（食品科学专业论文）植物乳杆菌ZS2058生物转化共轭亚油酸反应体系的研究.pdf

摘要 摘要 共轭亚油酸( c o n j u g a t e dl i n o l e i ca c i d ，c l a ) 是亚油酸( l i n o l e i ca c i d ，l a ) 衍生的 共轭双烯酸的多种位置与几何异构体的总称。它具有很多营养和保健功能，如抗癌、抗 动脉粥样硬化和延缓机体免疫力衰退、减肥等。在共轭亚油酸的各种立体异构体中，c 9 ， t 1 1 一c l a 被认为最具生物活性。由于乳酸菌生物转化共轭亚油酸具有安全性高、专一性 强等优点，目前已经成为合成共轭亚油酸的研究热点。 本文通过结合气相色谱法( c - c ) 、银离子高效液相色谱法( a 矿h p l c ) 和气质联 用法( g c m s ) 三种检测方法，确定了植物乳杆菌z s 2 0 5 8 生物转化c l a 的产物主要 有c 9 ，t 1 1 - c l a 、t 1 0 ，c 1 2 一c l a 及t ，b c l a ，并选择气相色谱法作为本课题的定量检测方 法。 通过比较植物乳杆菌z s 2 0 5 8 完整细胞在有机介质、微水介质、两相介质和水介质 中生物转化c l a 的产量，确定最适合植物乳杆菌z s 2 0 5 8 生物转化c l a 的反应介质为水 介质。 在1 i i l l 磷酸钾缓冲溶液反应体系中，通过单因数实验和响应面分析，确定了最合适 的反应条件为：底物浓度为0 8m g m l ，细胞浓度为4 1 0 1 0c f u m l ，反应温度为3 7 ， 缓冲液p h 值为6 5 。在此反应条件下，c 9 ，t 1 1 c l a 的浓度为3 7 4i - t g m l ，转化率高达 4 6 7 5 。 在此基础上，本论文探讨了底物浓度、细胞浓度、反应体系p h 值、反应温度等因 素对植物乳杆菌z s 2 0 5 8 完整细胞生物转化c l a 的反应速度的影响。实验结果表明存在 明显的底物抑制现象，当l a 浓度达到o 4m g m l 时，产生c 9 ，t 1 1 c l a 的反应速度达到 最大值，为1 5 9 9 肛g ( m l h ) ；反应速度随着细胞浓度增加而上升，当细胞浓度达到5 1 0 1 0c f u m l 时，反应速度达到最高；生物转化c l a 的最适p h 值和最适温度分别为6 5 和4 0 。 同时利用双倒数作图法和h a n e s w o o l f 作图法求得米氏常数，并建立了反应初始阶 段不同底物浓度范围内的速度方程。在低底物浓度下，反应规律与酶学上经典的米氏方 程相符合，米氏常数为：v m 舣：2 1 7 4 “g ( m l h ) ；k m ：o 1 6m g m l 。在高底物浓度下， 存在明显的底物抑制现象，但反应速度方程与经典的底物抑制速度方程存在差异。最后 对所建立的速度方程进行了验证。 关键词：植物乳杆菌，共轭亚油酸，亚油酸异构酶，生物转化 a b s t r a c t a b s t r a c t c o n j u g a t e dl i n o l e i ca c i d ( c l a ) i sam i x t u r eo fp o s i t i o n a la n dg e o m e t r i ci s o m e r so f l i n o l e i ca c i d ( c l s ：2 ，c s 一9 ，c s - 1 2o c t a d e c a d i e n o i c ) c l ah a sp o t e n t i a lh e a l t ho rn u t r i t i o n a l e f f e c t s ，i n c l u d i n ga n t i c a r c e n o g e n i ca c t i v i t y , a n t i a t h e r o g e n i ca c t i v i t y , a n dt h ea b i l i t yt or e d u c e t h ec a t a b o l i ce f f e c t so fi m m u n es t i m u l a t i o na n dt or e d u c eb o d yf a t b e t w e e nt h ei n d i v i d u a l i s o m e r so fc l a ，c 9 ，t1 1 - c l ah a sb e e ni m p l i c a t e da st h em o s tb i o l o g i c a l l ya c t i v e a sl a c t i c a c i db a c t e r i ab i o c o n v e r s i o no fc l ai ss a f ea n ds p e c i f i c i t y , h a sb e e nt h ef o c u so fc o n s i d e r a b l e r e s e a r c he f f o r t si nr e c e n ty e a r s i nt h i sp a p e r , t h r o u g hac o m b i n a t i o no ft h r e ed e t e c t i o nm e t h o d so fg c ，a 矿一h p l ca n d g c - m s ，d e t e r m i n e dt h em a i np r o d u c t so fb i o c o n v e r s i o no fc l ab yr e s t i n gc e l l so f l a c t o b a c i l l u sp l a n t a r u mz s 2 0 5 8w e r ec 9 ，t l1 c l a ，t 1 0 ，c 1 2 c l aa n dt , t c l a t h em o s t s u i t a b l ed e t e c t i o nm e t h o do ft h es u b j e c tw a sg c a c c o r d i n gt ot h ep r o d u c t i o no fc l a ，b i o c o n v e r s i o no fc l ab yr e s t i n gc e l l so f l a c t o b a c i l l u sp l a n t a r u mz s 2 0 58i np o t a s s i u mp h o s p h a t eb u f f e rs y s t e mw a so p t i m i z e db y c o m p a r i n gw i t ho t h e rr e a c t i o nm e d i u m so ft h eo r g a n i cm e d i u m ，m i c r o w a t e rm e d i u ma n d t w o - p h a s em e d i u m 3 7 4l x g m lc 9 t l1 一c l aw a so b t a i n e du n d e rt h er e a c t i o nc o n d i t i o na s f o l l o w s ：o 8 m g m ll as o l u t i o n ，4 x10 1 0 c f u m le e l lm a s s o p t i m a lt e m p e r a t u r e 3 7 a n dt h e o p t i m a lp hv a l u e6 5 c o n v e r s i o nr a t i oo f c 9 t 1 1 c l a w a s4 6 7 5 i nt h i sp a p e r , e f f e c t so ft h es u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o n ，c e l lm a s s ，r e a c t i o np ha n dr e a c t i o n t e m p e r a t u r eo nt h ee a r l yr e a c t i o ns p e e do fp r o d u c i n gc l ab yl p l a n t a r u mz s 2 0 5 8w e r e d i s c u s s e d 。刃船r e s u l t ss h o w e dt h a tm a r k e ds u b s t r a t ei n h i b i t i o nw a se x i s t 。嬲e nt h el a c o n c e n t r a t i o nw a s0 4m g m l ，t h ee a r l yr e a c t i o ns p e e do f p r o d u c i n gc 9 ，t ll - c l ar e a c h e dt h e m a x i m u mv a l u eo f15 9 9l x g ( m l h ) t h ee a r l yr e a c t i o ns p e e da s c e n d e d 埘t l lt h ec e l lm a s s i n c r e a s i n g 飞e nt h ee e l lm a s so f5 101 。u c f u m l t h er e s p o n s er a t ec l o s et ot h em a x i m u m v a l u e t h eo p t i m u mp ha n dt h eo p t i m u mt e m p e r a t u r eo fb i o c o n v e r s i o no fc l aw e r e6 5a n d 4 0 m i l o s e v i cp a r a m e t e r sw e r eo b t a i n e db vd o u b l e r e c i p r o c a lp l o tm e t h o da n dh a n e s w 6 0 l f p l o tm e t h o d t h er e a c t i o nr a t ee q u a t i o n so ft h ei n i t i a lr e s p o n s es t a g ew e r ee s t a b l i s h e du n d e r d i f f e r e n ts u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o n t h er e a c t i o nr a t ee q u a t i o nf o l l o wt h ec l a s s i cm i l o s e v i c e q u a t i o na tt h el o ws u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o n g e tt h em i l o s e v i cp a r a m e t e r sw a s ：v m a x ：2 1 7 4 r w ( m l h ) ，k m 0 16m g m l m a r k e ds u b s t r a t ei n h i b i t i o nw a se x i s t e da tt h eh i g hs u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o n b u to u rr e a c t i o nr a t ee q u a t i o no fh i g hs u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o nw a ss i g n i f i c a n t d i f f e r e n c ef r o mt h ec l a s s i cr e s p o n s er a t ee q u a t i o no fs u b s t r a t ei n h i b i t i o n a tl a s t t h er e a c t i o n r a t ee q u a t i o n sw e r ev e r i f i e du n d e rd i f f e r e n ts u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o n k e y w o r d s ：l a c t o b a c i l l u sp l a n t a r u m ，c o n j u g a t e dl i n o l e i ca c i d ，l i n o l e i ca c i di s o m e r a s e ， b i o c o n v e r s i o n i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签名： 盗盔毖 日 期： 丝堡垒：! z 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定 签名： 绛盔乏 导师签名： 日 期： 1 绪论 1 绪论 1 1 共轭亚油酸( c l a ) 及其生理功能 1 1 1 共轭亚油酸 共轭亚油酸( c o n j u g a t e dl i n o l e i ca c i d ，c l a ) 【l 】可以看成由必需脂肪酸亚油酸( 1 i n o l e i c a c i d ，l a ) 衍生的共轭双烯酸的多种位置与几何异构体的总称。这些位置异构体包括7 ， 一9 ；- 8 ，1 0 ；一9 ，一1 1 ；一1 0 ，a - 1 2 ；a 1 1 ，一1 3 和一1 2 ，1 4 十八碳二 烯酸，其中每个双键可以以顺式( c i s ) 或反式( t r a m ) 构型存在。这样c l a 的立体异 构体就多达十几种甚至更多。其中c 9 ，t l l c l a 和t l o ，c 1 2 c l a 两种异构体被认为最具 生物活性，特别是c 9 ，t 1 1 c l a ，见图1 1 。这是因为c 9 ，t 1 1 - c l a 是唯一能被动物细胞 吸收进入其磷脂层的共轭亚油酸异构体【2 j ，同时c 9 ，t 1 1 - c l a 也是在人们的日常食物中含 量最高的共轭亚油酸异构体。而t 1 0 ，c 1 2 c l a 在改善人体的身体组成【3 】，减肥等州方面 具有明显的效果。 图1 1亚油酸和两种主要共轭亚油酸图 f i g 1 1s t r u c t u r eo fl i n o l e i ca c i da n dt w om a i ni s o m e r so fc o n j u g a t e dl i n o l e i ca c i d 天然c l a 广泛分布在许多食品中，包括乳制品、肉和一些植物产品等，但其组成 和含量因来源不同有很大的差异。研究表明天然c l a 主要存在于瘤胃动物牛、羊等的 乳脂及肉制品中，每克乳脂中c l a 含量从2 - - 一2 5m g 不等，且c l a 的含量随奶牛的年 龄增长而增加【5 】。植物来源的c l a 研究表明，有生理活性的两种异构体尚未在天然植物 油中发现，所以c l a 不可能从天然植物中大量获得。因此，主要通过人工合成大量c l a 。 通常以l a 或富含l a 的植物油为底物，通过碱催化【6 】的异构化反应可合成c l a ，或者 以酸为催化剂的油酸烯丙醇脱水法合成c l a ，化学法合成得到的c l a 是多种异构体的 混合物。最新改进的人工合成方法主要是微生物法合成c l a ，许多微生物在代谢过程 中都会产生c l a ，工业上使用最多的是乳酸菌【7 1 。 1 1 2 共轭亚油酸的生理功能 c l a 是一种令人感兴趣的营养添加剂，已大量用于农业和食品工业。活性c l a 是 江南大学硕士学位论文 一种很强的抗癌物质，具有抗动脉粥样化形成、抗糖尿病、抗氧化、抗疲劳、增强免疫 力、调节血糖、及改善睡眠等功能1 1 。以下简述c l a 的几种主要的生理功能。 1 1 2 1 癌症抑制作用 t h m p o s o n 1 2 j 等研究发现c l a 能使显著癌变的导管泡状表皮显著萎缩，降低其不断 增殖的活性。原因可能是c l a 能够抑制其上皮组织的增生以及提高其周围细胞的休眠 比例。v i s o n n e a u 1 3 】的研究还表明c l a 能阻止动脉瘤扩散到肺部、骨组织等，而l a 则 能促进肿瘤的生长。i p c 等人f 1 4 1 5 】做过实验，在给老鼠喂食致癌剂d m b a ( 7 ，1 2 二甲基 苯并蒽) 前的两个星期开始用含c l a 的食物喂养出生3 7 天的老鼠，结果老鼠癌症的发 病率分别下降了1 7 、4 2 和5 0 ，乳腺肿瘤的数目分别减少了3 2 、5 6 和6 0 。除了乳腺 癌外，饮食中的c l a 对皮肤癌、前胃癌等癌症均有抑制作用。 1 1 2 2 抗动脉粥样硬化 用添加o 5 天c l a ( 相当于o 5 ) 的含0 1 胆固醇的食物喂养兔子2 2 周【1 6 】， 发现血清中低密度脂蛋白一胆固醇的浓度及血清中甘三酯的浓度下降，从而减轻了动脉 硬化病变的程度。此外，在用含o 1 2 胆固醇的食物喂养仓鼠的实验中，饮食中添加c l a 同样降低了血清中胆固醇及甘三酯的浓度。 1 1 2 3 减肥作用 研究表明，体内c l a 对身体脂肪的降低可归结于减少脂肪沉积和增加脂肪细胞中 脂肪酸的氧化分解。c l a 至少以两种不同的方式抑制脂肪细胞的形成。在细胞增生阶 段，用c l a 处理能抑制细胞数目，并减少5 一溴2 尿苷( b r d u ) 的结合和随后的分化。在 分化诱导期( 在细胞达到融合后) 用c l a 处理3 t 3 l l 细胞不影响细胞数目但抑制细胞 的分化。c l a 对3 t 3 l 1 细胞分化的抑制是与剂量相关的。饮食中c l a 通过减小脂肪 组织中脂肪细胞的体积来达到减肥的效果，而不是体外实验所表现的抑制3 t 3 l 1 前脂 肪细胞增殖或减少脂肪细胞数目的结果【1 7 1 。 1 2 共轭亚油酸的分析检测 目前c l a 的分析方法主要有紫外( u v ) 检测法、气相色谱法( g c ) 1 8 , 1 9 、高效液 相色谱法( h p l c ) 1 2 0 , 2 1 和气质联用( g c m s ) 。各种方法都有优缺点，以下简述几种检 测c l a 的主要方法。 1 2 1 紫外检测法 该法利用c l a 在2 3 2 - - - 2 3 4n 1 1 1 的紫外区有特征吸收，而l a 却没有的特点，故色谱 上常在这个波长下检测c l a 的存在及含量，一些学者报道了他们对这种方法的研究和 使用( 捌。紫外检测法不能够对c l a 的不同异构体加以区别，检测结果为各种c l a 异 构体的总和。紫外检测法所用仪器价格便宜、检测成本低、操作简便快速，因此适用于 大批量样品的检测。 2 1 绪论 1 2 2 气相色谱法 g c 分析法是脂肪酸的常规分析方法，具有快速、高效、灵敏的优点。主要根据脂 肪酸碳链长短和不饱和度进行分离。g c 法也是目前应用最广的分析c l a 异构体的方法， 但用该法分析c l a 异构体对色谱柱要求很高，普通的用于分析脂肪酸的色谱柱不能有 效地分离各异构体。毛细管柱气相色谱法【l8 】是分离c l a 异构体混合物的经典方法，尤 其是极性非常强的毛细管柱在c l a 分析中能达到较好的分离效果，如c p s i l 8 8 ( 1 0 0m o 2 5m mi d 0 2i l j n ：c h r o m p a c k l t d ) ，b p x 7 0 ( 1 2 0m xo 2 5i i l i ni d 0 2 5p a n ；s g e ) 或s p 2 5 6 0 ( 1 0 0m x0 2 5m l ni d 0 2l x m ；s u p e l c oi n e ，b e l l e f o n t e ，p a ) 。普通的弱极 性毛细管柱只能分出主要的异构体，如c 9 ，t l l t 9 ，e 1 1 和t 1 0 ，e 1 2 c l a 。 1 2 3 高效液相色谱法 目前，a 矿一h p l c 分析法越来越广泛的用于分析不饱和脂肪酸，它利用a 矿浸渍色 谱柱对c l a 的特异性吸附作用可将大部分c l a 异构体分开【2 1 1 。主要由于不饱和脂肪酸 中的两个双键作为电子供体，a 矿作为电子受体形成稳定的络合物。络合物存在一对孤 对电子，体现为一个双键，根据该双键位置和几何结构进行分离【2 3 1 。将多根银离子高效 液相色谱柱串联起来，可以显著提高c l a 位置和几何异构体的分离效果。随着串联色 谱柱的增加( 从一根到六根) ，其分离效果逐步提高。通常串联两根或三根色谱柱就可 以满足大多数分析的要求。但是用该法分析c l a 对液相色谱设备要求很高，而且 a 矿一h p l c 柱的价格非常昂贵，对样品的纯度要求较高，流动相平衡的时间较长。因此， 大多数试验中，多采用气相色谱法来分离c l a 异构体。 1 3 共轭亚油酸的合成 目前合成c l a 的方法主要有化学法和生物法两种。化学法合成c l a 具有转化率高、 产量高等特点，所以目前工业上应用较多，但化学法的缺点是产品中各种异构体形式并 存，无选择性，而且产品还存在溶剂残留问题。生物法虽然转化率较低，但生物转化 c l a 具有特异性，产物中具有生理活性的c 9 ，t l1 - c l a 含量较高，其它异构体含量很少， 产品安全性较高，越来越受到人们的关注。 1 3 1 化学法合成c l a 其中c l a 的化学合成法主要有碱异构化法、油酸烯丙醇脱水法和蓖麻油合成法等， k i m l 2 4 报道了一种快速、简易、可大量制备高纯度c l a 的方法，将含l a 7 9 9 的红花 油在高温下碱异构，反应物和尿素溶于乙醇中，5 0 保温回流lh ，然后置4 下2 4h ， 滤出液在4 0 旋转蒸发。残余物溶于正己烷，用蒸馏水洗涤正己烷抽提物3 次，并用 无水n a 2 s 0 4 脱水，得到c l a 的纯度为9 5 ，该法非常适合富含l a 的植物油。 碱异构化是研究较早，也是研究较充分的一种合成c l a 的技术。市场上销售的c l a 产品多数是碱催化共轭化的产品。碱性异构化的主要缺点是所得产品为几种异构体的混 合物，产品中c 9 ，t 1 1 - c l a 约占2 0 4 0 ，e 9 ，t 1 1 与t 1 0 ，c 1 2 c l a 异构体的比例约为 1 ：l 【2 5 1 。由于不同异构体的生理作用不同，分离获得单个异构体的技术尚未成熟，使该 江南大学硕士学位论文 法的应用在某些领域内受到限制。 1 3 2 生物法合成c l a 生物合成c l a 的方法主要是利用瘤胃细菌如溶纤维丁酸弧菌( b u t y r i v i b r i o f i b r i s o l v e n s ) 【2 6 1 、乳酸菌如( l a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u s 2 7 1 ；l a c t o c o c c u s l a c t i s 2 引、 b i f i d o b a c t e r i u m 2 9 1 ，l a t o b a c i l l u sp l a n t a r u m l 3 0 】等) 来生物合成c l a 。生物法的转化率相 对于化学合成法较低，但是生物法合成c l a 具有特异性强，产物中的c 9 ，t l1 - c l a 含量 高，其它异构体含量少等特点，而且生物法转化c l a 产品的安全性较高。溶纤维丁酸 弧菌( b u t y r i v i b r i o f i b r i s o l v e n s ) 等瘤胃细菌由于严格厌氧而不能应用于工业生产c l a ， 而乳酸菌一般是兼性厌氧菌，容易培养，而且乳酸菌具有比瘤胃细菌更强的生物转化 c l a 的能力。因此，近年来关于利用乳酸菌生物合成c l a 的研究得到了科学家们的广 泛关注。 研究表明，c l a 生物合成途径主要有两种，一种是亚油酸异构酶先作用于l a 使之 发生异构化，生成c l a ，接着氢化酶作用于c l a 使之最终氢化为硬脂酸，这种途径p i “j 常见于瘤胃细菌生物转化c l a 的过程【2 8 】；第二种是l a 不是从非共轭双键经一步异构化 而成为共轭双键，而是涉及到中间产物羟基脂肪酸的合成，然后进一步脱水形成c l a ， 这种途径则常见于乳酸菌生物转化c l a 的过程【3 0 1 。此外，还有一种认为乳酸菌中存在 亚油酸异构酶，能将l a 或具有类似结构的其他游离脂肪酸异构化为c l a 。 生物合成c l a 的反应体系主要有水相体系、非水相体系，目前国内外大部分生物 转化c l a 的研究还是集中在水相体系中反应，在非水相体系中生物转化c l a 的报道较 少。 早在19 6 0 年b r o w n 和m o o r e 3 3 】就发现严格厌氧菌b u t y r i v i b r i of i b r i s o l v e n s 能部分 氧化l a 成为c l a ，发现c l a 是l a 转化成硬脂酸和油酸的中间产物，并在第二年【3 4 1 从该菌中成功分离纯化出亚油酸异构酶，这是人们首次从微生物细胞内分离出亚油酸异 构酶；但是由于溶纤维丁酸弧菌( b u t y r i v i b r i o f i b r i s o l v e n s ) 严格厌氧，在实验室中都很 难培养不适合进行工业化生产。此后，f u j i m o t o 3 5 】、m a r t i nsa 【3 6 j 、t r o e g e l e r - m e y n a d i e r a 【3 7 1 、l i l i a n as p i p e r o v a 【3 8 】都对b u t y r i v i b r i of i b r i s o l v e n sa 3 8 进行过研究。2 0 0 2 年 r a i n i o a 3 8 】利用p r o p i o n i b a c t e r i u mf r e u d e n r e i c h i i ，在加乳清的培养基里直接进行培养，然 后洗涤收集细胞，放入含有4 o m m l 的l a 的磷酸盐缓冲液中进行休止反应，发现c l a 的转化率达到4 6 ，这是当时报道的利用休止反应转化c l a 最高产率。 由于肠道中的厌氧菌群生长条件苛刻，而乳酸菌是较为安全的菌群，又是兼性厌氧 菌，容易培养，所以对其合成c l a 研究最多。按年代总结起来，主要有j i a n g 引、p a r i z a m w f 删、l i n t y 【4 1 1 、o g a w a j l 2 6 、h a m js f 4 2 1 、k i m y j f 2 7 1 、k s h i n os 1 4 3 】以及a l o n s oi i 删 等人。1 9 9 9 年美国科学家p a r i z a 【4 0 j 报道了一株乳酸杆菌( l a c t o b a c i l l u sr e u t e r i ) 具有一 种细胞膜结合酶，它能以游离的l a 为原料合成c l a 。2 0 0 1 年日本的科学家o g a w a 等 【2 6 】报道了嗜酸乳酸杆菌a k u113 7 以l a 为原料转化为c l a 的过程不是从非共轭双键 经一步异构化而成为共轭双键，而是涉及到中间产物羟基脂肪酸的合成，这是首次揭示 4 1 绪论 l a 到c l a 的转化机制。2 0 0 2 年美国c o m e l l 大学科学家l i u 等人【2 8 】以葵花子油为底物 筛选出一株可以转化l a 为c l a 的乳酸乳球菌，该结果表明乳酸菌不仅可以将游离的 l a 也可以将甘油三酯形式的l a 转化成c l a 。2 0 0 3 至2 0 0 6 年间，日本科学家 o g a w a 4 3 ，4 5 4 引等继续研究生物转化c l a ，研究发现植物乳杆菌a k u1 0 0 9 a ，植物乳杆菌 j c m1 5 5 1 能转化蓖麻油酸和蓖麻油为c l a ，各菌种对c l a 的转化率有较大的差异。 2 0 0 6 年美国科学家s u s a n 4 9 j 等通过d e a e ，聚焦色谱和凝胶色谱方法，从梭状芽孢杆菌 上分离到膜结合的亚油酸异构酶。l e e 5 0 】等人利用l a c t o b a c i l l u sr e u t e r i 在含用0 9g l 的 l a 的m r s 中诱导培养2 4h ，然后洗涤细胞放入p h 7 5t r i s h c l 进行休止细胞反应，发 现其与在培养液m r s 中休止细胞相比较，利用缓冲液休止细胞进行休止反应时，c l a 合成量较低。而且随着休止反应的外部环境的改变，转化的特征也发生改变。 国内对生物转化c l a 的研究起步较晚，2 0 0 3 年台湾大学l i n 教授等人【5 l 】通过溶菌 酶、超声波破壁和硫酸铵沉淀等方法首次从嗜酸乳杆菌( l a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u s c c r c l 4 0 7 9 ) 中提取出乳酸菌亚油酸异构酶的粗酶液。但是对乳酸菌来源的亚油酸异构 酶的进一步研究还没有相关的报道。2 0 0 4 年，张中义【5 2 j 等筛选了一株具有转化c l a 能 力的植物乳杆菌，同年，本实验室周凌华【5 3 】也筛选到一株具有转化c l a 能力的植物乳 杆菌z s 2 0 5 8 ；胡国庆【5 4 】对不同体系中植物乳杆菌z s 2 0 5 8 生物转化c l a 进行了初步研 究。2 0 0 4 年至2 0 0 6 年柴秋儿【5 5 6 9 】等对植物乳杆菌生物转化c l a 的特性进行了研究。2 0 0 5 年，苗士达【6 0 】等通过硫酸铵沉淀，阴离子交换和凝胶过滤，首次从植物乳杆菌l 2 9 分 离到了亚油酸异构酶。2 0 0 7 年本实验室钮晓燕【6 l 】也对植物乳杆菌z s 2 0 5 8 完整细胞生物 转化c l a 的条件进行了研究。 非水相生物催化反应，是指催化反应发生在含有底物的非水介质中并且产生的产物 也进入该介质中的一类生物催化反应【6 2 】。将有机溶剂作为反应介质有如下特点： 1 ) 很好解决了底物在水相不溶的问题； 2 ) 影响反应的选择性 3 ) 减少水相中可能发生的副反应 4 ) 有利于产物、提高得率 5 ) 非极性溶剂中增加催化剂的稳定性 6 ) 对生物催化剂有毒性，降低活性 7 ) 要求与传统生物催化的不同位置 8 ) 需要控制水份活度 9 ) 增加了反应系统复杂性 所以研究较为广泛，几乎每天都有一篇论文问世【6 2 侧。完整细胞在有机相的催化反 应是当今生物催化领域的一个新课题，但目前仍处于实验研究阶段【6 5 | 。有机溶剂可以增 加底物、产物在反应体系中的扩散性来提高产物的得率。而有机溶剂对微生物细胞有一 定毒害作用，这种毒害作用可能与有机溶剂的极性有密切关系，跟细胞的结构和功能也 有关。微生物细胞对有机溶剂有一定的耐受性，不同微生物对有机溶剂的耐受性不刚6 6 】。 影响完整细胞在有机相催化反应的因素很多，主要有：介质的性质、介质浓度、反应温 5 江南大学硕士学位论文 度、底物和产物的性质等。这些因素不仅直接对反应产生影响，而且各因素之间还会相 互影响。所以利用完整细胞生物合成某些疏水性的物质存在较大潜力。然而利用完整细 胞在非水相合成c l a 报道不多，而且转化效果都普遍不好。 1 4 亚油酸异构酶的研究进展 亚油酸异构酶( l i n o l e a t eis o m e r a s e ) 是一种将l a 催化异构化产生c l a 的异构酶， 可来源于多种细菌和真菌。l a c t o b a c j - 姻，c o s t r i d i u m 、p r o p i o n i b a c t e r i u m 、 b u t y r i v i b r i o 、e u b a c t e r i u m 、f u s o c i l l u s 、p e d i o c o c c u s 、a e r o c o c c u s 等微生物都有 l i 活性口9 3 4 - 6 7 。6 9 】。另外，c o a k l e y 等【7 0 】从b i f e d o b a c t e r i u m 中也筛选到具有亚油酸异 构酶活性的菌株。亚油酸异构酶具有较强的生物转化c l a 的能力，因此研究利用亚油酸 异构酶生物催化合成c l a 具有很大的优势和发展前景。 1 9 6 7 年k e p l e r 和t o v e 发现在b u t y r i v i b r i o f i b r i s o l v e n s 中具有亚油酸异构酶。他们发 现即使在有氧的条件下，亚油酸异构酶仍旧能够继续合成c 9 ，t 1 1 - c l a ；他们还发现亚油 酸异构酶催化速率较快，而且能适应较宽的p h 范围【3 4 1 。他们的研究还表明亚油酸异构 酶位于细菌的细胞膜上，并且只作用于具有c i s 9 ，e i s 1 2 共轭二烯结构而且羧基游离的 脂肪酸【3 4 1 。但是，他们没有很好解决亚油酸异构酶的溶解问题，因此没能成功分离出亚 油酸异构酶。o g a w a 发现三a c i d o p h i l u sa k u l l 3 7 能在微氧条件下将l a 转化为c l a ， 而且细菌在含有亚油酸的培养基中生长时，产c l a 的水平有很大的提高，表明亚油酸 异构酶受亚油酸的诱导产生，是一种诱导酶【2 6 1 。后来的研究表明，不同的微生物具有不 同的亚油酸异构酶，能够合成相应得不同的c l a 异构体，酶的作用位点也因酶的不同 而相应改变。 l i n 等【7 2 】用m r s 肉汤培养嗜酸乳杆菌，离心收集菌体后依次用溶菌酶和超声波破 壁，离心收集粗酶，再进行完全盐析、透析( f p l c 检测) ，然后用膜( 孔径0 2 2 1 a m ) 过滤， 离心浓缩，最后用分子量大于1 0 0 k d a 的膜收集目的酶，达到了较好的纯化效果。苗士 达等【6 0 】通过硫酸铵沉淀、阴离子交换层析和凝胶过滤层析从植物乳杆菌l 2 9 分离纯化 到了亚油酸异构酶，纯化倍数为3 7 9 ，比活力为1 1 5 9 2u m g ，分子量约为4 3k d a 。r o s s o n 等 4 9 , 7 1 】人通过盐析、阴离子交换层析( d e a e 5 p w 色谱柱) 、聚焦色谱、凝胶过滤层析 ( 1 6 x 5 5 c ms u p e r d e x 2 0 0 色谱柱) 等纯化手段，得到了cs p o r o g e n e s 、lr e u t e r i 、户a c n e s 的亚油酸异构酶，其比活力是粗酶提取物酶活的3 5 0 4 8 0 倍；s d s p a g e 电泳分析表明， cs p o r o g e n e s 亚油酸异构酶的分子量大约为4 5 k d a ，三r e u t e r i 的大约6 8k d a ，pa c n e s 的大约5 5k d a ：酶学性质的研究结果表明，在c 9 ，t l l 位置上不含顺式双键的c 1 8 c 2 2 多烯脂肪酸中，只有c i s 1 1 ，c i s 1 4 二十碳二烯酸才能够被异构化，一般在第一双键位置 之后还有9 个碳原子的c 1 8 c 2 2 不饱和脂肪酸能够被亚油酸异构酶异构化；并对其酶反 应动力学和抑制动力学进行了研究，初步建立了动力学方程。结果表明，在底物浓度较 低时，反应遵循经典的米曼氏方程。但进一步发现该酶的底物抑制现象与经典的底物 抑制动力学方程不符 近年来关于生物法合成c l a 的研究越来越多，报道的能够合成c l a 的微生物多为 6 1 绪论 乳酸菌、丙酸菌等，但菌株来源不同的亚油酸异构酶的酶学性质及反应动力学都有所不 同。目前，关于亚油酸异构酶的底物抑制机理尚不明白，有待进一步深入的研究。对亚 油酸异构酶的认识还比较浅，但相信，随着研究不断深入，更多、性能更优的亚油酸异 构酶会逐渐得到开发和利用。 1 5 立题意义及主要研究内容 1 5 1 立题意义 c l a 是具有多种生理功能的脂肪酸，是有关膳食脂肪酸研究的国际前沿热点；研究 利用植物乳杆菌z s 2 0 5 8 完整细胞催化合成c l a ，并对其中关键因素进行研究，对于实 现c l a 的生产和研究c l a 的生理功能具有十分重要的理论价值和应用意义。 由于生物转化c l a 的产物中多种异构体共存，不同菌种之间c l a 各异构体的组成 也存在差异，副产物也不一样，因此对反应产物需采用多种检测方法进行确定。如o g a w a 等【3 0 】筛选到的嗜酸乳杆菌a k u l l 3 7 生物转化l a 能产生c 9 ，t 1 1 、t 9 ，c l l 、和t 9 ，t l1 - c l a 三种c l a 异构体；l e e 掣5 0 】筛选到的路氏乳杆菌a t c c 5 5 7 3 9 生物转化l a 的转化产物 为c 9 ，t 1 1 和t 1 0 ，c 1 2 c l a 两种c l a 异构体；对于本试验室的植物乳杆菌z s 2 0 5 8 ，据钮 晓燕等人【6 1 1 报道，生物转化c l a 的产物有c 9 ，t l1 - c l a 、t 1 0 ，c 1 2 c l a 及副产物羟基脂 肪酸。由于当时对该结果没有采用精确的分析方法进行鉴定，因此在本文需对此进行进 一步实验验证。 据报道，目前g c 法检测c l a 的毛细管柱多为6 0m 的s u p e l c o w a x1 0 和1 0 0m 的 s p 2 5 6 0 和c p s i l 8 8 ，未见用1 2 0m 的b p x 7 0 用于检测c l a 的报道。同时，单一用g c 检测方法不能将所有的c l a 异构体分离，也不能将所有的副产物定性。而有文献报道， 近年来发展的a 矿h p l c 可以将g c 不能分离的c l a 异构体峰检出，且其对c l a 异构 体的分离效果也较好。因此本文通过利用基于1 2 0 m 的气相柱的g c 法和a 矿h p l c 法 及能对分子量进行鉴定的g c m s 法的有效组合来确定生物转化c l a 的产物组成。 亚油酸异构酶很难分离纯化，热稳定性差，p h 作用范围窄【_ 乃】，所以采用微生物完 整细胞来转化生成c l a 成为近几年的研究热点。很多研究表明，利用乳酸菌洗涤细胞 的催化能力在微氧条件下转化生成c l a 具有更好的发展前景【2 6 , 7 4 ，因为：( 1 ) 得到的 反应产物是具有生理活性的c l a 即c 9 ，t l l c l a 或t 1 0 ，c 1 2 c l a ：( 2 ) c l a 能以高浓度 积累；( 3 ) 产物c l a 以游离形式积累在细胞外，容易离心收集，也可以将细胞直接作 为c l a 的来源；( 4 ) 反应只需要在微氧条件下进行，不需要提供能量；( 5 ) 洗涤细胞 被用作静止细胞或c l a 合成过程中亚油酸异构酶的储存袋，省去了亚油酸异构酶的分 离纯化等繁琐过程。 尽管国内外科学家对乳酸菌生物转化c l a 进行了大量的研究，也筛选出一些具有 c l a 合成能力的乳酸菌，并对乳酸菌生物转化c l a 的机理进行了探讨，如提出亚油酸 异构酶是乳酸菌合成c l a 的关键酶等，并从乳酸菌细胞内提取出了亚油酸异构酶的粗 酶液。但是，生物法转化c l a 的转化率较化学法低，并且对乳酸菌亚油酸异构酶的产 生机理、亚油酸异构酶的酶学性质和亚油酸异构酶在反应体系中的催化动力学等都还没 7 江南大学硕士学位论文 有进行更深入的研究。 本实验室已经筛选到一株具有生物转化c l a 能力的植物乳杆菌z s 2 0 5 8 ，并对其在 磷酸钾缓冲溶液体系中的转化条件进行了初步探讨【6 1 1 。在此基础上，本课题以植物乳杆 菌z s 2 0 5 8 完整细胞为研究对象，了解其催化转化机理，通过对影响其催化转化的关键 因素包括反应介质、反应速度和反应条件进行优化等研究，初步建立其生物转化c l a 的 速度方程，为实现生物法合成c l a 提供理论依据和实践指导。 1 5 2 主要研究内容 本文的主要研究内容是通过比较不同反应介质中植物乳杆菌z s 2 0 5 8 生物转化c l a 的产量，确定最适合的反应介质；对最适反应介质下的反应条件进一