菌种保藏原理与方法

菌种保藏原理与方法第一页，共二十六页，编辑于2023年，星期一第一节菌种的衰退与复壮一、衰退的原因：

衰退（degeneration）：菌种在培养或保藏过程中，由于自发突变的存在，出现某些原有优良生产性状的劣化、遗传标记的丢失等现象，称为菌种的衰退。1、基因突变核基因突变质粒脱落（根本原因）第二页，共二十六页，编辑于2023年，星期一2、连续移代（加速退化的直接原因）3、培养和保藏条件的影响第三页，共二十六页，编辑于2023年，星期一常见的衰退现象：菌落和细胞形态的改变；生长速度缓慢，产孢子越来越少；抵抗力、抗不良环境能力减弱等。代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力下降；防止菌种衰退的方法：

①控制传代次数（一般在DNA的复制过程中，碱基的错配率是5x10-4，自发突变的频率为10-8~10-9，采用良好的菌种保藏方法，可以减少移种和传代的数）；

②选择合适的培养条件；

③采用不同类型的细胞进行传代（对丝状微生物而言，通常采用稳定的单核孢子进行接种）；

④采用有效的菌种保藏方法。二、衰退的防止第四页，共二十六页，编辑于2023年，星期一三、菌种的复壮

菌种的复壮（rejuvenation）：使衰退的菌种恢复原来优良性状。狭义的复壮是指在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和生产性能测定等方法，从衰退的群体中找出未衰退的个体，以达到恢复该菌原有典型性状的措施；广义的复壮是指在菌种的生产性能未衰退前就有意识的经常、进行纯种的分离和生产性能测定工作，以期菌种的生产性能逐步提高。实际上是利用自发突变（正变）不断地从生产中选种第五页，共二十六页，编辑于2023年，星期一菌种的复壮措施：

①纯种分离：（平板划线法、涂布法、倾注法、单细胞挑取法等）。

②通过寄主体内生长进行复壮

③淘汰已衰退的个体（采用比较激烈的理化条件进行处理，以杀死生命力较差的已衰退个体）。

④采用有效的菌种保藏方法。第六页，共二十六页，编辑于2023年，星期一第二节工业微生物菌种的保藏一、目的：

①存活，不丢失，不污染

②防止优良性状丧失

③随时为生产、科研提供优良菌种

二、原理：选用优良的纯种，（最好是休眠体，如分生孢子、芽胞等），创造降低微生物代谢活动强度，生长繁殖受抑制，难以发生突变的环境条件。（其环境要素是干燥、低温、缺氧、缺营养以及添加保护剂等）

第七页，共二十六页，编辑于2023年，星期一

菌连续在培养基上（内）移种种生活态传代培养保藏法连续在活宿主上（内）移种保固体斜面藏湿法半固体琼脂柱方休眠态液体介质（蒸馏水、糖液、其它溶液）法干法藏在玻璃管内吸附在合适的载体上三、菌种保藏的方法第八页，共二十六页，编辑于2023年，星期一1、冷冻保藏法

方法：菌种管低温保藏，定时传代

原理：低温下，微生物代谢强度明显下降。

冷冻保藏为保藏微生物菌种的最简单而有效的方法。通过冷冻，使微生物代谢活动停止。一般而言，冷冻温度愈低，效果愈好。为了获得满意的冷冻结果，通常应在培养物中加入一定的冷冻保护剂。冷冻保藏时温度要求在-20℃以下，同时应认真掌握好冷冻速度和解冻速变。冷冻深藏的缺点之一是培养物运输较困难。第九页，共二十六页，编辑于2023年，星期一冷冻保藏种类

①

普通冷冻保藏技术(-20℃)②

超低温冷冻保藏技术(-60一-80℃)③

液氮冷冻保藏技术第十页，共二十六页，编辑于2023年，星期一普通冷冻保藏技术(-20℃)将液体培养物或从琼脂斜面培养物收获的细胞分接到试管或指管肉，然后贮藏于一冰箱的冷藏室中，或于温度范围在-5～-20℃的普通冰箱(-20℃)中。或者，将菌种培养在小的试管或培养瓶斜面上，待生长适度后，将试管或瓶口用橡胶塞严格封好，同上置于冰箱中保存。用此方法可以维持若干微生物的活力1—2年。第十一页，共二十六页，编辑于2023年，星期一应注意的是经过一次解冻的菌株培养物不宜再用来保藏。保藏过程中应注意控制保藏温度，培养瓶或试管应严格密封。这一方法虽简便易行，但不适宜多数微生物的长期保藏。第十二页，共二十六页，编辑于2023年，星期一超低温冷冻保藏技术(-60一-80℃)

要求长期保藏的微生物菌种，一般都要求在-60℃以下进行保藏。在超低温冷藏柜中保藏菌种的一般方法是：

1．离心收获对数生长中期至后期的微生物细胞；

2．用新鲜培养基重新悬浮所收获的细胞；

3．加入等体积的20％甘油或10％二甲亚砜；

4．混匀后分装入冷冻指管或安瓿中，于-70℃超低温冰箱中保藏。第十三页，共二十六页，编辑于2023年，星期一如果待保藏菌种生长在斜面上，则可用含10％甘油的新配制液体培养基洗涤收获。超低温冰箱的冷冻速度一般控制在1-2℃／min。若干细菌和真菌菌种可通过此保藏方法保藏5年而活力不受影响。第十四页，共二十六页，编辑于2023年，星期一液氮冷冻保藏技术

冷冻保护剂在液氮冷冻保藏中，最常用的冷冻保护剂是二甲亚砜和甘油，最终使用浓度一般为甘油10％、二甲亚砜5％。所使用的甘油—般用高压蒸汽灭菌，而二甲亚砜最好为过滤灭菌。第十五页，共二十六页，编辑于2023年，星期一液氮冷冻保藏微生物菌种的步骤

1．待冷冻保藏菌种悬液的制备

(1)从生长斜面制备菌悬液：每一斜面加入5ml含10％甘油的营养液体培养；用巴氏吸管吹吸斜面制成孢子及菌体细胞悬液；0.5～lml分装玻璃安瓿或液氮冷藏专用塑料瓶，

(2)从浸没培养物制备菌悬液：在浸没培养液中加入等体积20%无菌甘油；轻轻振荡混匀培养液，如果菌体絮凝较紧，则需先用玻璃珠打散；0.5-lml分装玻璃安瓿或液氮冷藏专用塑料瓶，玻璃安瓿用酒精喷灯封口；将所有封好的安瓿置于5℃冰箱中3min，以使细胞和悬浮培养基之间达到平衡。第十六页，共二十六页，编辑于2023年，星期一2．控速冷冻．(1)将安瓿或液氮瓶置于铝盒或布袋中，然后置于一较大的金属容器中；(2)将此金属容器置于控速冷冻机的冷冻室中；(3)以1-2℃/min的致冷速度降温，直到温度达到相对温度之上几度的细胞冻结点(通常为-30℃)；(4)补加一定量的液氮至系统中，使细胞在冻结点时尽可能快地发生相变；(5)细胞冻结后，将致冷速度降为1℃/min，直到温度达-50℃；(6)将安瓿迅速移入液氮罐中于液相(-)96℃)或气相(-156℃)中保存。如果无控速冷冻机，则一般可将安瓿或液氮瓶置于一70℃冰箱中冷冻4h，然后迅速移入液氮罐中保存。第十七页，共二十六页，编辑于2023年，星期一3.复苏A从液氮罐中取出所需的安瓿，立即置于冰浴中；B迅速将安瓿置于37-40℃水浴中，并轻轻摇动以加速解；C用巴氏吸管将安瓿中贮存培养物移接入含有2m1无菌液体培养基的试管中，用同一支吸管反复抽吸数次，然后取0.1-0.2ml(约4、8滴)转接入琼脂斜面上。第十八页，共二十六页，编辑于2023年，星期一3.干燥保藏法将菌种置于土壤、细纱、滤纸、硅胶等干燥材料上保藏。如砂土管法，适用于放线菌、芽孢菌和某些真菌保藏，保藏时间几至几十年。2.石蜡油低温保藏法：

橡皮塞取代棉塞、加石蜡油。4.真空冷冻干燥法加有保护剂的菌悬液在冻结状态下予以真空干燥。适用于各种微生物，便于大量保藏，菌种存活时间长，是目前最好的保藏方法。第十九页，共二十六页，编辑于2023年，星期一5

基因工程菌的保藏由载体质粒等携带的外源DNA片段通常是遗传不稳定的、且很易丢失其外源质粒复制子。质粒基因通常为宿主细胞生长非必需。一般情况下当细胞丢失这些质粒时，生长速度会加快。第二十页，共二十六页，编辑于2023年，星期一当培养基中加入抗生素时，抗生素提供了一有利于携带质粒的细胞群体的极有用的生长选择压。而且在运用基因工程菌进行发酵时，抗生素的加入可帮助维持质粒复制与染色体复制的协调。建议基因工程菌应保藏在含低浓度选择剂的培养基中。第二十一页，共二十六页，编辑于2023年，星期一菌种保藏机构的任务：广泛收集科研和生产菌种、菌株，并加以妥善保管，使之达到不死、不衰、不乱以及便于研究、交换和使用的目的。菌种保藏机构：

中国微生物菌种保藏委员会(CCCCM)

中国工业微生物菌种保藏管理中心(C