Bt伴胞晶体毒蛋白的结构功能和应用

Bt伴胞晶体毒蛋白的结构功能和应用第1页/共73页

Bacillusthuringiensis(Bt)SporulatedcultureCrystal第2页/共73页1901年，日本学者石渡首次从染病的家蚕中分离出该菌，并证明它对部分鳞翅目昆虫有杀虫活性。1915年，Berliner再次发现并依其发明地点德国苏云金省而定名，于1938年在法国正式成为商品。随着人们认识的加深，现已证实，苏云金芽胞杆菌对鳞翅目、鞘翅目、双翅目、同翅目、直翅目、食毛目等10个目的500多种昆虫以及原生动物门、线形动物门、扁形动物门、疟原虫、血吸虫、瞒类等有不同程度的杀虫活性。

第3页/共73页苏云金芽胞杆菌能产生7种毒素蛋白δ-内毒素α-外毒素β-外毒素γ-外毒素不稳定外毒素水溶性毒素鼠因子外毒素CryⅠCryⅡCryⅢCryⅣCryⅤ-ⅥCyt第4页/共73页第5页/共73页Bt是世界上目前应用最广泛、最成功的微生物杀虫剂,也是公认的无公害生物农药，其优点很明显：

1.对病虫害防治效果好

2.对人畜安全无毒

3.环境风险性低

4.能保持生态平衡

5.不杀死害虫的天敌和益虫

6.生产原料和有效成分属于天然产物目前在农田害虫、森林害虫及卫生害虫的防治中Bt己成为化学合成农药的有力替代品，Bt还是转基因抗虫工程植物重要的基因来源。而且随着研究的深入，研究者们又分离到了其对癌细胞有特异的毒杀作用而对正常细胞则无毒杀作用的菌株，进一步拓展了苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白的生物活性谱和生物学功能。第6页/共73页

但是目前也已有多种昆虫对Bt毒素产生了不同程度的抗性，一些昆虫甚至还能在转Bt基因植物上完成整个生活史。昆虫对Bt的抗性已成为阻碍Bt生物杀虫剂的持续使用和转Bt基因植物广泛种植的潜在危险。

我们只有继续深入研究Bt晶体毒素蛋白的结构功能和与受体的相互作用，才能逐步揭示昆虫产生复杂抗性机制的原因,才能更好更有效的利用这一机理构建高效、广谱的生物杀虫剂，利用这一宝贵的生物自然资源，显示苏云金芽胞杆菌更广阔的应用前景，可见对于Bt毒蛋白的研究具有重要的理论意义和经济价值。第7页/共73页

毒素蛋白的基本特征和分类毒素蛋白的结构和功能毒素蛋白和异源基因的克隆以及工程菌的构建毒素蛋白与昆虫的作用机制苏云金芽胞杆菌蛋白质组学研究本实验室主要研究内容：第8页/共73页

编码杀虫晶体蛋白的基因在苏云金芽胞杆菌表达产生的Bt杀虫晶体蛋白，以一种前体的形式存在于菌体内，称为原毒素(Protoxin)，能自发形成伴胞晶体。晶体的形成可能在一定程度上防止了杀虫蛋白在环境中的降解。不同种类的杀虫晶体蛋白可以存在于同一块伴胞晶体中。这些伴胞晶体通常有一定的几何形状，一般规律是Cry1类型形成双锥形的晶体；Cry2类型一般形成立方型的晶体；Cry3基本上形成菱形的晶体；其他种类的杀虫蛋白还可形成其他的晶体形状，如卵形、等。1.毒素蛋白的基本特征和分类1.1毒素蛋白的基本特征第9页/共73页米粒状晶体

B.thuringiensisYBT-15181.1毒素蛋白的基本特征球形晶体B.thuringiensisM15菱形晶体第10页/共73页

1989年Hofte和Whiteley根据晶体蛋白的氨基酸序列和杀虫谱的不同，将已经发表的42种晶体蛋白分为5群14亚类。

其中具有溶血溶细胞作用的27kDa晶体蛋白基因被命名为cyt基因，其他只有杀虫活性的13亚类命名cry基因。cry基因可划分四群，即cryI为鳞翅目特异性，cryⅡ为鳞翅目和双翅目特异性，cryⅢ为鞘翅目特异性，cryIV双翅目特异性。1.2毒素蛋白的分类第11页/共73页

由于当时发现的基因数目少，彼此之间有明显的差异，因此各个基因的分类地位比较明确，从而使得Hofte和Whiteley的分类系统被广泛的接受和采用。近年来，不断发现的杀虫晶体蛋白及其基因使得原先分类系统中的氨基酸序列与杀虫活性间产生了不协调性，而且随着新基因的发现，这种分类方法越来越不能满足这两个条件，使得分类难以确定。

截止2007年4月2日,这些基因按其核苷酸序列的同源性已被分为cry1-cry51、cyt1、cyt2共53类,396种,cry基因372种,cyt基因24种。1.2毒素蛋白的分类第12页/共73页

鉴于这一分类系统在同源性和杀虫谱之存在冲突，1995年,在国际无脊椎病理学会年会上成立的由N.Crickmore等组成的杀虫晶体蛋白基因命名委员会提出只根据氨基酸序列的同源性进行分类。

这个系统利用计算机比较晶体蛋白氨基酸序列的同源性，以45%、78%和95%为界，将基因划分为四个分类等级，依次用阿拉伯数字、大写英文字母、小写英文字母和阿拉伯数字表示。1.2毒素蛋白的分类第13页/共73页

现在发现的116个杀虫蛋白基因，分别分布于Bt不同菌株中。不同血清型、不同亚种之间，其基因数和种类有明显差异。同一菌株的杀虫晶体蛋白基因，也可能定位于不同的质粒上；或者多个晶体蛋白基因定位于同一质粒上；而有的则定位于染色体上，或同时存在于质粒和染色体上。1.3毒素蛋白在Bt中的分布第14页/共73页

大部分的苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因各编码含一个60kD左右的胰蛋白酶抗性中心，分子量为130-160kD的蛋白。晶体蛋白中杀虫活性部分位于晶体蛋白N-末端的胰蛋白酶抗性中心,而C-末端对于维持蛋白的晶状结构具有非常重要的作用。

目前已通过多对同晶置换法X-衍射晶体图谱确定了一些晶体蛋白的三维结构，本研究室利用同源建模的方法获得了Cry5Ba的理论三维模型。与确定三维结构的晶体毒素进行比较，发现它们的三维结构很相似，都是由三个典型的结构域组成拓扑学结构。2.毒素蛋白的结构和功能第15页/共73页

对Cry毒素结构和功能的的研究离不开一些常用的生物信息学软件，例如Swiss-PdbViewer，Pymol。Cry5BaCry1Aa2.毒素蛋白的结构和功能第16页/共73页Swiss-PdbViewer显示Cry蛋白三维模型IIIIIIPymol显示Cry蛋白三维模型2.毒素蛋白的结构和功能第17页/共73页Pymol预测蛋白质表面相对静电荷2.毒素蛋白的结构和功能第18页/共73页Molsoft预测cry蛋白活性位点2.毒素蛋白的结构和功能第19页/共73页

结构域Ⅰ位于肽链的N端,是一组由6-7个两亲的α螺旋围绕着一个疏水的α螺旋形成的α螺旋束，参与了细胞膜的穿孔。人们利用蛋白质及脂膜相互作用的生物化学原理，通过对多个毒素蛋白三维结构比较和功能分析，并提出了如下模型：

2.毒素蛋白的结构和功能2.1结构域Ⅰ：第20页/共73页

该模型由Hodgman提出。该模型被认为α5螺旋和α6螺旋最可能是孔形成的结构单位，这是完全基于亲水脂螺旋的疏水表面积来推测的。α5螺旋和α6螺旋连在结构域Ｉ的端点，离膜最远。因此，在作用于膜时，这两个螺旋必须象打开的铅笔刀一样从结构域Ｉ中伸出，插入脂双层膜。这样一个模型不需要结构域Ｉ中其它α螺旋的重排，一个亲水离子通道将由多个毒素分子寡聚体通过相同的作用方式排成一个圆而形成，如图：

2.1.1“铅笔刀”模型：第21页/共73页

Li等人根据ICPs可能所共有的三维空间结构提出了“伞模型”。依照这个模型，α6和α7螺旋或α4和α5螺旋形成一个发夹结构，处在结构域Ｉ的边沿，最接近于质膜。当其它的螺旋在膜表面象伞架打开时，这一对螺旋将比较容易插入脂双层膜，如图：伞状模型2.1.2“伞状模型”：第22页/共73页

Gazit等分析了α5螺旋片段提出了一个新的修饰模型。作为“伞状模型”的补充，“α5螺旋六聚体”模型认为，由于α5螺旋在所有的ICPs中都是高度保守的，而且在体外它能够在平面脂双层膜上形成孔道，因此认为α5螺旋可通过一个六聚体形式，即α5螺旋的亲水侧向内，亲脂侧向外组成一个亲水离子通道，镶嵌在脂双层中间形成离子通道。2.1.3“α5螺旋六聚体”模型：第23页/共73页

位于肽链的中间，为三组以“希腊钥匙”（Greekkey）拓扑结构连接在一起的反平行的β折叠片层，具顶端突环，该凸环在不同的毒素中，其长度和氨基酸序列不同，参与了毒蛋白与受体蛋白的结合，决定着毒素作用于昆虫的特异性。结构域Ⅱ是最容易在长度和氨基酸序列上发生变化的区域。2.2结构域Ⅱ：第24页/共73页

位于C端，是由两组反平行的β折叠片层组成的夹心结构，以“果酱卷”（Jellyroll）拓扑结构排列。其功能目前了解较少。有人推测其可能能够防止蛋白酶对晶体蛋白分子的过度降解，稳定晶体蛋白整体结构，决定杀虫晶体蛋白专一性。有证据显示其与维持蛋白结构的稳定性、通过与结构域Ⅰ接触调节离子通道的电流以及特异受体的识别和结合有关。2.3结构域Ⅲ：第25页/共73页

研究显示,Bt毒素的不同结构域在一定程度上互相作用,互相影响。常用的研究方法是对某结构域进行突变。例如,结构域Ⅰ的突变影响与受体的结合,结构域Ⅱ的突变能在不影响与受体结合的情况下影响其毒力,Cry3A的结构域Ⅱ上环3发生突变降低了亲和力却增加了毒性,结构域Ⅲ的一段保守区域发生突变能影响毒力和孔道形成。同时,还可以通过交换各个毒素蛋白的各个结构域的编码区，表达杂合蛋白基因，分析杂合毒素蛋白的功能，从而阐明毒素结构域之间的相互作用。2.4三个结构域之间的相互作用第26页/共73页

总之，晶体蛋白毒素与昆虫中肠细胞上的专一性受体蛋白相互作用,并在细胞膜上形成孔道这一过程,是毒性多肽的各个结构域共同完成的，不同结构域起着不同的作用。但是由于毒性多肽与受体蛋白的结合并不是简单的一一识别作用,还表现出多样性和复杂性。因此很难对毒性多肽结构域的功能作单一的描述。第27页/共73页

虽然Cry毒素是一种应用很广泛的杀虫剂，但其作用机制至今还没被了解透彻。目前普遍认为Bt毒素蛋白通过与受体结合而在昆虫中肠细胞形成孔道，插入膜并最终导致昆虫死亡，其作用模式是：

①晶体被靶标昆虫吞食后在昆虫的碱性中肠中溶解成原毒素；②中肠中存在的蛋白酶对原毒素进行消化，并释放出活性多肽；③活性多肽与中肠膜受体结合；④活性多肽插入中肠细胞表皮膜形成离子通道或孔道，使中肠肠道细胞的渗透平衡遭到破坏，导致昆虫发生肿胀、厌食而死亡。3.毒素蛋白与昆虫的作用机理3.1毒素蛋白与昆虫受体的相互作用模式：第28页/共73页

在这一模式中，Bt-R1和GPI锚定蛋白是重要参与者。CryA原毒素进入中肠被活化后与受体Bt-R1结合，这有利于毒素N端裂解消除α-1螺旋，形成毒素聚合体，然后聚合体与第二受体APN结合，使之插入细胞膜脂质筏，形成孔道。另一GPI锚定蛋白受体ALP（Alkalinephosphatase）也能协助聚合体插入脂质筏。如图：3.1毒素蛋白与昆虫受体的相互作用模式：第29页/共73页

最近又有研究者提出了一种信号传导模式，即蛋白与受体的结合激活了G蛋白和腺嘌呤环化酶，提高了cAMP水平，激活了蛋白激酶A，从而导致昆虫致死。此外，还有研究者提出，除了Cry毒素破坏昆虫中肠细胞外，还有其他的中肠细菌使昆虫产生败血症。

在第一种模式中，形成毒素聚合体是细胞死亡的关键因素，而在第二种模式认为，只有Cry毒素单体与Bt-R1结合后毒素才能产生毒性作用，而与APN和ALP结合并非Cry毒素产生毒性的重要因素。

前两种作用模式中，毒素蛋白与昆虫受体的结合都是决定其杀虫活性的一个关键步骤，因此深入研究毒素蛋白与受体相互作用对探讨毒蛋白功能和杀虫机理具有非常重要的作用。

3.1毒素蛋白与昆虫受体的相互作用模式：第30页/共73页

毒素与受体作用机理模式图第31页/共73页

关于受体的研究近年来取得了很大的发展，已知在不同的昆虫体内有不同的受体结合蛋白，其中主要是一些120-180kD的糖蛋白，此外，还有一些非糖蛋白的受体结合蛋白，目前已经发现的昆虫中肠Bt毒素受体结合蛋白主要包括氨肽酶（APN）和类钙粘蛋白家族，碱性磷酸酶、多种糖脂、肌动蛋白等也被证明是昆虫中肠Bt毒素受体结合蛋白。

3.2毒素蛋白受体：第32页/共73页

所有鳞翅目昆虫中肠上皮细胞都含有丰富的氨肽酶，它属于锌依赖性多肽酶家族，具有锌指结构和N连接的糖基化位点(Asn-X-Ser/Thr)，以糖偶连的磷脂酰肌醇(GPI)与昆虫中肠的刷状缘膜相连，它含有His357、His361、Glu380和Glu358保守位点，其中His357、His361和Glu380是锌离子配体，Glu358与酶的催化作用有关。

3.2.1APN(aminopeptidaseN)第33页/共73页

某些昆虫中肠上一些种类的APNs可与Cry1A家族的3种毒素Cry1Aa,Cry1Ab和Cry1Ac都发生特异性结合,但是结合位点不同。烟草天蛾的120kDAPN与三种毒素都能发生特异结合，但Cry1Aa和Cry1Ab与APN的结合的位点都只有1个,分别位于活性毒素的结构域Ⅱ和APN的位点2。Cry1Ac与APN的结合位点却有2个,1个位于毒素结构域Ⅱ和APN的位点2,另1个位于毒素结构域Ⅲ和APN的位点1。而有些APN却只能与某一种Cry1A毒素发生特异性结合。舞毒蛾BBMV的APN只与Cry1Ac毒素结合,不与Cry1Aa和Cry1Ab毒素结合。3.2.1.1APN受体结合的毒素种类第34页/共73页

目前已通过原子力显微镜观察到了APN受体介导毒素在质膜上形成的孔道。Ellar等用纯化的烟草天峨的BBMV上的APNl与脂质构建了人工脂质体膜囊,采用表面胞质共振技术研究了Cry1A毒素与人工膜囊的结合,结果表明每个APN受体分子附近插入了约3个毒素分子,这提示APN介导一分子Cry1A毒素插入质膜后,就脱离这个毒素分子重新与下1个毒素分子结合,引导更多的毒素分子插入质膜。3.2.1.2APN受体对毒素插入质膜的介导第35页/共73页

昆虫中肠APN受体位点密度的提高可以增强Cry1A类毒素对鳞翅目昆虫的毒力。某些昆虫中肠BBM上被其他分子掩埋的APN受体在非变性条件下不能与毒素结合。

昆虫中肠APN受体非共价结合的中性脂类可提高Bt毒素的毒力3.2.1.3昆虫中肠APN受体与Bt杀虫毒力第36页/共73页Vadlamudi等首次在烟草天蛾中BBMV上发现了Cry1A毒素的一种受体与钙粘蛋白的结构很相似,称为类钙粘蛋白。它是一类钙依赖性的跨膜糖蛋白,它介导细胞之间互相粘附,并参与细胞的增殖与分化。类钙粘蛋白从N端至C端依次是信号肽序列,数个数量不等的重复子（repeat,9～12个）一个近膜区,一个跨膜区和一个较小的胞质区。整个分子胞外区有15个N糖基化位点,胞内区只有一个潜在糖基化位点。3.2.2类钙粘蛋白(Cadherin-like)第37页/共73页

受体类钙粘蛋白与Bt毒素的亲和力很高，大小为0.7-3.0Nm，远大于氨肽酶N等与毒素的亲和力。类钙粘蛋白受体近膜区域邻近的重复子区域是与Cry1毒素蛋白结合及形成穿孔的关键区域。但不同昆虫的类钙粘蛋白受体与Bt杀虫蛋白的结合部位并不完全相同。棉铃虫中肠类钙粘蛋白结构模型

3.2.2类钙粘蛋白(Cadherin-like)第38页/共73页

昆虫的碱性磷酸酶分布有限，主要在中肠组织中。昆虫体内存在膜结合(membranebound,mAlp)和可溶性(solubleform,sAlp)2种碱性磷酸酶。昆虫Alp的结构特征主要以单体的亚基结构存在；分子量约60kD；能够被L-半胱氨酸抑制。昆虫体内的mAlp和sAlp受同一染色体上不同的基因控制。mAlp具有较高的稳定性和多形性，被认为是昆虫中肠细胞生成的，其抗消化液的能力高于sAlp。昆虫mAlp受体是金属离子依赖性酶，具有N-乙酰半乳糖胺，其C端含一个疏水的膜锚定区，通过GPI锚定在BBMV上，参与Bt毒素对昆虫的作用，毒素蛋白与mAlp特异性互作，导致磷酸酶活性受到抑制

。3.2.3碱性磷酸酶（Alkalinephosphatase，ALP）第39页/共73页

现在可以证明两种蛋白（类钙粘蛋白和APN）是Bt毒素的受体,但是在中肠膜上还存在着许多物质可以作为毒素的受体。如有报道肌动蛋白和多种糖脂也可以和Cry1Ac发生特异性的结合。3.2.4其他的毒素受体Glyco-conujgatereceptor第40页/共73页

由于过度使用农药给生态环境和农产品出口等领域带来诸多问题。目前，人们更倾向于对生物防治领域的开发，Bt制剂也应运而生；它是开发历史最久，应用最成功的微生物杀虫剂。它具有对人畜和非靶标生物安全、环境兼容性好和不易产生抗性等优点，因此占据了生物农药90%以上的市场。4.Bt毒素蛋白的应用4.1Bt在农业生产中的应用

第41页/共73页

Bt的主要产品剂型蔬菜水剂，撒粉剂水稻油剂，粉剂林木油剂，粉剂卫生漂浮粒剂4.1Bt在农业生产中的应用

第42页/共73页棉花蔬菜水稻林木玉米蚊子其它Bt的主要市场4.1Bt在农业生产中的应用

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主要防治对象小菜蛾菜青虫棉铃虫玉米螟稻螟松毛虫蚊子幼虫

4.1Bt在农业生产中的应用

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Bt除了用于传统农业害虫的防治外，它的应用领域还扩展到防治蜜蜂病虫害。由于部分Bt菌株对鳞翅目害虫具有较强的毒杀作用，因此人们可以利用Bt制剂防治蜜蜂的敌害——大蜡螟。大蜡螟属鳞翅目，螟蛾科；它们是世界性害虫，也是蜜蜂最重要的敌害，每年给世界专业养蜂者造成严重的损失。大蜡螟在美国、南非和菲律宾等国造成蜂群经常性的逃亡；在我国造成的损失尚无准确估计，它们对东方蜜蜂的危害较西方蜜蜂严重。大蜡螟的幼虫称为巢虫，又称隧道虫和绵虫；由于幼虫取食巢脾，因此大蜡螟是在幼虫期危害蜂群，经常造成蜂群内的“白头蛹”，严重时白头蛹可达到全部子脾的80%以上。危害轻者影响蜂群的繁殖力，重者造成蜂群的飞逃；通常是弱群更易受到危害，巢虫会在一个月内将整个蜂巢彻底毁掉。4.1Bt在农业生产中的应用

第45页/共73页1999年，Mizuki等报道提出一些未知毒素活性的Cry蛋白对各种脊椎动物细胞包括人体癌细胞具有细胞溶解作用。这类蛋白被称之为“抗癌晶体蛋白”。2006年，日本几位研究者在B.thuringiensisM15中分离和鉴定到了一种新的毒素蛋白基因--cry31Aa2，经实验研究证实，该毒素蛋白对叶螨无毒性，但经胰蛋白酶活化后，对一些人类癌细胞有特异杀伤性作用，而对正常细胞不起作用。4.2Bt毒素在抗病方面的应用第46页/共73页白血病T细胞正常T细胞肝癌正常肝细胞4.2Bt毒素在抗病方面的应用Cellsurvival%Toxinproteinsμg/mLCellsurvival%Toxinproteinsμg/mLToxinproteinsμg/mLToxinproteinsμg/mLCellsurvival%Cellsurvival%第47页/共73页白血病T细胞宫颈癌细胞4.2Bt毒素在抗病方面的应用Cellsurvival%Toxinproteinsμg/mLCellsurvival%Toxinproteinsμg/mL第48页/共73页

苏云金芽胞杆菌存在的杀虫谱窄、持效期短等缺陷，严重影响了苏云金芽胞杆菌的实际应用。针对这些问题，常用的解决办法是利用分子生物学技术鉴定和克隆新的具有杀虫活性的毒素蛋白基因，通过定点突变提高毒素基因毒性，或是利用基因工程、结合转移等手段构建新的或具有多重杀虫功效的苏云金芽胞杆菌。4.3利用分子生物学技术定向进化毒素蛋白基因第49页/共73页

根据cry2类基因保守序列，设计合成引物，以菌株Bt140为模板扩增获得新基因cry2Ac6（Genank登录号：DQ359137）,并在苏云金杆菌无晶体突变株和BL21中表达，如图：4.3.1新的毒素基因的鉴定与克隆

4.3.1.1Bt140菌株中cry2Ac6新基因的克隆：第50页/共73页

通过查阅文献资料，获得11对扩增Bt中cry类基因的通用引物。Bt4.0718菌株为模板做菌落PCR，初步扩增获得cry1;cry2;cry1I三种基因，如图：

4.3.1.2Bt4.0718中其他功能基因的扩增第51页/共73页

将Cry1AaC-端区域812和814位的Cys突变成Ala，由此得到的突变菌株产生的包涵体在相同条件下比原始菌株具有更好的溶解性，这将使中肠液pH值降低后产生抗性的害虫重新对Bt杀虫剂敏感。突变株HT550(F550A)也能够有效表达Cry1Aa毒蛋白，但不能形成正常晶体，也几乎不产生芽胞。突变菌株生测结果表明（右图所示：）

4.3.2.利用生化和分子生物学技术定向改造毒蛋白4.3.2.1利用基因定点突变技术，提高毒蛋白杀虫毒力第52页/共73页

同时对Cry1Ac蛋白β18-β19loop上的7个残基进行丙氨酸扫描突变，对所有突变子（N543A、W544A、G545A、N546A、S547A、S548A、I549A）进行生测和三维结构分析，发现W544和N546残基为该loop上的关键位点。对N546进一步突变分析，发现N546A（LC50为1.67μg/mL）对棉铃虫毒力比野生型Cry1Ac（LC50为为2.98μg/mL）提高了1.78倍(图B)4.3.2.1利用基因定点突变技术，提高毒蛋白杀虫毒力第53页/共73页Cry蛋白中β18-β19loop的结构与序列比对4.3.2.1利用基因定点突变技术，提高毒蛋白杀虫毒力第54页/共73页Cry1Aa蛋白结构，β18-β19loop及与其相邻的残基4.3.2.1利用基因定点突变技术，提高毒蛋白杀虫毒力第55页/共73页

利用易错PCR技术扩增出cry1Ac片段，将PCR产物纯化回收，进行TA克隆，转化E.coliTop10感受态细胞，筛选阳性转化子。所获PCR产物纯化回收，连入载体pET28a，成功构建了毒素基因cry1Ac核心区改组文库。将其转入E.coliBL21进行表达。如图：4.3.2.1利用基因定点突变技术，提高毒蛋白杀虫毒力第56页/共73页Bt4基因组易错PCRCry1AcPCR回收TA克隆筛选PCR回收pET28aBL21表达毒素基因cry1Ac核心区改组文库4.3.2.2通过易错PCR和DNAshuffling定向改造毒蛋白，提高毒力第57页/共73页

通过对1800个阳性克隆进行了SDS检测，对能进行蛋白表达并表达量较多的突变子进行下一步的研究（如下图所示）。研究表明只有1个转化子(T524)能够检测到大量蛋白表达。利用含有同源臂的引物（在引物中添加酶切位点以助于筛选）从突变子中扩增毒素基因cry1Ac的核心区，利用Red/ET同源重组技术替换pHAc35中的核心区，并转化大肠杆菌GB2005。将突变质粒转化无晶体突变株cry-B，SDS检测蛋白表达，并通过光学显微镜观察晶体形成情况。突变子T524的生物检测结果表明，其对甜菜夜蛾的毒力比突变前提高了1.46倍。突变子的表达1、对照Cry-B(1Ac）2、突变子T524N3、Cry-B阴性对照M、Maeker4.3.2.2通过易错PCR和DNAshuffling定向改造毒蛋白，提高毒力第58页/共73页

此外，利用生物信息学软件从基因组中寻找候选沉默基因簇，通过Red/ET同源重组工程技术对沉默基因簇进行克隆并激活野生菌株中难以表达或表达量不高的沉默基因簇，使其异源表达。利用分子计算机软件技术优化其发酵条件，提高产量。4.3.2.2通过易错PCR和DNAshuffling定向改造毒蛋白，提高毒力第59页/共73页

利用PCR技术从苏云金杆菌4.0718菌株的质粒上扩增获得

vip3基因的ORF序列（GenBank登录号：DQ497637），与增强型绿色荧光蛋白基因egfp融合后，在Bt无晶体突变株Cry-B中进行表达，并在荧光显微镜下检测其表达情况，如图：16小时32小时对照vip3基因在Bt无晶体突变株XBU001中的表达4.3.3工程菌构建4.3.3.1Bt4.0718中vip基因的克隆表达及重组杀虫工程菌构建第60页/共73页

目前本实验室已成功将烟草几丁质酶基因tchiB，虎纹捕鸟蛛毒素基因hwtx-XI，澳大利亚漏斗网蜘蛛蛛毒基因ω-ACTX-Hv1a，海葵神经毒素毒素Av3等基因成功转入Bt，与Cry1Ac融合表达。4.3.3.2携带异源毒素基因的Bt工程菌的构建pH5AXI（hwtx-XI

）在Bt4.0718菌株中的表达1,Bt4.0718;2-4,Bt4.0718(pH5AXI).第61页/共73页采用EGFP抗体(A)和ω-ACTX抗体(B)对Cry1Ac-ω-ACTX-Hv1a-egfp融合蛋白的Western-blot检测

工程菌伴胞晶体的原子力显微镜检测A、Cry1-B(1Ac-ACTX-EGFP)

B、Cry1-B(1Ac）4.3.3.2携带异源毒素基因的Bt工程菌的构建第62页/共73页

为了更快地筛选具有新的杀虫特性的Bt菌株或杀虫晶体蛋白，本研究创新性地建立了一种对Bt原毒素表达谱进行鉴定的新方法。即通过包埋Bt菌株产生的晶体蛋白混合物于聚丙烯酰胺凝胶块中，结合LC-MS/MS分析胶内酶解的复合肽段，从而快速鉴定晶体蛋白中原毒素的组成。以模式菌株Bt库斯塔克亚种（Btsubsp.kurstaki）HD1菌株为对象，采用该方法检测HD1菌株晶体蛋白的组成。结果显示，采用聚丙烯酰胺凝胶块结合LC-MS/MS技术能准确检测到HD1菌株中表达的Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac和Cry2Aa蛋白。同时，本研究以杀虫基因背景很清楚的Bt以色列亚种（Btsubsp.israelensis）4Q2-72和鲇泽亚种（Btsubsp.aizawa）HD133菌株为研究对象，检测到4Q2-72菌株表达了Cry4Aa、Cry4Ba、Cry10Aa、Cry11Aa、Cyt1Aa和Cyt2Ba等6种晶体蛋白，而HD133也表达了Cry1Ab、Cry1Cb、Cry1Da、Cry1Ba、Cry1Ad和Cry1Ka6种原毒素，其中后两种原毒素还未在任何文献中见报道。5.苏云金芽胞杆菌蛋白质组学研究5.1Bt杀虫晶体蛋白质组研究第63页/共73页

通过对Bt4.0718菌株和Bt库斯塔克亚种HD-1、Bt以色列亚种H14及武汉亚种140等Bt不同亚种杀虫晶体蛋白进行双向电泳分析（如下图），通过比较发现，在相同的条件下，四种Bt菌株蛋白质斑点的分布模式非常相似。

ABCDBt4.0718（A）、Bt武汉亚种（B）、和以色列亚种H14(C)、伴胞晶体杀虫晶体蛋白的双向电泳及其Bt4.0718与HD-1杀虫晶体蛋白的gelspot的匹配图谱(D)5.2不同亚种杀虫晶体蛋白的比较蛋白质组研究第64页/共73页菌株Bt4.0718菌株、Bt库斯塔克亚种HD-1Bt以色列亚种H14武汉亚种140斑点数122±9126±11290±25220±105.2不同亚种杀虫晶体蛋白的比较蛋白质组研究第65页/共73页

对双向电泳上的差异蛋白进行MAIDI-TOF-TOF分析，从HD-1菌株杀虫晶体蛋白中鉴定到Cry1Ac、