生物化学14 DNA的生物合成.

1、编码蛋白质或编码蛋白质或RNA等具有特定功能产物的、负等具有特定功能产物的、负载遗传信息的基本单位，载遗传信息的基本单位，通常是指染色体或基因组的一通常是指染色体或基因组的一段段DNA序列。序列。复制复制(replication) 是指是指DNADNA复制复制是是以母链以母链DNADNA为模板合成子链为模板合成子链DNADNA的过程。的过程。复制复制亲代亲代DNA子代子代DNA目录目录第十四章第十四章DNA的生物合成的生物合成DNA Biosynthesis ( Replication )目录目录n本章主要内容：本章主要内容： DNA DNA复制的基本特征复制的基本特征 DNA复制的酶学和拓扑

2、学变化复制的酶学和拓扑学变化 原核生物原核生物DNADNA复制过程复制过程真核生物真核生物DNADNA生物合成过程生物合成过程 逆转录和其他复制方式逆转录和其他复制方式DNA复制的基本特征复制的基本特征Basic Rules of DNA Replication第第 一一 节节目录目录半保留复制半保留复制(semi-conservative replication)双向复制双向复制(bidirectional replication)半不连续复制半不连续复制(semi-discontinuous replication) nDNA复制的主要特征复制的主要特征 目录目录一、一、 DNA以半保留方

3、式进行复制以半保留方式进行复制 n半保留复制半保留复制的概念的概念: :AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+母链母链DNA复制过程中形成复制过程中形成的复制叉的复制叉子代子代DNA目录目录n子链继承母链遗传信息的几种可能方式子链继承母链遗传信息的几种可能方式: : 全保留式全保留式 半保留式半保留式 混合式混合式 目录目录按半保留复制方式，子代按半保留复制方式

4、，子代DNA与亲代与亲代DNA A的的碱基序列一致碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的传信息，体现了遗传的保守性保守性。n半保留复制的意义半保留复制的意义: :遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但但不是绝对的不是绝对的。目录目录 原核生物基因组是环状原核生物基因组是环状DNA，只有一个，只有一个复制起复制起点（点（origin）。复制从起点开始，向两个方向。复制从起点开始，向两个方向进行解链，进行的是单点起始进行解链，进行的是单点起始双向复制双向复制。二、二、DNA复制从起点向两个方向延伸复制从起点向两个

5、方向延伸复制中的放射自显影图象复制中的放射自显影图象A. 环状双链环状双链DNA及复制起始点及复制起始点B. 复制中的两个复制叉复制中的两个复制叉C. 复制接近终止点复制接近终止点(termination, ter)oriterA B C目录目录 真核生物每个染色体有多个起始点，是多复真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子的复制。从一个制子的复制。从一个DNA复制起点起始的复制起点起始的DNA复制区称为一个复制区称为一个复制子复制子(replicon) 。复制。复制子是独立完成复制的功能单位。子是独立完成复制的功能单位。 53oriorioriori5353oriorioriori5355

6、33553复制复制3目录目录DNA复制的酶学和拓扑学变化复制的酶学和拓扑学变化第第 二二 节节The Enzymology and Topology of DNA Replication目录目录n参与参与DNA复制的物质复制的物质: 底物底物(substrate): dATP, dGTP, dCTP, dTTP； 聚合酶聚合酶(polymerase): 依赖依赖DNA的的DNA聚合酶，聚合酶，简写为简写为 DNA-pol； 模板模板(template): 解开成单链的解开成单链的DNA母链；母链； 引物引物(primer): 提供提供3 -OH末端使末端使dNTP可以依次可以依次聚合；聚合；

7、其他的其他的酶和蛋白质因子酶和蛋白质因子。生成磷酸二酯键生成磷酸二酯键(dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + PPi目录目录n聚合反应的特点聚合反应的特点: : DNA 新链生成需新链生成需RNA引物引物和和模板模板； 新链的延长只可沿新链的延长只可沿5 3 方向进行。方向进行。目录目录一、一、DNA聚合酶催化脱氧核苷酸间的聚合聚合酶催化脱氧核苷酸间的聚合 全称：全称：依赖依赖DNA的的DNA聚合酶聚合酶 (DNA-dependent DNA polymerase) 简称：简称：DNA-pol 活性：活性：1. 53 的聚合活性的聚合活性2. 核酸外切酶活性核酸外切酶活性5 A

8、G C T T C A G G A T A 3 | | | | | | | | | | |3 T C G A A G T C C T A G C G A C 5 3 5 外切酶活性外切酶活性: 5 3 外切酶活性外切酶活性:?能切除突变的能切除突变的 DNA片段。片段。能辨认错配的碱基对，并将其水解。能辨认错配的碱基对，并将其水解。n核酸外切酶活性核酸外切酶活性: : 目录目录（一）原核生物有（一）原核生物有3种种DNA聚合酶聚合酶 DNA-pol DNA-pol DNA-pol 目录目录原核生物的原核生物的DNADNA聚合酶聚合酶可能可能不可能不可能可能可能基因突变后的致死性基因突变后的致死

9、性无无无无有有5 3 核酸外切酶活性核酸外切酶活性20？400分子数分子数/细胞细胞多亚基不对称多亚基不对称二聚体二聚体？单肽链单肽链组成组成250120109分子量分子量(kD)DNA-pol IIIDNA-pol IIDNA-pol I可能可能不可能不可能可能可能基因突变后的致死性基因突变后的致死性无无无无有有5 3 核酸外切酶活性核酸外切酶活性20？400分子数分子数/细胞细胞多亚基不对称多亚基不对称二聚体二聚体？单肽链单肽链组成组成250120109分子量分子量(kD)DNA-pol IIIDNA-pol IIDNA-pol I目录目录个核心酶个核心酶1个个 -复合物（复合物（ 、 、

10、 、 、 、 6种亚种亚基）基）1对对 -亚基（可滑动亚基（可滑动的的DNA夹子）夹子）DNA聚合酶聚合酶全酶结构全酶结构全酶结构包括：全酶结构包括：目录目录n功能：功能： DNA-pol （109kD）对复制中的错误进行校读，对复制和修复对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。中出现的空隙进行填补。目录目录323个氨基酸个氨基酸小片段小片段5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性大片段大片段/Klenow 片段片段 604个氨基酸个氨基酸DNA聚合酶活性聚合酶活性 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性N 端端C 端端木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶DNA-pol Klenow片段是实验室合成片段是

11、实验室合成DNA，进行，进行分子生物学研究中常用的工具酶。分子生物学研究中常用的工具酶。 目录目录 DNA-pol （120kD） DNA-pol II基因发生突变，细菌依然能存活。基因发生突变，细菌依然能存活。 DNA-pol 对模板的特异性不高，即使在已发生对模板的特异性不高，即使在已发生损伤的损伤的DNA模板上，它也能催化核苷酸聚合。因模板上，它也能催化核苷酸聚合。因此认为，它参与此认为，它参与DNA损伤的应急状态修复。损伤的应急状态修复。DNA-pol（二）常见的真核细胞（二）常见的真核细胞DNA聚合酶有聚合酶有5种种目录目录二、二、DNA聚合酶的碱基选择和校对功聚合酶的碱基选择和校对

12、功能实现复制的保真性能实现复制的保真性 复制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能复制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能准确传代的基本原理。准确传代的基本原理。 此外还需酶学的机制来保证复制的保真性。此外还需酶学的机制来保证复制的保真性。目录目录遵守严格的碱基配对规律；遵守严格的碱基配对规律；聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能；聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能；复制出错时有即时校对功能。复制出错时有即时校对功能。nDNA复制的保真性至少要依赖三种机制：复制的保真性至少要依赖三种机制：目录目录目录目录目录目录三、复制中的解链伴有三、复制中的解链伴有DNA 分子分子拓扑学变化拓扑学变化DNA分子的碱

13、基埋在双螺旋内部，只有把分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把DNA解成单链，它才能起模板作用。解成单链，它才能起模板作用。目录目录（一）多种酶参与（一）多种酶参与DNA解链和稳定单链状态解链和稳定单链状态理顺理顺DNA链链拓扑异构酶拓扑异构酶 (gyrA, B)稳定已解开的单链稳定已解开的单链单链单链DNA结合蛋白结合蛋白SSB催化催化RNA引物生成引物生成引物酶引物酶DnaG (dnaG)运送和协同运送和协同DnaBDnaC (dnaC)解开解开DNA双链双链解螺旋酶解螺旋酶DnaB (dnaB)辨认起始点辨认起始点DnaA (dnaA)蛋白质（基因）蛋白质（基因）通用名通用名功能功能原核生物复

14、制起始的相关蛋白质原核生物复制起始的相关蛋白质目录目录目录目录解链过程中正超螺旋的形成解链过程中正超螺旋的形成目录目录目录目录目录目录POO-O-OHO5POO-O-O335DNA连接酶连接酶ATPADP53535、DNA连接酶连接复制中的单链缺口连接酶连接复制中的单链缺口nDNA连接酶的作用：连接酶的作用：目录目录 DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。作用。 在在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。口作用。 也是基因工程的重要工具酶之一。也是基因工程的重要工具酶之一。n功能：功能：目录目录目录目录原核生物原核生物DNA复制

15、过程复制过程The Process of DNA Replication in Prokaryotes第第 三三 节节目录目录起始是复制中较为复杂的环节，在此过程起始是复制中较为复杂的环节，在此过程中，各种酶和蛋白因子在复制起始点处装配引中，各种酶和蛋白因子在复制起始点处装配引发体，形成复制叉并合成发体，形成复制叉并合成RNARNA引物。引物。需要解决两个问题：需要解决两个问题：1. DNA解开成单链，提供模板。解开成单链，提供模板。2. 形成引发体，合成引物，提供形成引发体，合成引物，提供3 -OH末端。末端。一、一、复制的起始复制的起始E.coli复制起始点复制起始点 oriC 1 13

16、17 29 32 44 1 13 17 29 32 44 -TTTGGATAA-TTATCCACA58 66 166 174 201 209 237 24558 66 166 174 201 209 237 245 串联重复序列串联重复序列 反向重复序列反向重复序列5 3 5 3 （一）（一） DNA的解链的解链TTATCCACA目录目录原核生物的复制起始部位及解链原核生物的复制起始部位及解链 Dna A Dna B、 Dna CDNA拓扑异构酶拓扑异构酶引物引物酶酶SSB3 5 3 5 （二）引物合成和引发体形成（二）引物合成和引发体形成含有解螺旋酶（含有解螺旋酶（DnaB蛋白）、蛋白）、D

17、naC蛋白、引物蛋白、引物酶（酶（DnaG蛋白）和蛋白）和DNA复制起始区域的复合结构称复制起始区域的复合结构称为为引发体引发体。功能：解开成单链，生成引物。功能：解开成单链，生成引物。引发体引发体目录目录3 5 3 5 引物是由引物酶催化合成的短链引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。分子。引物引物3 HO5引物引物酶酶目录目录引发体和复制叉的生成引发体和复制叉的生成目录目录二、二、DNA链的延长链的延长复制的延长指在复制的延长指在DNA-pol催化下，催化下，dNTP以以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。其化

18、学本质是磷酸二酯键的不断生成。 5 5 3 35 5dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH 33 3DNA-pol目录目录n领头链的合成：领头链的合成：领头链的子链沿着领头链的子链沿着5 5 33 方向可以连续地延长。方向可以连续地延长。n后随链的合成后随链的合成目录目录 在复制叉同时合成前导链和后随链在复制叉同时合成前导链和后随链复复制制过过程程简简图图目录目录 原核生物基因是环状原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段，双向复制的复制片段在复制的终止点在复制的终止点(ter)处汇合。处汇合。oriter E.coli8232 ori terSV40500三

19、、复制的终止三、复制的终止目录目录5 5 5 RNA酶酶OHP5 DNA-pol dNTP5 5 PATP ADP+Pi5 5 DNA连接酶连接酶n 子链中的子链中的RNA引物被取代引物被取代目录目录目录目录真核生物真核生物DNA生物合成生物合成过程过程The Process of DNA Biosynthesis in eukaryotes第第 四四 节节目录目录真核生物复制子多、冈崎片段短、复制叉真核生物复制子多、冈崎片段短、复制叉前进速度慢等；前进速度慢等；DNA复制从引发进入延伸阶段发生复制从引发进入延伸阶段发生DNA聚聚合酶合酶 / 转换；转换；切除冈崎片段切除冈崎片段RNA引物的是

20、核酸酶引物的是核酸酶RNAse H和和FEN1等。等。 真核生物与原核生物真核生物与原核生物DNA复制的差异：复制的差异：目录目录哺乳动物的哺乳动物的细胞周期细胞周期DNA合成期合成期G1G2SM细胞能否分裂，决定于进入细胞能否分裂，决定于进入S期及期及M期这两个关期这两个关键点。键点。G1S及及G2M的调节，与蛋白激酶活的调节，与蛋白激酶活性有关。性有关。 蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用。而实施调控作用。 真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。子复制。复制的起始需要复制的起始需要

21、DNA-pol （引物酶活性）和（引物酶活性）和pol （解螺旋酶活性）参与。还需拓扑酶和复（解螺旋酶活性）参与。还需拓扑酶和复制因子制因子(replication factor, RF)。 一、真核生物复制的起始与原核基本相似一、真核生物复制的起始与原核基本相似增殖细胞核抗原（增殖细胞核抗原（PCNA）在复制起始和延长中起关在复制起始和延长中起关键作用。具有键作用。具有与与E.coli DNA 聚合酶聚合酶的的亚基相同亚基相同的的功能和相似的构象。功能和相似的构象。 DNA-pol 和和pol 分别兼有解螺旋酶和引物酶活分别兼有解螺旋酶和引物酶活性。在复制叉及引物生成后，性。在复制叉及引物生

22、成后，DNA-pol 通过通过PCNA的协同作用，逐步取代的协同作用，逐步取代pol ，在，在RNA引物引物的的3 -OH基础上连续合成领头链。随从链引物也基础上连续合成领头链。随从链引物也由由pol 催化合成。然后由催化合成。然后由PCNA协同，协同，pol 置换置换pol ，继续合成，继续合成DNA子链。子链。 二、二、真核生物复制的延长发生真核生物复制的延长发生DNA聚合酶聚合酶/转换转换目录目录3 5 5 3 领头链领头链3 5 3 5 亲代亲代DNA后随链后随链引物引物核小体核小体三、真核生物三、真核生物DNA合成后立即组装成核小体合成后立即组装成核小体染色体染色体DNA呈线状，复制

23、在末端停止。呈线状，复制在末端停止。染色体两端染色体两端DNA子链上最后复制的子链上最后复制的RNA引物，引物，去除后留下空隙。去除后留下空隙。四、端粒酶参与解决染色体末端复制问题四、端粒酶参与解决染色体末端复制问题末端末端DNA序列序列5 3 3 5 5 3 3 5 +5 3 3 3 3 5 5 目录目录n端粒酶催化作用的爬行模型端粒酶催化作用的爬行模型 目录目录真核所有染色体真核所有染色体DNA复制仅仅出现在细胞复制仅仅出现在细胞周期的周期的S期期，而且只能复制一次。，而且只能复制一次。五、真核生物染色体五、真核生物染色体DNA在每个细胞周在每个细胞周期中只能复制一次期中只能复制一次目录目录逆转录和其他复制方式逆转录和其他复制方式Reverse Transcription & Other DNA Replication Ways第五节第五节目录目录 双链双链DNA是大多数生物的遗传物质。某些是大