双氨基聚乙二醇的制备及分离纯化

1、中国医药工业杂志 Chinese Journal of Pharmaceuticals 2007, 38(6 ·423药物制剂聚乙二醇(PEG 是由乙醇单体聚合而成的线形 高分子,结构式为 H (OCH 2CH 2 n OH 。目前广泛用 来修饰多肽、蛋白质、脂质体、纳米粒等药物和载 体 1-6 。 PEG 的末端羟基须在较激烈的条件才能与 其它基团发生反应 ,因此必须通过适当方 式活化。 可根据不同需要 ,用醛基、氨基、异氰酸酯基、羧 基和烯基等基团取代该 羟基 7,8 。传统活化方法包 括氰脲酰氯法和羟基琥珀酰亚胺法。其中胺化方法 包 括甲苯磺酸酯法、叠氮化物还原法及 Mitsu

2、nobu-双氨基聚乙二醇的制备及分离纯化刘敏,徐雯,朱叶欢,潘弘,陆伟跃 *(复旦大学药学院药剂教研室 ,上海 200032摘要 :聚乙二醇 2000经氯代、叠氮化、氢化还原 3 步反应制得双氨基聚乙二醇 (1粗品,总收率 57%。采用阳离子交换树 脂,以不同浓度的乙酸盐缓冲液 (pH 5.7梯 度洗脱,得到的 1纯品采用 IR 、 1HNMR 和 HPLC 等方法进行检测 ,并用高效分 子 排阻色谱法测定相对分子量。关键词 :双氨基聚乙二醇 ;制备 ;纯化;检测中图分类号 :TQ314.2 文献标识码 :A 文章编号 :1001-8255(2007 06-0423-04收稿日期 :2006-

3、07-31基金项目 :国家自然科学基金 (30672545 和上海市纳米科技专项基 金(0652nm011作者简介 :刘 敏(1969,女,硕士 ,讲师 ,从事高分子药物载体 和脂质体给药系统研 究。E-mail :liumin通讯联系人 :陆伟跃（1960,男,教授,博士生导师 ,从事药物靶 向传释系统研究Tel Fax E-mail :wyluPreparation and Puri? cation of Amino-terminated Poly(ethylene glycolLIU Min, XU Wen, ZHU Ye-hua

4、n, PAN Hong, LU Wei-yue*(Dept. of Pharmaceutics, School of Pharmacy, Fudan University, Shanghai 200032ABSTRACT: The amino-terminated poly(ethylene glycol(1 was obtained from polyethylene glycol 2000 bychlorination, azidation and catalytic hydrogenation with an overall yield of 57%. The title compoun

5、d was puri? ed using cation exchange resin with gradietn eluent of acetate buffer solution (pH 5.7 of different concentrations. The structure of pure product was characterized by IR, 1HNMR and HPLC. The relative molecular weight of 1 was determined by size-exclusion chromatography.Key Words: amino-t

6、erminated poly(ethylene glycol ; preparation; puri? cation; characterizationStaudinger 法等 9-11 。由于叠氮化物还原法具有成本 低、反应条件温和、胺 化产率高等优点 ,本研究 采用该法以 PEG 2000为原料 ,经氯代、叠氮化、 氢化还原 3步制备了双氨基 PEG (1,总收率 57%。 再利用阳离子交换树脂分离纯化 ,最后通过 IR 、1HNMR 和 HPLC 进行检测 ,并测定相对分子量。1 仪器与试药?k t a e x p l o r e r 型中压层析系统 （瑞典安发玛西亚公司 ; 1100

7、型高效液相色 谱仪 （美国安捷伦公司 ; AVATA R T M 360 型傅里叶变换红外光谱仪 （美国 T h e r m o Nicolet 公司; Mercury Plus 400MHz 型超 导核磁共振波谱仪 （美国 Varian 公司。P E G 2000（化学纯,中国医药集团上海化学试剂 公司; PEG 对照品（相对分子质 量 1000、 2000、 3350、 6000、 10000和 20000,美国 Sigma 公司;单氨基聚乙二醇 2000和 1对照品（美国 Shearwater Polymer公司。· ·中国医药工业杂志 Chinese Journal

8、 of Pharmaceuticals 2007, 38（6 4242 方法与结果2.1 1 的制备2.1.1 试剂的预处理氯化亚砜:氯化亚砜 200ml 中加喹啉 60ml ,混匀,放置过夜。过滤 ,滤液蒸馏 ,收集约 72的馏分。所得馏分重蒸馏 ,收集 7678的馏分 ,避光密闭保存。乙醇:取镁条 2.5g 和碘 0.5g 置无水乙醇 50ml中, 80回流 30min 。补加无水乙醇 600ml ,回流30min 后蒸馏,收集 78的馏分 ,避光密闭保存。甲苯、二氯甲烷、 DMF 和吡啶等试剂均经无水处理。2.1.2 双氯代聚乙二醇 （2取 PEG 2000 80g(0.04mol 溶于

9、甲苯 350ml 中 ,再加入吡啶 8ml 和氯化亚砜 23ml , 120回流 2h 。反应液冷至室温 ,过滤 ,滤液减压蒸除甲苯 ,冷至室温。所得黏稠液体中加入二氯甲烷 300ml 和 Al 2 O 3200g (2mol ,搅拌 2h ,过滤。滤液减压蒸去二氯 甲烷。剩余物滴至冷无水乙醚 2.5L 中,析出白色 沉淀,抽滤,滤饼减压干燥 ,得白色粉末状固体 2 (60g ,以 PEG 2000 计 ,收率为 75%。 Rf0.59展开 剂:氯仿 -二氯甲烷 -甲醇 -正丁醇(5 3 3 0.1, 碘蒸气显色。2.1.3 双叠氮聚乙二醇 (3如上所得 2(60g , 0.029mol 溶于

10、 DMF 400ml 中,加入叠氮化钠 35g (0.54mol , 115回流 2h , 冷至室温 ,过滤。滤液减压蒸除 D M F ,冷至室 温,用二氯甲烷 300ml 溶解,过滤,滤液浓缩后滴 至冷无水乙醚 3L 中沉淀,抽滤,滤饼减压干燥 ,得白色固体 3(52g ,以 2计,收率 87%。 Rf0.71展开 剂:氯仿 -甲醇 -丙酮 -正丁醇(8.2 1 1 1.6,碘蒸气显色。2.1.4 双氨基聚乙二醇 (1将如上所得 3(52g , 0.025mol 溶于无水乙醇 -二氯甲烷(6 1混合溶剂 300ml 中,加 10%钯炭 3g , 室温 5atm 氢化 24h 。反应液经 0.

11、22 m微 孔滤膜抽 滤,滤液浓缩 后滴至冷无水乙醚 3L 中沉淀,抽滤, 滤饼减压干燥 ,得白色 1粗品(46g ,以 3计,收率 88%。2.2 1 的分离纯化先前的研究中 ,本试验室已建立了检测 1纯度 的 HPLC 法 12。利用 TSK- GELG4000 PWXL凝胶渗 透色谱柱上存在的少量荷负电的基团与酸性条件 下荷正电 PEG 的氨基 之间的离子交换作用 ,用低 离子强度的流动相洗脱 ,无氨基取代的 PEG 2000首先被 洗脱,单氨基聚乙二醇次之 , 1再次之。色谱条件如下 :色谱柱 TSK-GEL G4000 PW XL 柱 (7.8mm×300mm, 10m 示

12、, 差 折光检测器 , 流动相 5mmol/L 氯化钠溶液 (pH 4.0, 流速 0.5ml/min, 柱温 25 , 进样量 20 l。 色谱 图见图 1。购得的 PEG 2000、单氨基聚乙二醇和 1保留时间分别为 21.2、 23.6和 30.6min ,测得自制的 1粗品主峰保留 时间基本与购得品相同。照峰面积积分法计 算,粗 品中 1 的含量为 78%。采用 UNOsphere TM Q 强阳离子交换柱 (美国 Bio-Rad , 25mm×120mm, 100m , 用 10mmol/L乙酸盐缓冲液 (pH 5.7平衡色谱柱。取 1粗品 3g , 以注射用水 10m l

13、 溶 解,上柱。梯度洗脱 洗脱液 A :10mmol/L乙酸盐缓冲液 (pH 5.7,洗脱液 B : 60mmol/L 乙酸盐缓冲液(pH 5.7, 100min 内洗脱 液从 100% A转为 100%B ,流速 3ml/min。用 上述 HPLC 法检测洗脱液。合并含单氨基聚乙二醇组分 A :购得品, B :自制粗品1-1; 2-单氨基聚乙二醇 2000; 3-PEG 2000图 1 HPLC 图谱10203040400080001200020004000600010203040At /minB12312中国医药工业杂志 Chinese Journal of Pharmaceuticals

14、 2007, 38(6 ·425的洗脱液,用氢氧化钠溶液调至 pH 9.0,冻干。取 冻干品 2g 上 Sephadex G- 15柱,以注射用水为洗脱 液脱盐,收集洗脱液冻干 ,得 1纯品1.5g ,精制率 50%,纯 度95%(HPLC 法,色谱图见图 2。 2.3 结构表征与相对分子量测定 2.3.1 红外光谱 和 1HNMR红外光谱:K B r 压片,结果见图 3。与 P E G 2000的红外光谱比较 , 1纯品图谱 中 3400cm -1附近 出现一个弱的宽吸收带 ,其强度远低于 o-H (中等强 度,可能为 N-H 特征 峰;两者均在 2887cm -1出现一 个很强的

15、尖吸收带 ,即亚甲基的 c-H 特征峰;另外 亚 甲基对应的剪式振动吸收带位于 1467cm -1处 , 中等强度; 1114cm -1处出现强的尖吸收带为 -co-c 特征 峰。1-1图 2 1 纯品的色谱图4008001200160010203040t /min110.08.06.04.02.04000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500A13121110987654324000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500B图 3 PEG 2000(A 和 1(B 的红外图谱HNMR :溶剂为重水 ,样品浓度为 10mg/ml, 结果

16、见图 4。 1纯品,-NH 2: 2.9(2H , 三重峰 ,图 4 PEG 2000(A 和 1(B 的 1HNMR 图谱8 7 6 5 4 3 2 18 7 6 5 4 3 2 1AB-CH 2-CH 2-O -(PEG 分子中 : 3.33.多8(重 峰。2.3.2 高效分子排阻色谱法测定 1 相对分子量照中国药典 2005年版附录 H 和右旋糖酐 20 (P88的分子量与分子量分布项 下方法测定 1 相对分子量。色谱条件如下 :色谱柱 TSK GEL G2000 SW XL ,示差折光检测器 , 流动 相 0.7%硫酸钠溶液 (含 0.02%叠氮化钠 , 柱温 35, 流速 0.5ml

17、/min,· ·中国医药工业杂志 Chinese Journal of Pharmaceuticals 2007, 38(6 426进样量 20l。 1纯品加流动相制成浓度为 10mg/ml 的溶液,作为供试品溶液。 另取 5个已知分子量的 PEG 对照品,同法制成 10mg/ml 的溶液作为对照品 溶液。分 别进样测定 ,采用 GPC 软件(美国 Agilent 公司, A.02.01版本将保留时间对对照品分 子量线 性回归,由所得的标准曲线计算供试品的相对分子 量。结果表明 , 1的重均分 子量为 2045,分子量分 散程度为 1.0915。3 讨论3.1 1 的制备本

18、实验制备 1 的总收率为 57%,粗品纯度为 78%。在制备过程中应该注意以下 几点 :首先 ,氯 代反应时加入氯化亚砜后会产生大量沉淀 ,这些沉 淀经 TLC 检验后发 现同样含有 2,因此 ,用二氯甲 烷尽可能地将沉淀中的 2 溶解出来与产品合并一起 进 行处理以提高产率 ;其次 ,由于生成的 2 中可能 含有杂质硫 ,而硫的存在将导致后续氢 化还原步骤 中的钯炭催化剂中毒 ,因此在产品中加入活化的氧 化铝以吸附硫及其它 杂质。最后 , 3步反应都是采 用无水乙醚沉淀法得到产品 ,无水乙醚的用量应至 少为 浓缩液的 810倍,且冷的无水乙醚沉淀效果 更好。3.2 1 的分离纯化1粗品中的主

19、要杂质为单氨基聚乙二醇、无氨 基取代的 PEG 2000和少量小分 子物质等。阳离子 交换树脂是以阴离子交换剂为固定相 ,借助于样品 中电离组分对 其亲和力的不同从而达到分离离子型 或可离子化的化合物的目的。一般在阳离子 交换树 脂骨架上引入的酸性基团有磺酸基、羧基和酚羟 基等。在 1纯化过程中 ,首 先将 1 酸化成 NH+-PEG2000-NH3+,根据胺基数目的不同 , PEG 2000、单 氨基聚乙二醇、 1 在阳离子交换树脂上 的吸附性也 依次增强。用乙酸盐缓冲液梯度洗脱可达到分离纯 化的目的。3.3 结构分析IR 图谱中,理论上 -NH在 3500和 3400cm -1附近有两条弱

20、的吸收带 ,但由于 -NH2在 1 中所占 比例少 , 不易显现。与 PEG 2000 图谱比较 , 该处 吸收带的强度显著 低于-OH 的吸收。另外, PEG 的各种特征峰都存在 ,包括 C -H 的伸缩振动峰、 -C H2-的剪式振动峰和 C -O -C 的伸缩振动峰 等。 1HNMR 图谱中,与 PEG 2000图 谱比较,在 2.90处增加了一个三重峰 ,推断是与-CH 2连接的-NH2的化学位移 ,且含与重复结构 -CH2CH 2O 相同的化学位移。 HPLC 检测结果显示自制 1具有与购 得品相同的保留时 间 ,结合分子量等数据 ,可确证 结构。参考文献 :蒋为民 , 王妍 . 蛋

21、白质药物的聚乙二醇修饰 J . 微生物学 免疫学进展 , 2005, 33(4 : 72-75.赵 蓉 , 朱家壁 . 聚乙二醇修饰的立体稳定脂质体 J . 国外 医学 : 药学分册1999, 26(3 : 161-166.卞丽红 , 梅兴国 , 章扬培 . 新一代 PEG 在修饰抗原和药物缓 释中的应用 J . 生 命科学 , 2004, 16(5 : 296-300.赵树进 , 尹 亮 , 郭勇 , 等 . 聚乙二醇修饰后超氧化物岐化 酶的稳定性及其在家 兔体内过程 J . 中国医院药学杂志 , 2003, 23(4 : 193-196.张宇锋 , 谢蜀生 , 侯新朴 , 等 . 具有活性羧基末端的长循 环脂质体的制备和分 布J . 药学学报 , 2000, 35(11 : 854-859.付春晓 . 蛋白的聚乙二醇修饰及其在生物医学领域的应用 J . 国外医学 : 药学 分册 , 2001, 28(2 : 78-81.董炎明 . 高分子材料实用剖析技术 M . 北京 : 中国石化出 版社 , 1997: 80-81.王琴梅 , 潘仕荣 , 张静夏 . 双端氨基聚乙二醇的制备及表征 J . 中国医药工业 杂志 , 20