有机白萝卜表皮附生乳酸菌链霉素抗性分析 论文

1、.1毕业论文题目:有机白萝卜表皮附生乳酸菌链霉素抗性分析目录 TOC o 1-3 h z u HYPERLINK l _Toc421818429摘要 PAGEREF _Toc421818429 h 1HYPERLINK l _Toc421818430Abstract PAGEREF _Toc421818430 h 1HYPERLINK l _Toc4218184311 前言 PAGEREF _Toc421818431 h 1HYPERLINK l _Toc4218184321.1 抗生素的定义 PAGEREF _Toc421818432 h 1HYPERLINK l _Toc421818433

2、1.2 抗生素的用途简介 PAGEREF _Toc421818433 h 1HYPERLINK l _Toc4218184341.3 萝卜表皮附生乳酸菌 PAGEREF _Toc421818434 h 1HYPERLINK l _Toc4218184351.4 链霉素 PAGEREF _Toc421818435 h 1HYPERLINK l _Toc4218184361.5 16S rRNA分析技术在乳酸菌分类学的应用 PAGEREF _Toc421818436 h 1HYPERLINK l _Toc4218184371.6 本论文研究的目的及意义 PAGEREF _Toc421818437

3、h 1HYPERLINK l _Toc4218184382 材料和方法 PAGEREF _Toc421818438 h 1HYPERLINK l _Toc4218184392.1 材料和仪器 PAGEREF _Toc421818439 h 1HYPERLINK l _Toc4218184402.1.1 样品 PAGEREF _Toc421818440 h 1HYPERLINK l _Toc4218184412.1.2 试剂 PAGEREF _Toc421818441 h 1HYPERLINK l _Toc4218184422.1.3 仪器 PAGEREF _Toc421818442 h 1HY

4、PERLINK l _Toc4218184432.1.4 培养基及配制 PAGEREF _Toc421818443 h 1HYPERLINK l _Toc4218184442.2 实验方法 PAGEREF _Toc421818444 h 1HYPERLINK l _Toc4218184452.2.1 乳酸菌的培养 PAGEREF _Toc421818445 h 1HYPERLINK l _Toc4218184462.2.2 乳酸菌的别离纯化 PAGEREF _Toc421818446 h 1HYPERLINK l _Toc4218184472.2.3 乳酸菌总DNA的提取 PAGEREF _T

5、oc421818447 h 1HYPERLINK l _Toc4218184482.2.4 16S rRNA目的基因的PCR扩增及克隆分析 PAGEREF _Toc421818448 h 1HYPERLINK l _Toc4218184492.2.5 最小抑制浓度MIC的测定 PAGEREF _Toc421818449 h 1HYPERLINK l _Toc4218184503结果 PAGEREF _Toc421818450 h 1HYPERLINK l _Toc4218184513.1 乳酸菌的别离 PAGEREF _Toc421818451 h 1HYPERLINK l _Toc42181

6、84523.2 基因组DNA的提取 PAGEREF _Toc421818452 h 1HYPERLINK l _Toc4218184533.3 16S rRNA的PCR扩增片断电泳结果分析 PAGEREF _Toc421818453 h 1HYPERLINK l _Toc4218184543.4 重组子的筛选和鉴定 PAGEREF _Toc421818454 h 1HYPERLINK l _Toc4218184553.5 16S rRNA分析 PAGEREF _Toc421818455 h 1HYPERLINK l _Toc4218184563.6 链霉素抗性分析结果 PAGEREF _Toc

7、421818456 h 1HYPERLINK l _Toc4218184574 结论 PAGEREF _Toc421818457 h 1HYPERLINK l _Toc421818458总结与体会 PAGEREF _Toc421818458 h 1HYPERLINK l _Toc421818459致词 PAGEREF _Toc421818459 h 1HYPERLINK l _Toc421818460参考文献 PAGEREF _Toc421818460 h 1.1摘要以市售的有机白萝卜为研究对象，分析其表皮附生的乳酸菌对链霉素的抗药性。别离菌株的16S rRNA和抗药性分析说明：从有机白萝卜表

8、皮别离得到的43株菌分别属于Pediococcus pentosaceus44%、Leuconostoc mesenteroides16%、Leuconostoc pseudomesenteroides5%、Leuconostoc citreum16%、Leuconostoc holzapfelii14%和Weissella cibaria5%。在别离得到的43株乳酸菌中，共有8菌株表现出了对链霉素的抗药性，占所有乳酸菌的18.6%；其中，在19株P. pentosaceus中，有5株菌表现出对链霉素的抗药性；L. mesenteroides和L. pseudomesenteroides对链霉

9、素都表现为敏感；L. citreum、L. holzapfelii和W. cibaria分别有一株菌表现出对链霉素的抗药性。【关键词】有机白萝卜；乳酸菌；链霉素；抗药性AbstractThe epibiotic lactic acid bacteria (LAB) on the surface of organic radish were investigated by MRS culture, 16S rRNA and antibiotic resistance. 43 isolates in current study were assigned to Pediococcus pentos

10、aceus (44%), Leuconostoc mesenteroides (16%), Leuconostoc pseudomesenteroides (5%), Leuconostoc citreum (16%), Leuconostoc holzapfelii (14%) and Weissella cibaria (5%). And 8 (18.6%) isolates displayed the resistance of streptomycin. Among the Pediococcus pentosaceus, there were 5 isolates resistanc

11、es of streptomycin. For Leuconostoc mesenteroides and Leuconostoc pseudomesenteroides, all of them were sensitive to streptomycin. In the Leuconostoc citreum, only one isolate displayed the resistance of streptomycin; Regarding the Leuconostoc holzapfelii, 1 isolate was resistance; For the Weissella

12、 cibaria, 1 isolate was resistance.Keywords: Organic white radish; Lactobacillus; streptomycin; resistance1 前言白萝卜是根菜类的主要蔬菜，属十字花科、萝卜属的一年或二年生草本双子叶植物1。在我国白萝卜栽培历史悠久，是一种药食同源的群众化蔬菜，富含维生素C、芥子油、淀粉酶和粗纤维，具有促进消化，增强食欲，加快胃肠蠕动和止咳化痰的作用，可以治疗或辅助治疗多种疾病，为食疗佳品，被本草纲目称之为“蔬中最有利者，因此常被作为水果而鲜食1。乳酸菌是蔬菜外表常见的附生微生物，长期以来被普遍认为是平安2

13、。然而，近年来越来越多抗生素抗药性乳酸菌被发现具有一定可转移的抗药性，为乳酸菌的平安敲响了警钟。1.1 抗生素的定义抗生素antibiotics是由微生物包括细菌、真菌、放线菌属或高等动植物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其它活性的一类次级代产物，能干扰其他生活细胞发育功能的化学物质。现临床常用的抗生素有转基因工程菌3培养液液中提取物以及用化学方法合成或半合成的化合物。目前天然抗生素不下万种。1.2 抗生素的用途简介抗生素以前被称为抗菌素，事实上它不仅能杀灭细菌而且对霉菌、支原体、衣原体、螺旋体、立克次氏体等其它致病微生物也有良好的抑制和杀灭作用，通常将抗菌素改称为抗生素。抗生素可以是*些微

14、生物生长繁殖过程中产生的一种物质，用于治病的抗生素除由此直接提取外；还有完全用人工合成或局部人工合成的。通俗地讲，抗生素就是用于治疗各种非病毒感染的药物。但是在临床使用中已经显现了许多副作用。1.3 萝卜表皮附生乳酸菌乳酸菌lactic acid bacteria是一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称，它属于发酵糖类，其主要产物为乳酸。乳酸菌是一群细菌，它们数量相当庞大，种类异常复杂，到目前为止共发现有200多种，并分成了18个属。其中相当大的一局部都是我们人体所必须并具有重要生理功能的菌，而且人体的肠道量存在着这些菌。并且国外生物学家都认为人类身体的安康程度和生命的长短都与肠道中的乳酸菌有着

15、非常密切的关系。乳酸菌的发酵原理是：乳酸菌进展无氧呼吸，葡萄糖即经过糖酵解生成丙酮酸，丙酮酸再脱氢产生乳酸。乳酸菌可将酪蛋白被分解成肽和氨基酸，而且乳糖和柠檬酸可生成芳香性物质，从而产生风味。乳酸球菌和乳酸杆菌对蛋白质有较强的分解能力，是高酸生成菌。乳酸菌还有分解脂肪的能力，三丁酸甘油酯易被乳酸菌发酵剂分解。1.4 链霉素链霉素属于抗生素中氨基糖苷类。链霉素streptomycin是一种氨基葡萄糖型抗生素，分子式C21H39N7O12。 1943年美国S.A.瓦克斯曼从链霉菌中析离得到，是继青霉素后第二个生产并用于临床的抗生素。它的抗结核杆菌的特效作用，开创了结核病治疗的新纪元。链霉素是一种从

16、灰链霉菌的培养液中提取的抗菌素。属于氨基糖甙碱性化合物，它与结核杆菌菌体核糖核酸蛋白体蛋白质结合，起到了干扰结核杆菌蛋白质合成的作用，从而杀灭或者抑制结核杆菌生长的作用。链霉素为白色无定形粉末，有吸湿性。易溶于水，不溶于大多数有机溶剂，强酸、强碱条件下不稳定。硫酸链霉素制剂外观为黄色粉末，密度0.38g/L，pH1.53.5，易溶于水，呈微酸性，在中性和酸性条件下稳定，碱性条件下易失效。1.5 16S rRNA分析技术在乳酸菌分类学的应用16S ribosomal RNA是16S rRNA 的全名，它是原核生物的一种核糖体RNA，是原核核糖体30S小亚基的组成局部。由于其种类少，普遍性存在，分

17、子大小适中，总量一般占细菌rRNA总量的80 %左右，在构造与功能上具有高度的保守性和特异性，基因序列一般包含约50个功能域，基因序列的变化缓慢，所以将16S rRNA 用作分子指标, 这样能实现微量、快速、准确、简便的对乳酸菌进展分类鉴定。16S rRNA中的S是沉降系数，反映生物大分子在离心场中向下沉降速度的一个指标。此沉降系数分为3种：5S、16 S和23 S，他们对应的编码基因rRNA的链长为3300、1540、120个核苷酸，细菌蛋白质的合成过程是由它们和核糖体大小亚基组合在一起共同完成的。16S rRNA基因是细菌上编码rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌的基因组中。16S

18、rRNA 基因片段一般有3 种分析方法: 第一种是，将PCR 产物与16S rRNA 种属特异性的探针杂交，从而获取微生物组成信息。样品与探针也可以直接进展原位杂交检测，这样既能分析它们的空间分布，还能测定微生物的丰度和形态特征。此方法优点是简洁方便，通常大量应用于快速检测,。缺点是可能出现假阴性或假阳性结果。第二种是在质粒载体上将PCR 产物克隆，然后进展测序。通过将结果与16S rRNA 数据库中的序列进展比较的方法，找出它在进化树中的位置，这样就可以鉴定出萝卜外表乳酸菌中存在的乳酸菌种类,。此方法优点是获得的信息比较全,缺点是如果成分太复杂，工作量会很大。第三种是，对PCR 产物进展限制

19、性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism s,RFLP)分析, 然后观察其酶切电泳图谱和数值分析来确定萝卜外表乳酸菌基因的核糖体型, 然后与核糖体库中的数据进展比较，这样可以分析不同种属之间的关系。随着分子分类的方法和理论的日渐成熟，16S rRNA分析技术成为了微生物分类学研究的一种可靠的工具。细菌主要是根据是细菌生理、生化性状和形态特征进展分类, 采用的对乳酸菌进展纯培养别离方法，然后鉴定其生理、生化、形态、反响特征和免疫学特性4-5。1.6 本论文研究的目的及意义随着人们生活水平逐步提高，人们越来越重视食品平安问题。有机蔬菜纯天然

20、、不含任何农药残留，通常被称为“零污染的蔬菜，因此备受消费者青睐。然而，近年来越来越多抗生素抗药性乳酸菌被发现具有一定可转移的抗药性，为乳酸菌的平安敲响了警钟。该研究以期待为有白机萝卜鲜食的食品平安评价提供参考。2 材料和方法2.1 材料和仪器2.1.1 样品有机白萝卜样品购置于有机蔬菜种植基地零售超市。2.1.2 试剂 DNA提取与检测试剂表1 DNA提取与检测试剂试剂生产厂家ddH2O奥博星生物技术*公司TE Buffer奥博星生物技术*公司10%W/VSDS奥博星生物技术*公司20 mg/mL蛋白酶K奥博星生物技术*公司5M NaCl奥博星生物技术*公司CTAB/ NaCl

21、溶液pH8.0市科龙化工试剂厂241氯仿/异戊醇市科龙化工试剂厂25241 苯酚/氯仿/异戊醇市科龙化工试剂厂异丙醇市科龙化工试剂厂无水乙醇、70%乙醇市科龙化工试剂厂电泳级琼脂糖市科龙化工试剂厂核酸染色剂市科龙化工试剂厂DNA Marker I, DNA Marker VII市科龙化工试剂厂 PCR扩增试剂表2 PCR扩增试剂PCR扩增试剂生产厂家4种底物：dNTP (dATP+dCTP+dGTP+dTTP)Tiangen公司10Taq 缓冲液Tiangen公司Taq DNA polymerase ( 5.0U/l )Tiangen公司MgCl225mMTiangen公司PCR

22、 mi*ture东盛公司 16S rRNA目的基因的PCR扩增表3 16S rRNA目的基因的PCR扩增试剂16S rRNA目的基因的PCR扩增试剂生产厂家10PCR buffer；东盛公司脱氧核苷酸dNTP 混合物；东盛公司Taq DNA 聚合酶；东盛公司DNA 模板；东盛公司引物P1:Eu27f, AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG东盛公司引物P2:1490R, GGT TAC CTT GTT ACG ACT T 东盛公司三蒸水东盛公司2.1.3 仪器表4 实验所用仪器及设备仪器生产厂家IS09001电子天平赛多利斯仪器系统BCD-155TD GA冰箱海尔股

23、份DS*-280B手提式不锈钢压力蒸汽灭菌器甬安医疗器械制造LDZ*-75KB立式压力蒸汽灭菌器申安医疗器械厂SW-OJ-LF干净工作台净集团安泰空气技术PTC-200型 PCR 扩增仪美国 MJ Research公司DYCP-31DN 型琼脂糖水平电泳仪六一仪器厂GEL DOC *R型凝胶成像分析系统美国 Bio-Rad 公司2.1.4 培养基及配制 MRS培养基配制方法配制量1 L(1) 称取酵母粉 5g，蛋白胨 10g，牛肉膏10g，葡萄糖20g，吐温80 1mL，柠檬酸铵2g，乙酸钠5g，硫酸锰0.05g，硫酸镁0.2g，磷酸氢二钾2g，碳酸钙20g于1 L的烧杯中；(2

24、) 参加约800mL80%去蒸馏水，加热充分搅拌溶解；(3) 滴加1mol/LNaOH，调节pH至6.56.8；(4) 加去蒸馏水至1L；(5) 参加15g琼脂，高温高压灭菌121灭菌30min，待冷却至60左右时摇匀倒平板，每个平板的培养基加20mL左右，平板制成后保存于4。 MRS液体培养基(1) 称取酵母粉 5g，蛋白胨 10g，牛肉膏10g，葡萄糖20g，吐温80 1mL，柠檬酸铵2g，乙酸钠5g，硫酸锰0.05g，硫酸镁0.2g，磷酸氢二钾2g于1L的烧杯中；(2) 参加约800mL80%蒸馏水，加热充分搅拌溶解；(3) 滴加1mol/LNaOH，调节pH至6.56.8

25、；(4) 加蒸馏水至1L，充分搅拌均匀后，分装入试管中5mL/支；(5) 高温高压灭菌121灭菌30min，保存。2.2 实验方法2.2.1 乳酸菌的培养随机选取有机白萝卜表皮25 g放于225 mL无菌生理盐水中，振荡30 min，制成细菌原液。用移液枪取900l无菌水于EP管中，再取100l细菌原液，混合均匀记为1:10；吸取1:10的细菌液于900l无菌水中混匀制成1:100细菌液；吸取1:100的细菌液于900l无菌水中混匀制成1:1000细菌液; 吸取1:1000的细菌液900l无菌水中混匀制成1:10000细菌液。配制液体MRS培养基200mL，灭菌后倒10个平板，待其冷却凝固后于

26、恒温箱过夜，用移液枪取100l菌种于平板，用玻璃涂棒将菌种涂均匀，作好标记，每个浓度的细菌液接两个平板，于37恒温箱培养48h6。2.2.2 乳酸菌的别离纯化在MRS固体培养基中参加碳酸钙，将菌种稀释至适宜的浓度，均匀涂布于参加碳酸钙后的固体培养基，37恒温培育48h。乳酸菌会在含有碳酸钙的培养基上产生溶解圈，观察挑选有碳酸钙溶解圈的单菌落最好挑一些溶解圈半径较大的，然后在MRS 固体培养基上反复划线，直到别离长出单菌落。将别离的单菌落编号菌种在MRS固体培养基上，保藏温度4，备用。2.2.3 乳酸菌总DNA的提取(1) 将已培养至饱和的细菌液吸取2.0mL，10000rpm离心2min，弃上

27、清，加ddH2O无菌水洗涤，10000rpm离心2min，弃上清；(2) 沉淀物参加555 l TE buffer，充分悬浮不能有菌团，参加40 l 10 SDS和5 l20 mg/mL蛋白酶K，悬振混匀，37温育1h；(3) 参加100l 5M的 NaCl，混匀，再参加80l CTAB/NaCl溶液，混匀，70温育10 min；(4) 参加780l 241氯仿/异戊醇，混匀，4，12000rpm离心5min，上清液转入新管中，弃废管；(5) 参加等体积的25241 酚/氯仿/异戊醇注意取下层溶液，混匀，4，12000rpm离心5min，上清液转入新管中，弃废管；(6) 参加0.6体积的异丙醇

28、，轻轻混匀，4静止2h，4，12000rpm离心10min，弃上清，500l70乙醇洗涤，4，12000rpm离心10min，弃上清；(7) 真空枯燥10min，参加TE buffer 30l溶解，-20保存7。2.2.4 16S rRNA目的基因的PCR扩增及克隆分析 16S rRNA目的基因的PCR扩增(1) PCR引物Forward Primer：Eu27F(5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，10M )；Reverse Primer：1490R(5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3，10M)；(2) PCR反响16S rRNA 序列的PCR反响体系

29、50l如表5表5 16S rRNA PCR扩增反响体系PCR反响试剂添加量灭菌水(ddwater)33.75 l10Taq 缓冲液冰上解冻5 ldNTP( 冰上解冻)4 lMgCl225mM3lForward Primer1 lReverse Primer1 l模板DNA2 lTaq DNA 聚合酶(Tiangen，5 U/l)0.25 l按以下程序在PCR自动扩增仪中对目的基因进展扩增：95预热 5 min95变性1 min 50退火1 min 35 cycles72延伸2 min72延伸10 min反响完毕后，20保存。(3) 琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物取PCR扩增后的产物5 l，加1

30、l 6 loading buffer混匀，上样于1.0%的琼脂糖凝胶，电泳检测扩增效果。DNA Marker = 7 * ROMAN VII 5 l作标准，1 TAE缓冲液介质，4 10 V/cm直流电电泳。 连接反响Ligation)和重组DNA的转化从PGM-Tligation Kit剂盒Tiangen公司1 l连接缓冲液参加到200 l的Eppendorff 管中。然后参加扩增后的DNA片段4 l，再参加pGM-T载体 1 l，再参加3 l ddH2O，T4 DNA ligase 1 l轻轻混匀后注：以上添加溶液顺序不能颠倒在PCR仪中16过夜连接。连接完毕后取3 l重组质

31、粒DNA参加到冰上已解冻的装有感受态大肠杆菌DH5 Eppendoff 管中，轻轻混匀，冰上放置30 min，42热激90s，迅速置冰水浴中2 min，参加已经在37预热的SOC培养基300500 l，37摇床培养45 min。 重组菌落的筛选向含氨苄青霉素的LB培养基平板培养皿中参加40 l *-gal和30 l IPTG后涂布平板，37放置13 h，参加100 l重组大肠杆菌液涂在LB平板上。Eppendoff管中剩余的400 l重组大肠杆菌DH5在4 12000 rpm下离心 1 min，倒掉上清液约300 l，微型震荡仪上悬震菌体沉淀，吸取菌悬液涂于新的LB平板。涂好后的

32、平板在37培养15 h左右，挑选白色的菌落。 重组大肠杆菌的扩大培养将LB液体培养基分装入试管中，每管约4 mL，121，灭菌20 min，冷却后每管参加5 l氨苄青霉素25 mg/mL。用无菌牙签挑取白色的单菌落接种于试管中，37，150 rpm震荡培养1518 h，直至从试管另一面看不到牙签即可。 重组质粒的提取和鉴定质粒的提取参见质粒小提试剂盒Omega公司的说明操作，步骤如下：(1) 柱平衡步骤：向吸收柱CB3中吸附柱放入收集管中参加500 l的平衡液BL，12000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。(2) 取1.5 mL在中

33、培养的大肠杆菌，参加到Eppendorf管中，使用普通离心机，12000 rpm离心1分钟，尽量去除上清液。(3) 向留有菌体沉淀的Eppendorf管中参加250 l溶液P1先确认是否已参加RNaseA，使用旋涡混匀器彻底悬浮菌体沉淀。(4) 向Eppendorf管中参加250 l溶液P2，温和的上下翻转4-6次使菌体充分裂解。(5) 向Eppendorf管中参加350 l溶液P3，立即上下翻转，充分的混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12000 rpm离心10分钟，此时在离心管底部形成沉淀。(6) 小心的将上清液用移液枪转移到吸附柱CB3中吸附柱放入收集管中，注意尽量不要吸出沉淀。室温放置12

34、分钟，12000 rpm离心30 60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。(7) 向吸附柱CB3中参加700 l漂洗液PW先确认是否已参加无水乙醇，12000 rpm，离心30 60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新装入收集管中。(8) 向吸附柱CB3中参加500 l漂洗液PW，12000 rpm-13400g离心30-60秒，倒掉收集管中的废液。(9) 将吸附柱重新装入收集管中，12000 rpm离心2分钟。(10) 将吸附柱CB3放置于一个干净的Eppendorf管中，向吸附膜的中央局部滴加50 100 l洗脱缓冲液EB，室温放置1分钟，12000 rpm-13400g离心

35、2分钟将质粒溶液收集到Eppendorf管中。(11) 为了增加质粒的回收率，可将得到的溶液重新参加带有吸附柱的Eppendorf管中，重复10的操作。(12) 将上面收集到的质粒DNA保存在-20备用。(13) 限制性切酶处理质粒DNA：在1.5 mL的Eppendorf管中参加灭菌水1.5 l/管、酶EcoR = 1 * ROMAN I 1 l/管，然后再参加质粒DNA 2 l/管，用手指轻轻弹匀，小型离心机上离心使管壁上的液体落入管底，37酶切1 h，电泳检测。 DNA序列的测定该局部送往博瑞克生物技术完成。2.2.5 最小抑制浓度MIC的测定根据欧洲抗微生物药物敏感委员会

36、关于微生物对不同抗生素敏感阈值*的数据库分析菌株的抗生素抗药性。当别离菌株的最小抑菌质量浓度(Minimal Iinhibitory Concentration, MIC) *g/mL时为敏感性菌株，反之当MIC*g/mL为抗药性菌株。最小抑制浓度的测定采用微量肉汤稀释法。培养液制备：在2mL MRS液体培养基中接种从平板上挑取的单菌落，然后在30环境中静止培养过夜，然后用生理盐水稀释至每毫升1107 个细胞的浓度，即得到培养液。将STR配制成2048g/mL的贮存液，MRS液体培养基2倍梯度稀释成使用液。STR的梯度稀释浓度为21024g/mL。向96孔板中参加198L含不同浓度抗生素的MR

37、S液体培养基后，接种2L别离菌株的培养液1107CFU/mL，37静止培养24h后，统计不同菌株的MIC，每组实验重复3次并设置空白对照。3结果3.1 乳酸菌的别离乳酸菌是指发酵时能够产生乳酸的一大类细菌，包括40个属，近300个种。MRS平板别离乳酸菌时，利用其产生的乳酸溶解CaCO3形成溶钙圈的特性，实现乳酸菌的初步别离。在当前研究中，从平板中别离得到43个溶钙圈菌落，编号为为LS1到LS43。3.2 基因组DNA的提取DNA作为分子生物学研究的根底,在生物领域尤其是遗传学方面的研究日渐深入，在此根底上产生的基因工程技术已在医药、畜牧业等领域获得广泛应用。研究和应用DNA的根底是提取纯化构

38、造完整的DNA，实验中将SDS法和CTAB法结合用于DNA的提取，不仅能使微生物细胞能更完全的得到破碎，并有利于蛋白质等杂质与DNA的别离。实验结果如图4。图3 Wide Range DNA Marker 图4 局部乳酸菌的总DNA电泳结果图由图4可看出每条泳道均出现清晰的条带且与Marker的条带根本一致。实验中染色剂Gold-view中所含有的EB嵌入核酸双链的碱基之间，形成EB-DNA复合物。该复合物，经紫外光照射，可以发出红-橙色的荧光。1 ng的DNA即可检出。由电泳亮斑可知，细菌基因组DNA的大小超过12 kb，因此，则可认为到达了对基因组DNA的提取要求。3.3 16S rRNA

39、的PCR扩增片断电泳结果分析所有样本菌的16S rRNA基因皆进展了PCR扩增，扩增后电泳检测的结果如图6所示。图5 DNA Marker = 3 * ROMAN III图6 16S rRNA的PCR扩增电泳图局部由图6电泳亮斑可知，对所有样本菌的16S rRNA基因皆进展了PCR扩增。所扩增片段的大小在1200 2000 bp之间，和原核生物的16S rRNA基因片段大小一致，因此到达了对微生物的16S rRNA基因的PCR扩增目的8。3.4 重组子的筛选和鉴定以Taq DNA聚合酶扩增后的PCR产物末端都带有单个碱基A，pGM-T载体，其构造图谱如图7所示，具有一个T碱基的粘性末端，它们既

40、可按碱基互补配对原则，将目的片段与载体相连，构建成重组子。pGM-T载体不仅含有多克隆酶切位点，还含丝状噬菌体f1的复制起始区，用于产生环状ssDNA；含有T7和SP6 DNA聚合酶启动子；在多克隆区域具有编码-半乳糖苷酶的基因lacZ，插入失活-肽可在指示平板上通过蓝、白菌落直接筛选重组菌落。图7 pGM-T构造图谱本实验采用了切酶EcoR对重组质粒进展了切割，EcoR酶的切位点如图8所示。阳性重组子经酶切后有16S rRNA目的基因片段电泳亮斑，并和DNA Marker 中长度为1.5 kb的核酸片段亮斑位置相一致。由检测图10可知，连接反响已将PCR扩增后的16S rRNA基因连接到了T

41、-载体上，并在感受态菌株E.coli DH5中得到了表达，形成白色菌落。图8 EcoR酶切示意图图9 DNA Marker 图10 酶切后的质粒电泳图局部3.5 16S rRNA分析通过16S rRNA序列经校对后，与NCBI中GenBank数据库做相似性分析，选取相似度较高的菌株将结果记录如表6。Stackebrandt9等认为当细菌的16S rRNA序列的相似性大于或等于97%时，则可以认为是同一个属，当序列相似性大于或等于98%时，可以认为是同一个种。从平板上别离得到的43株菌通过16S rRNA序列分析结果说明：有机白萝卜表皮附生乳酸菌主要分为Pediococcus、Leuconost

42、oc和Weissella属表6，其中，以LS5为代表的19株别离菌株属于Pediococcus属，它们的16S rRNA序列与P. pentosaceus DSM 20336T 的16S rRNA序列相似性为99%，因此以LS5为代表的19株菌被鉴定为P. pentosaceus，占所有菌株的44%；以LS2为代表的7株菌属于Leuconostoc属，它们的16S rRNA序列与L. mesenteroides ATCC 8293T的16S rRNA序列相似性为99%，因此以LS2为代表的7株菌被鉴定为L. mesenteroides，占所有菌株的16%；以LS15为代表的2株菌属于Leuco

43、nostoc属，它们的16S rRNA序列与L. pseudomesenteroides NRIC 1777T的16S rRNA序列相似性为99%，因此以LS15为代表的2株菌被鉴定为L. pseudomesenteroides，占所有菌株的5%；以LS26为代表的7株菌属于Leuconostoc属，它们的16S rRNA序列与L. citreum ATCC 49370T的16S rRNA序列相似性为99%，因此以LS26为代表的7株菌被鉴定为L. citreum，占所有菌株的16%；以LS34为代表的6株菌属于Leuconostoc属，它们的16S rRNA序列与L. holzapfelii

44、 LMG 23990T的16S rRNA序列相似性为99%，因此以LS34为代表的6株菌被鉴定为L. holzapfelii，占所有菌株的14%；以LS17为代表的2株菌属于Weissella属，它们的16S rRNA序列与W. cibaria LMG 17699T的16S rRNA序列相似性为100%，因此以LS17为代表的2株菌倍被鉴定为W. cibaria，占所有菌株的5%。表616S rRNA序列比对结果属簇群相似菌株相似性菌株数量PediococcusLS5P. pentosaceus DSM 20336T99%19LeuconostocLS2L. mesenteroides ATC

45、C 8293T99%7LS15L. pseudomesenteroides NRIC 1777T99%2LS26L. citreum ATCC 49370T99%7LS34L. holzapfelii LMG 23990T99%6WeissellaLS17W. cibaria LMG 17699T100%23.6 链霉素抗性分析结果查询欧洲抗微生物药物敏感委员会 (.)关于微生物对不同抗生素敏感阈值的数据库./mic_distributions/可知，P. pentosaceus、L. mesenteroides、L. pseudomesenteroid

46、es、L. citreum、L. holzapfelii和W. cibaria对链霉素的敏感阈值分别是64、64、64、64、64和8；在别离得到的43株乳酸菌中，共有8菌株表现出了对链霉素的抗药性，占所有乳酸菌的18.6%；其中，在19株P. pentosaceus中，有5株菌表现出对链霉素的抗药性； L. mesenteroides和L. pseudomesenteroides对链霉素都表现为敏感；L. citreum、L. holzapfelii和W. cibaria分别有一株菌表现出对链霉素的抗药性。表7 有机白萝卜表皮附生乳酸菌对链霉素的MIC与抗药性(g/mL)菌株STR阈值MIC

47、R或SP. pentosaceusLS16432SLS264SLS364SLS564SLS964SLS1432SLS20128RLS2164SLS22512RLS3064SLS3164SLS3332SLS3432SLS354SLS3632SLS38128RLS391024RLS424SLS43256RL. mesenteroidesLS46464SLS664SLS1332SLS1932SLS2316SLS3232SLS3732SL. pseudomesenteroidesLS156464SLS2532SL. citreumLS76432SLS8128RLS1132SLS1832SLS244SL

48、S264SLS298SL. holzapfeliiLS106432SLS1616SLS1716SLS2832SLS4032SLS41128RW. cibariaLS128128RLS274S注：“R代表耐药，“S代表敏感4 结论从有机白萝卜表皮别离得到的43株菌分别属于Pediococcus、Leuconostoc和Weissella属，其中，19株菌被鉴定为P. pentosaceus，占所有菌株的44%；7株菌被鉴定为L. mesenteroides，占所有菌株的16%；2株菌被鉴定为L. pseudomesenteroides，占所有菌株的5%；7株菌被鉴定为L. citreum，占所有

49、菌株的16%；6株菌被鉴定为L. holzapfelii，占所有菌株的14%；2株菌被鉴定为W. cibaria，占所有菌株的5%。在别离得到的43株乳酸菌中，共有8菌株表现出了对链霉素的抗药性，占所有乳酸菌的18.6%；其中，在19株P. pentosaceus中，有5株菌表现出对链霉素的抗药性； L. mesenteroides和L. pseudomesenteroides对链霉素都表现为敏感；L. citreum、L. holzapfelii和W. cibaria分别有一株菌表现出对链霉素的抗药性。总结与体会通过本次论文，我很好的总结了四年大学的学习，并将所学的知识很好的应用到了实验中，

50、对自己的理论应用能力有了很好的锻炼和提高。毕业设计不仅是对大学前三年所学知识的检测，也是对自己的思维和实验能力的一种锻炼，并使之有所提高。通过这次毕业设计我发现原来自己学的知识是比较有限的，而且真正要自己设计一个实验，并亲手把它做出来，是已经很不容易的事，还需要学习的东西很多。在实验过程中遇到了很多困难，一开场不知道怎么下手，通过指导教师和师兄的帮助，我渐渐进入了毕业设计的正轨。我也明白了：知识必须通过应用才能实现其价值，学以致用，是一个提升的过程。这次毕业设计既锻炼了自己独立思考的能力、与人合作的能力和应对困难的心理，还在理论知识和实验技能上得到了提高。此次实验是在西华大学生物工程古法发酵生

51、物技术研究所完成，实验室给我的第一印象是学风严谨，这次试验的全过程中我也一直感受着这个优良的作风。实验室的教师和师兄对待科学的严谨和钻研精神让我受益非浅，我将以后在的学习和生活中都本着严谨刻苦的精神进展。致词本论文能顺利的完成，是在向文良教师的指导下对四年大学学习的一个总结。在近两个月的实验中，教师既是良师又是益友，我自始自终得到了向教师的指导和帮助。从实验方案确实定到理论问题的讨论，每遇困难时，总是能得到向教师的悉心指点。他们严谨的学风和谦和的为人使我受益非浅；他们还在百忙之中，花费了不少珍贵的时间来为我修改论文，使之尽可能完善和严谨，正是在向教师热心的帮助和指导下，我顺利的完成了毕业论文。

52、在此衷心的感向文良教师对我的帮助。同时，我也要感在我实验过程中一直与我们在一起的师兄师姐，感他们对我的细心指导、帮助和关心，他们实事的科学态度、勇于探索的创新意识、严谨务实的治学作风是我以后学习的楷模！此外，我还要感生物工程实验中心全体教师为我们提供开展实验的空间和各种实验设备和仪器；最后，我要感生物工程学院所有教师这四年对我的教导，感全体同学和朋友们对我各方面的关心和支持，大家！参考文献1 贤娴. 萝卜营养及风味物质积累规律研究D. : 农业大学, 2021.2 Mathur S, Singh R. Antibiotic resistance in food lactic acid bacteria-a review J. Internation