现为记忆、智力和识别功能的不同程度的减退或丧失,目前临床上用于改善AD患者认知障碍的药物主要是乙酰胆碱酯酶抑制剂。在大规模、多中心、双盲和安慰剂的对照试验中,这类化合物对AD病人认知能力及生活质量均有统计学显著改善。美国Warnerlamber公司开发的他克林(tacrine)[1]是一种乙酰胆碱酯酶的非竞争性抑制剂,1993年经FDA批准上市,成为第一个用于治疗AD的AChE剂类药物。此后又有数种AChE抑制剂经FDA批准上市或进入临床试验,如Velnactine、Amiridine等。但它们均有不同程度的毒副作用,这些毒副作用严重影响了它们在临床上的应用,这使得有必要开发疗效高毒副作用更小的AChE抑制剂。乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase,AChE,EC3.1.1.7.)的主要生理功能为通过快速水解神经传递介质乙酰胆碱（ACh），中止胆碱能突触中的脉冲传递，故AChE又称乙酰胆碱水解酶(acetylcholinehydrolase)[2]。CH3COOCH2CH2N+(CH3)3+AChECH3CO-AChE+HOCH2CH2N+(CH3)3CH3COO-+H++AChE为了筛选出高效、低毒的AChE抑制剂，我们参考各种AChE抑制剂的结构类型，研究了从中药山芝麻和筋骨草分离出的有效成分及其类似物对AChE的抑制作用。1实验部分1.1材料与仪器乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase,AChE,EC3.1.1.7.)、硫代乙酰胆碱(Acetylthiocholine)、5,5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)购于Sigma公司；其它试剂为分析纯试剂，未经进一步纯化。主要测试仪器：UV-2501PC型紫外光谱仪、OrionModel720A型pH计、Guntw28恒温水浴锅。1.2方法1.2.1抑制剂的制备：全合成化合物19(a-j)由本实验室周金林博士提供；化合物1-18由郭新东博士提供从中药山芝麻和筋骨草中分离的有效成分，结构如下：奋1勤浑截絮幻序爪骗啦楼拳柜呆混葛2秤胃嗓斧馆匹揉番辱差仅顽衣3夫狼授榜弟验4难辩汪灰差滋伞冤绕虫仰醉雷摇5出童叠叠皱押朽曾递变挖爽例笼呼鸟6饮7志笛少荐迁谈训纷多洋扁萝恰奸梢桐8仅鞭樱荒灰谱石语亮待顾肯茂摘汇伙9生10来寸粉蒙悠畅狮功轮1赚1吴马旋盏倒茂斥罚坊12辆浆授尤渣露恶绸航刚13计眉稀臭瞎寇撤锁14木池邪想河15孕只啄爱捕哨折1米6取昨问旋重范答省资17岛纷烈裁酸恼哈烤锯1稼8遵1.略2.吐2暑化合爽物对辈乙酰氧胆碱愤酯酶杰的抑粘制活误性测指定浇取5仙支1具.5晚m脊L分肆别装熊有8艇40社L铜0璃.1暴M室p果H父8.避0磷弯酸盐敬缓冲劈溶液霸的梨警型管礼，依此次加匙入0驱，5夹，1钓0，爆20损，3侦5，京50抓L炎1毯.0猴m顽M的贿样品区DM崖SO舅溶液至，并纵用D蔑MS蛾O补欲齐至纯总体炮积为国89幅0愧L些。分强别加镜入5预0偷明L烫4稿mg庸/m斩L率5,只5压-二技硫代夏双衰(2伴-术硝基崖苯甲絮酸舒)和碎10舰L乙撑酰胆难碱酯银酶溶耐液（跌0.读1m仅g/骨ml宁），目并在野37校℃鞠保温摸15祥m错in洲。立怪即加姓入5意0柜μ温L2牌m云g/舍mL预硫代鱼乙酰些胆碱子溶液威，摇锦匀后冠测其熔在道λ善=奔41晃2廉nm左处的昏A值脏(A掀n捉)。滔参比伟用0套.1坐M木p笔H生8.杂0磷猫酸盐钓缓冲赔溶液标。以欺未加丰样品环所测固得的督A斗co陷nt创ro绣l糖值作禁为1亦00帐个活蛾力单闲位：此相对抹酶活锋力＝竟(A开n三/忽A糠co锄nt佛ro邀l草)隐×角10墙0岁然后败以酶否的相偿对活津力对披抑制技剂浓脚度作由图，捡根据匀抑制轮曲线晕求得信各种蚀化合文物的寇IC帅50掩值（劲抑制某酶活妥力5省0％帝时的躬抑制怨剂浓敲度）榴。馆1.寻2.悬3旗乙酰喘胆碱律酯酶钢的抑赠制动傻力学暴测定山取5眉支1贡.5慢m照L分伏别装小有8近40幅，8闸55垦，8唐65沙，8餐80料，8就85饲L扇0.旋1罚M权pH锤8斗.0沙磷酸照盐缓界冲溶浑液的叫梨型伐管，泰加入血一定蹦量的辩样品翠溶液其，并重用D象MS捏O补榨齐至绒总体收积的暂5％宇。分械别加转入5槐0衡L杯4宜mg纤/m熔L鹊5,赤5遗副-二板硫代今双骡(2狱-敞硝基袋苯甲红酸订)和翼10用L乙塑酰胆盾碱酯身酶溶纱液，玉并在比37若℃差保温暴15灿m蛮in孝。立主即分苏别加朋入5肚0，我35怀，2抄5，贺10伸，5微L2哪m寿g/病mL柔硫代绩乙酰粱胆碱挠溶液饺，摇响匀后值测其泪在量λ耽=4吹12困n唇m处啦的时诞间扫种描曲幼线。它曲线闷的斜塞率即器为反唉应的眯初速怪度[李V]村，然培后以陵1/盲[V腰]对昨1/谋[S狠]作源图，博以不草加抑腔制剂剖的为予控制栽线。营2声结果奥与讨谎论刘2.吼1循吲哚圈喹啉宵生物忍碱衍疲生物劝对螺AC俘h践E苹的抑反制活供性旗表1蚊吲欣哚喹且啉衍新生物维对A琴Ch括E丧的抑涨制I昆C嫂50溪值威C赠om忧po统un失d烟X代n柄R玩IC常50尾(含M惭)躺pH折=7忽pH啦=8墓19弦a玩NH拼2容N(笑CH夹3详)牙2桌38丽42衡19梅b愈O折2赢N(包CH嗓3研)捐2下73洞89判.5贸19此c余NH缩3拾N(疑CH蹦3东)爷2率4.铺8帮41尿.5帅19候d认O尖3填N(文CH跌3咐)则2续57搜68史19往e魂N过H杰2第23槐.7朋29幸19毕f旬O瘦2斑20畏22恨19遵g谊NH袖2辉OH遥21歼30辜19配h醉O贪2番OH踪53旅76慌.5惊Co沟mp虽ou罚nd复X珠n叹R禾IC获50套(至M趣)延pH齿=7按pH永=8究19当i袍NH惩--羊--肢--朴--允46浇23龄5忌19殖j冲O奖--鸦--置--群--淹58粥16流3龄从他衣克林洞等化幼合物乒的结冷构可鸡以看凶出，汽它是驶一种灰喹啉臂衍生凤物，煌具有询三环别结构岁，而氧我们膊所合葵成的蚂吲哚外喹啉酒衍生匙物在武结构骑上与息他可枪林有证许多啊相似段之处续，为钟此我浩们研棕究了争它们青对乙森酰胆井碱酯薪酶的急抑制袜活性侧，结歇果见俊表1本。邀实验本结果坛表明仍，吲诱哚喹滚啉类湾衍生增物（姥19刻a-痰19踩j）值对乙朵酰胆经碱酯线酶均宾有明夺显的字抑制离作用帽，化隆合物傅19稳c的导抑制舅效果朗最好轨(司IC佩50杰=4壶.8野M汁)编。五首元环扁上X博原子杠为N押H的题抑制胖效果租比O撑好，茎原因片是N戒H可装增加梁环的娃共轭扬性，椅使四乔个环谎在一葛个平就面上紧；而敢O使税环面敬不在坊同一雄个平查面上舟，增垄加了芬空间嚷位阻然，对魔酶的闭抑制缴作用逼降低酿。化欧合物享19获c比校19学a侧捷链上千多了袖一个简碳原貌子，捞抑制宪酶效授果增铺强，晨说明膜碳链嫂的长患短对炼抑制贺活性回起作扇用。到另外代，抑阴制剂岸侧链已上有氏亲脂歇性的铜阳离预子头考能更课好的皆被酶稿的作柱用位啄点吸通附而纯较好弟地抑物制酶膊的活鼠性，划化合说物1贩9b跃，1县9e分的抑盛制活崭性都墓没有它19胡c好胀可能劲是由搏于1没9b佣的羟船基不毅易以货正离毙子形搁式存去在，对而1嫁9e饰苯酚氏不是惕脂肪脂族侧绒链，振且位浆阻较凡大，浓也没融有阳买离子征头，栏较难叼产生避抑制承作用竖。此罚外，渔该系励列化逝合物蓄的p久K运a板值都更在8遣左右愿。p爬H＝轻7时蓬化合矿物以算盐的猾形式赏存在芹，环尝上的伞N带孙正电唉荷；码pH匹=8男时化拢合物刊没有舰成盐便，不晌能很催好抑祸制酶幻的活留性。泼可以币看到减上表汗中所系有化护合物蛙都在逮pH各＝7膨的酸片碱体棉系中快有更余好的才抑制踢效果接。野由以塌上讨臣论，泊我们属可得者出以华下几缺个影挺响抑惭制剂指抑制耻活性月的因娱素：掀（1惜）分贴子中绣心存瓜在一发个吲训哚喹印啉的过共轭武环；液（2犁）侧年链上枕存在维一个陆亲脂份性阳艇离子滴头；猴（3蹈）脂截肪族萌侧链敌大于础两个朴C原辜子；盛（4邻）合罚适的辽体系初pH个值。刻2.妖2辛中药魄有效逃成分廉（化即合物兴1-层18邀）对句A竭Ch茶E煮的活姿性抑吴制莫由表公2可秘以看暗出，牵五环相三萜抱类化仅合物步4服、酿5错、填6恒和眠7旬具有威较好移的活戒性，临与这秒些化槽合物陵的大班分子苹结构穷有关甜，其快中化槽合物篇5的逆抑制柳活性豆最好赖(证IC凑50汗=循13言.处2立M樱)尸，可闷能由倘于它花的大柿分子饺结构勒容易免和酶悦的活勤性部寇位结旧合。中其次盟是化葱合物蜓10检整个清分子架形成降了大颤共轭我结构弱，津具有训很好纺的活文性怀(拾IC吉50捉=2黎3.诱8首M猴)茫。钓合成太的醌冈类化岔合物符和中趣间体抓对A好Ch壤E码的抑冰制活妻性都井比较脏差，蜜或者缓是没队有活烧性，蚁或者寒是由竟于化鞠合物钉分子科太小棍，不河能与抓乙酰路胆碱巴酯酶情发生肃结合坏，因坑而不喝能有练效抑症制酶破的活笔性；轧而同显样是甩萘醌注结构阀的化岩合物锄具有愤较好检的活宾性，籍可能狸是化累合物潮12着中含分一个针二氢喊呋喃读环，爹使分筹子形紫成三询环的纽平面氧结构疯，扩野大了缴分子并的面敏积能究与乙慢酰胆咽碱酯提酶内倾的多扮个位鼠点作燥用，森而有酸较好扣的活谅性；阴甾醇脊8安和甾谁醇糖谷甙亚9没导有共浅轭结迹构，盘对A壶Ch右E贪没有菠抑制菜作用激。牺表2六中意药有舟效成喝分对刻AC拐h梯E抑苦制的证IC遍50爷值墙Co邻mp闯ou愁nd技IC布50炮(烈M锡)恳Co参mp傻ou喘nd涂IC宋50烂(步M须)脾1芹16乎9.昌6罩7欺77篇.8棍2卡16陶0.揭4通8戒No钻3很No身9绞No稿4逮63无.5忌13驴17党0.芽8缓5畜13世.2咐17芹16恳2.狸7霞6却55秘.6愿14涌14寇0.君8际12页28努.3匆15脾No摇10烈2洋3.嚼8这16锻No沾11库49嫩.6食18齿N洽o遥No逢表示柱没活刊性邪2.恼3果乙酰夕胆碱逮酯酶厌的抑亡制动忠力学络研究抵为了袄研究呢这些陷化合秆物对拉乙酰习胆碱豪酯酶任的抑较制动庄力学赠行为丈，我夺们选菊取了鞠化合立物1持9c或、1语9f绍、1治9g蹄、1军9i谋、5钞、伍10腔、暮17晌和1弯3进誉行实盏验。萄根据桥不同冰浓度葛的抑感制剂藏和底接物存商在下妇所测摸得的斑数据念绘制蔽的L爱in拥ew委ea般ve樱r-柄Bu装rk秃曲线膛见图叠1得。神图垄1农化堪合物挎与乙雄酰胆访碱酯件酶反毕应的自Li祝ne患we非av赛er蜻-B基ur删k图咏数据岭表明旦化合无物1茂9g断、1脖9i静、1丰0对异乙酰册胆碱校酯酶歇的抑予制为栽混和碧型抑禽制剂雕；化馋合物行19您c、铸19缴f、筋13概、1薪7为虫非竞迎争性惨抑制修剂，房与酶搬的调伤控部付位结始合；羡大分甲子化母合物渣5为铺竞争壁性抑城制剂需进入脚酶的破活性据中心挪发生哪抑制敞作用琴。丸以上悉的结正果表境明化微合物段19渗c的抚抑制驰效果郑最好超（I青C聚50兰=4般.8论M塞），选可以乖作为澡先导筝化合丧物；毒而化乒合物屯5乱（I搞C过50神=1责3.厚2莲M盘）与母目前坑临床峰用的批抑制碌剂他屑克林究（I范C奖50籍=1慢3.师0赤M坦）具转有类腿似的浆抑制远效果剧；由角于齐润敦果惰酸型杏的五若环三冷萜类葵化合给物具确有消甲炎、脖增强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