（应用化学专业论文）聚丁二烯微透镜阵列蛋白质电化学性质研究.pdf

摘要 摘要 研究蛋白质与电极之间的直接电子传递对了解生物体内的能量转换和物质 代谢具有重要的理论和实践价值。本论文直接固定细胞色素c 于聚丁二稀微透镜 阵列与聚丁二稀微透镜阵列金胶纳米粒子修饰的玻碳电极上，研究了细胞色素 c 与电极之间的直接电化学及溶液p h 值、电解质浓度等对细胞色素c 电子传递 的影响。 固定在聚丁二稀微透镜阵列上的细胞色素c 在0 1 m n l o l l 、p h 6 8 9 的p b s 缓冲溶液中，呈现一对稳定的氧化还原峰，其式电位为7 2 m v ，在2 0 1 0 0 m v s 扫速范围内，其阴极峰电流与扫速成线性关系，表面该电极反应为典型的表面 控制的准可逆过程。固定在p b g c 电极上的c y tc 具有类过氧化物酶活性，对 过氧化氢还原具有快速的安培响应和电催化作用，催化电流与过氧化氢浓度在 2 1 0m m o l l 范围内成线性。 固定在聚丁二稀微透镜阵列金胶修饰玻碳电极上的细胞色素c 在 0 1 m m o l l 、p h 7 0 的p b s 缓冲溶液中，呈现一对稳定的氧化还原峰，其式电位 为6 7 m v ，在2 0 1 0 0 m v s 扫速范围内，其阴极峰电流与扫速成线性关系，表面 该电极反应为典型的表面控制的准可逆过程。由n i c h o l s o n 方程求得c y tc 在聚 丁二稀微透镜阵y 0 金胶纳米粒子修饰玻碳电极表面电子传递速率常数k o 为 4 5 9 x10 4c m s ，这是金胶纳米粒子促进了电子的传递。固定在聚丁二稀微透镜 阵列金胶纳米粒子修饰玻碳电极表面的c y tc 具有类过氧化物酶活性，该传感器 对过氧化氢还原具有快速的安培响应，5s 内可达9 5 的稳态电流，其表观米氏 常数k 汐值为2 6 7 m m ，线性范围为2 1 2m m o l l 。 关键词：细胞色素c ；聚丁二稀；微透镜阵列；电催化；直接电化学 东北电力火学硕上学位论文 a b s tr a c t d i r e c te l e c t r o nt r a n s f e rb e t w e e nr e d o xp r o t e i n sa n de l e c t r o d e si so fp r a c t i c a la n d t h e o r e t i c a li n t e r e s tf o rt h er e a l i z a t i o no ft h eb i o l o g i c a le n e r g yt r a n s f e ra n ds u b s t a n c e m e t a b o l i z a b i l i t y i nt h i sp a p e r ，d i r e c te l e c t r o nt r a n s f e rb e t w e e ni m m o b i l i z e dc y tc a n dp bm i c r o l e na r r a yf i l mm o d i f i e dg l a s sc a r b o ne l e c t r o d e sa n db e t w e e n i m m o b i l i z e dc y tca n dp bm i c r o l e na r r a yf i l m c o l l o i d a lg o l dn a n o p a r t i c l e ss y s t e m m o d i f i e dg l a s sc a r b o ne l e c t r o d e sw e r es t u d i e d t h ea d s o r b e dc y tcd i s p l a y e dap a i ro fr e d o xp e a k si nlo o m m o l lp b sb u f f e r w i t haf o r m a l p o t e n t i a l o f 7 2m v ( v s a g a g c l ) n er e s p o n s es h o w e da s u r f a c e c o n t r o l l e dr e d o xp r o c e s sa ts c a nr a t e sf r o m2 0t o10 0m vs c y tca d s o r b e d o np bm i c r o l e na r r a yf i l mm a i n t a i n e di t sb i o a c t i v i t ya n ds t a b i l i t y 1 1 1 ei m m o b i l i z e d c y tcc o u l de l e c t r o c a t a l y z et h er e d u c t i o no fh y d r o g e np e r o x i d er e s u l t e di nag r e a t i n c r e a s eo ft h er e d u c t i o np e a kc u r r e n t n l el i n e a rr e l a t i o nf o rh 2 0 2d e t e r m i n a t i o nw a s f r o m2t o1 0m m o l l t h ea d s o r b e dc y tcd i s p l a y e dap a i ro f r e d o xp e a k si no 1m o l lp b sb u f f e rw i 廿l af o r m a lp o t e n t i a lo f6 7 m v ( v s a g a g c l ) t h er e s p o n s es h o w e das u r f a c e c o n t r o l l e d r e d o xp r o c e s sa ts c a nr a t e sf r o m2 0t o10 0m v s t h ee l e c t r o nt r a n s f e rr a t ec o n s t a n t s k uo fc y tca tp bm i c r o l e na r r a yf i l m - c o l l o i d a lg o l dn a n o p a r t i c l e ss y s t e mm o d i f i e d g l a s s ye l e c t r o d e sw e r e4 5 9 x10 珥c m s 。1a c c o r d i n gt ot h en i c h o l s o n se q u a t i o n c y tc a d s o r b e do ng o l dc o l l o i dn a n o p a r t i c l e sm a i n t a i n e di t sb i o a c t i v i t ya n ds t a b i l i t y t h e i m m o b i l i z e dc y tcc o u l de l e c t r o c a t a l y z et h er e d u c t i o no fd i s s o l v e do x y g e nr e s u l t e di n ag r e a ti n c r e a s eo ft h er e d u c t i o np e a kc u r r e n t t h ea p p a r e n tm i c h a e l i s m e n t e n c o n t a n tk 黟f o rh 2 0 2s e n s o rw a se s t i m a t e dt ob e2 9 7m ms h o w i n gah i g l la f f i n i t y k e yw o r d s ：c y t o c h r o m e ( c y t c ) ；p o l y b u t a d i e n e ；m i e r o l e na r r a y ；e l e c t r o c a t a l y s i s ； d i r e c t e l e c t r o c h e m i s t r y i l 论文原创性声明 本人声明，所呈交的学位论文系在导师指导下本人独立完成的研究成果。 文中依法引用他人的成果，均已做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法 律意义上已属于他人的任何形式的研究成果，也不包含本人已用于其他学位申 请的论文或成果。 本人如违反上述声明，愿意承担以下责任和后果： 1 交回学校授予的学位证书： 2 学校可在相关媒体上对作者本人的行为进行通报； 3 本人按照学校规定的方式，对因不当取得学位给学校造成的名誉损害， 进行公开道歉； 4 本人负责因论文成果不实产生的法律纠纷。 o 一 论文作者签名： 鱼! ! 塑日期：年月日 论文知识产权权属声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属东北电 力大学。学校享有以任何方式发表、复制、公开阅览、借阅以及申请专利等权 利。本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时， 署名单位仍然为东北电力大学。 论文作者签名： 墨匦日期：年月日 导师签名： 第1 镦绪论 第1 章绪论 1 1 课题的意义 一切生物的生命过程都是建立在其生物大分子的结构、运动及其相互作用 的基础之上的，作为生命科学的基本内容，有关生物大分子的理论和应用的研 究就显的尤为重要。蛋白质是一类重要的生物大分子，广泛存在于各种生物组 织细胞，是生物细胞最重要的组成物质。1 9 世纪有机化学发展后，人们力逐渐 认识蛋自质的纯学本质。 用电化学手段研究生物大分子( 特别是氧化还原蛋白质和酶) 的电子传递过 程，弓| 起国内外化学家和生物学家的广泛关注，因为生物大分子翻电极之间的 电子传递过程更接近生物氧化还原系统的原始模型【1 】。蛋白质作为一类典型的 生物大分子和特殊催化剂，在生命过程中扮演着极为重要的角色。研究蛋自质 直接电化学为探索蛋白质在生命体内的电子交换提供模型，可以方便地获得蛋 白质的热力学和动力学性质，有助于深入了解蛋白质电子传递过程；其次由于 蛋囱质直接电化学涉及界面专一性，界面褶容性和蛋自质的变形闯题等，因此 在研究过程中得到很多关于生物大分子界面问题的启示，进而模拟生物体内的 电予传递过程；再次，麸应用的角度来说，这项研究把电极与生物大分子联系 起来，可以获得一种专一的电催化模式，以实现高灵敏度和高选择性的分子传 感，为发展生物传感器奠定了基础。因面，研究氧化还原蛋自质与电极之间的 直接电子传递在生命科学、环境科学、能源科学和分析化学中具有重要的理论 和实践意义瞒j 。 1 2 氧化还原蛋白质的直接电化学 实现蛋岛质与电极之闯电子转移必须将生物大分子的电化学活性中心与电 极距离缩短到i n t o e 3 】或使生物的分子与电极表面活性基团键合，以形成电子传 输通道【4 】。但迄今为止，只戎察到极少数氧化还原蛋自质在裸固体电极上表现 出电化学活性【5 1 。这主要是由于多数蛋白质的电活性基团被深埋在其多肽链的 东北电力大学硕l ：学位论文 内部，与电极表面距离较远，很难与电极表面直接交换电子；蛋白质在电极表 面的取向往往不剩予其电活性基团与电极的电子交换；某些杂质在电极表面上 的吸附或蛋白质本身的吸附变形可能阻碍它们与电极间的直接电子转移，因而 得不到有效的电流响应。 多年来科学工作者不断地探索各种途径，为建立蛋自质快速电子传递反应 过程，实现体内蛋白质生理反应过程的电化学模拟，揭示生物氧化还原系统中 电子传递的速度和可逆程度。 实现氧化还原蛋白质与电极之间的直接电子传递并非易事。 首先，根据m a r c u s 电子转移理论，可解释蛋自质雾瑟电子转移特性的过程。 两氧化还原电对之间电子传递的动力学特性由以下因素决定：推动力( 如电势的 差异) ，重组能( 定性反映氧化还原物质的结构) 和氧化还原中心阅的距离。蛋白 质的电子传递常数k 与相关参数存在如式( 1 1 ) 关系网： k = 1 0 1 3 p 一芦( d - 3 ) e 一( 彬2 4 r t , a ,( 1 1 ) 式中，鬈：电子传递速率；：对于给定的氧化还原体系为常数；露：电子供 体与受体之间的距离，即电子隧道距离；a g ：驱动能；a ：m a r c u s 重组能。 理论计算和实践涯明，d 的最大允许值约为1 7 a ，大予此值，电子传递速率 慢至无法观察。对于大多数殛白质而言，由予电化学活性中心深埋于非导电性 的肽链结构中，电子隧道距离相当大，因而电子转移速率常数非常小，在通常 条件下，难以观察到鬣白质与电极之间的直接电子转移。 其次，氧化还原蛋白质结构复杂且具有各向异性，它们的活性中心并不正 好馕于蛋白的中心，此外蛋白质分子表面还呈现电荷分布不均匀性。在生物体 系中，一些氧化还原蛋白质之间具有较大的电子传递速度，这归功于围绕电子 传递活性中心的氨基酸残基的作用，这些氨基酸残基能够调节虽叁瘊的相对位 置，使蛋白质的氧化还原中心之间的距离尽可能地缩短，从而提高电子传递速 率。 同时，蛋白质在电极表面易被吸附，可能造成构象变化或活性丧失，因而 蛋白质在电极上的电子传递能力通常是受抑制的。要实现一些缺乏“天然的 长程电子通道的蛋自质的直接电化学氧化还原反应，需要采取一些特定方法戬 达到如下的因的：使蛋白质的活性中心尽可能接近电极表面；蛋白质分予 第1 辩绪论 适当变形但并未失活；电极表面与蛋白质分子充分接触；通过修饰打开电 子转移通道。 因此，蟹白质在电极表面的取向是实现蛋白质电极电子转移的重要因素。 蛋白质的电化学研究常常不得不借助于某些具有电化学活性的媒介体和其他辅 助手段来实现蛋自质与电极之间间接的电纯学反应。采用适当的方法在电极表 面固定蛋白质，是目前蛋白质电化学研究的热点。蛋白质在电极表面具有良好 的取囱是实现蛋自质电极之间直接电子转移的前提。除了对电极进行表西修饰， 使蛋白质处于适宜的取向外，另一重要途径是采用化学方法或生物学技术对蛋 自质分子进行人工改造、设计和构造有利于电予传递的新的蛋鑫质体系。 1 2 1 蛋白质在裸电极上的电化学 蛋自质在金属电极上的电化学反应通常是不可逆的，但当金属电极经一系 列预处理后，可得到准可逆甚至可逆的电子转移动力学，如细胞色素c 在处理过 的金和铂电极上发生可逆或准霹逆电子传递【强，在经抛光和电化学粗糙化银电极 上也发生直接电子传递【8 j 。实验表明：蛋白质和金属电极之间能甭进行电子转移 和蛋皇质与电极间的化学微环境及结构有关，丽电极表鹾的清洁度壹接影响电 极表面疏水亲水特性。如金对有机污染物具有强烈的亲合力，趋向于使表面疏 水，清洁的电极表面则显亲水性。电极表面可形成有序的水分子内单层和稍无 序的第二单层，水合的电解质离子浓缩在水分子内单层附近以平衡电极表面电 荷，细胞色素c 的赖氨酸残基与位于内单层吸附的分子间存在着氢键，从而形成 了电子传递的通道。氧化还原蛋自质能在金属氧化物如掺氟氧化锡、氧化钉、 氧化铱、掺锡氧化铟等电极上发生电化学反应。这是蛋白质与电极界面静电吸 附扶焉实现毫子转移的结果。实验结采表臻：溶液的离子强度和p h 对蛋自质电 子转移影响很大，因为金属氧化物电极表面的羟基具有两性： m o h + h + 一m o h 2 + 带惩电荷( p h 较低_ ) m o h 叫m o 一+ h + 带负电荷( p h 较高) 调节溶液的离子强度和p h ，改变电极的静电特性，使蛋白质的氧化还原活 性中心更接近电极表面，依靠静电吸附作用，蛋自质能与电极闻进行快速的电 子转移。所以选择合适条件，无论带正电荷的细胞色素c 还是带负电荷的铜蓝蛋 东北电力人学硕上学位论文 量罾舅燃笪皇曼量曼置黑麓皇皇皇邕i i ,h 篡曼曼曼量量黑黑鲁曼量曼曼曼嬲黛皇曼曼曼量 白、红素氧化蛋白、质体蓝素等在氧化物电极表面有较快的电子传递速率例。 经不同氧化步骤预处理的碳电极表面存在一系列c o 功能縻，如羧基、羰 基、酚基和类脂基团等，为氧化还原蛋白质进行直接电化学反应提供良好微环 境，与氧化物电极相似，电极表面的静电特性以及某些功能团的质子化或去质 子化影响蛋囱质的静电吸附，从而影响电子转移的速率瓣硼。h i l l 等描绘了蛋白质 与棱面裂解石墨电极表面相互作用的示意图【1 1 l ，并提出蛋白质与电极间的相互 作用模式。 1 2 2 蛋白质在媒介体修饰电极上的电化学 媒介体在所研究的电位范围内是具有电活性的。通过加到溶液中或修饰在 电极表面，在生物大分子与电极之间起电子传递桥梁作用，也就是催化生物大 分子氧化还原的催化体。1 9 7 1 年，k u w a n a 开创性地在染料修饰石墨电极中得到 血红蛋白的催化反应l l 引，为研究氧化还原蛋白质的电子转移提供了有效的研究 途径。在此基础上科学家做了大量工侔，发现了一批熊加速蛋盘质与电极之阂 的电子转移的媒介体，而且大多数是有机染料。 就能加速蛋自质电子转移染料修馋电极来说，有以下特点： 1 光谱电化学方法的应用大多数氧化还原蛋白质都具有灵敏的光谱吸收 信号，在染料修饰电极上，通过对染料分子、蛋自质分子特征光谱的同时监测， 可更深入地揭示染料分子对蛋白质的作用机制及蛋白质氧化还原反应机理，而 且光谱电纯学方法不受光电电流和残余电流的影响，霹方便缝进行蛋自质氧化 还原反应的热力学和动力学研究。 2 染料修饰电极应用的广泛性醛习多种染料分子修饰电极能促进蛋白质 分子的氧化还原如亚甲蓝、亚甲绿、甲苯胺蓝、灿烂甲酚炼、亮甲基蓝、天青a 、 健那绿、甲基紫精、甲酚固紫等；罔种染料修饰电极可加速多种蛋自康分子 的氧化还原，如亚甲蓝修饰电极对肌红蛋白、血红蛋白、细胞色素c 3 种蛋白质 麴氧化鞠还原过程均具有加速 乍用；基于染料修饰电极对蛋囱质中血红素基 团还原及蛋白质中所含氨基酸残基氧化的催化作用。染料修饰电极作为流动注 第l 带绪论 墨i i i i i i i l li i i 曼量量 射分析( f i a ) 和液相色谱( l c ) 的电化学检测器，应用于氧化还原蛋白质的检测， 克服了蛋自质分子在电极上具有不可逆的电化学反应，电位大的缺点，而且检 出限较低。 3 导电聚合物包堙染料麓更快地促进蛋白质氧化还原反应湖血红蛋白在 亚甲绿、聚吡咯修饰电极上的式量异相电子转移速率常分别为1 7 5 1 0 。5 c r r d s 和 l l 。8 1 0 d o c r r d s ，在聚毗咯亚甲绿修饰电极上为8 7 6 l o c m s ，而且克服实验过程 中部分染料分子会从电极表面脱落，从而导致电极活性降低的缺点，具有较高 的稳定性。 1 2 3 蛋白质在促进剂修饰电极上的电化学 促进剂可以用来修饰电极表面或对电极进行处理，也可加入到溶液中，以 加快氧化还原蛋白和酶与电极之间的电子转移。它在所研究的电位范围内本身 是毒# 电活性的。1 9 8 7 年，h i l l 等发现4 ，4 联毗啶麓促进细胞色素c 在金电极上的 电子转移l l 引，此后还发现了一大批对细胞色素c 在金电极上电化学反应具有促进 作用的修饰刹，并提擞促进荆必须具有x - y 结构且含有双功能团的模型【1 6 1 。 这罩x 是能吸咐于金属电极表面的表面活性功能团，y 是阴离子或碱性基 团，它与细胞色素c 分子分布于一侧，与血红素裂隙附近质子化的赖氨酸残基发 生键合作用，形成了离子键、盐桥或氯键，而这种键合被认为是进行电子转移 的先决条件。近来研究表明【1 7 j ，只具有单一功能团的有机小分子如吡啶、噻吩、 睬唑等对蛋白质的氧化还原有较强的促进馋用。此外，入们还发现生物大分子、 无机物、聚合物以及生物小分子如氨基酸、糖分子等对氧化还原蛋白质的电化 学反应也有促进作用。这些结果突破了h i l l 等提出的模型。这说明促进剂分子 的结构不是产生电催化的唯一因素，还要考虑促进剂分子在电极表面吸附能力 的强弱，以及促进剂分子与生物大分子之间的相互作用方式。关于促进剂分子 的结构及其在电极表面吸附能力强弱与电子转移的关系有待进步研究。 1 。2 4 蛋白质在纳米粒子修饰电极上的电化学 纳米粒予具有比表面积大、催化活性高、亲和力强的特点，用于固定生物组 东北电力大学顾十学位论文 分备受关注。用纳米憎水a u 颗粒、亲水a u 颗粒、憎水s i 0 2 颗粒以及a u 和s i 0 2 颗粒混合与聚乙烯醇缩丁醛( p v b ) 构成复合固定酶膜基瘊，用溶胶凝胶法固定 g o d 制备纳米增强型葡萄糖传感器。实验表明，纳米颗粒可以大幅度提高固定 化酶的催化活性，认为是通过a u 颗粒的作用，葡萄糖氧化酶的辅基f a d 与铂 电撤问直接进行电子传递玎磁。将纳米金自组装至三维硅凝胶中，可实现h r p 的 直接电化学反应，构筑第三代电化学生物传感器【1 引。纳米t i 0 2 膜电极不仅具有 生物亲和性和相容性，而且能加快氧化还原蛋自质的电子传递速度疆川。利溺 h b t i 0 2 电极的光电特性，可研究蛋白质光氧化还原现蒙，检测水溶液中微量的 一氧化碳。在磁性纳米粒子表面修饰媒介体，可作为酶与电极之闻电子传递的 开关，制备嘲磁场控制的生物电化学传感器【2 。碳纳米管对c y tc 的电予传递也 有加速作用【2 烈。随藿纳米粒子与蛋白质作用机理研究的深入，各种新型纳米粒 子的制备，特别是量子点的引入及制备微型传感器和芯片实验室技术的发展， 可望从分子水平动态研究生物体系，揭示其内在规律。 1 2 5 蛋白质在d n a 修饰电极上的电化学 d n a 和氧化还原蛋自质同存在于线粒体内，研究氧化还原蛋自质与d n a 的作用，对理解生物呼吸链能量转换具有重要的意义。d n a 在会电极和碳电极 表面能形成稳定的薄膜，可用于基因杂交指示剂的选择和d n a 损伤检测【2 3 1 。 r u s l i n g 等采用逐层组装的方法，将d n a m b 和d n a c y tp 4 5 0 固定在电极表面， 得到f e ( i i i ) f e ( i i ) 电对的可逆电化学反应，应用于环境污染物的检测与转化【2 4 】。 用d n a 运定h r p 予石墨电极表面，加快了h r p 与电极的直接电子传递速度， 用于h 2 0 2 的检测【2 5 1 。表面活性剂膜、双层类脂膜和d n a 膜具有独特的类生物 结构和生物相容性，为电化学模拟氧化还原蛋皇质的生物功能创造了条件。寻 找适当的载体和基体电极以形成稳定的蛋白质膜层应该是今后努力的方向。 。2 。6 蛋白质在仿生界谣修饰电极上的电亿学 生物膜主要由蛋白质和磷脂组成。磷脂分子结构的两性特征决定了它们在 生物膜中的双分子层排列及其与各种蛋自质相结合的特性。表西活性剂具有类 磷脂两性结构，它们在电极表面能形成稳定的膜，并能促进氧化还原蛋白质与 第l 镦绪论 电极之间的电子传递【2 们。制备蛋白质表面活性剂修饰电极有两种方法；在电 极表葱蘸涂含表蔼活性剂的氯仿溶液，氯仿挥发后，形成表面活性剂膜电极， 该电极可从溶液中吸附蛋白质；将蛋白质与表面活性剂的微囊分散混合，取 混合液蘸涂至电极表面，空气干燥。基体电极以棱面裂解石墨、金、铂电极为 佳，而膜在掺锡氧化铟和银电极上的稳定性较差。在表面活性荆膜中，蛋自质 保持着原始构象不变，与电极之间的电子传递速度大大加快。肌红蛋白( m b ) 【2 7 1 、 盘红蛋自( 硒) 江秘、细胞色素p 4 5 0 ( c y tp 4 5 0 ) 1 2 9 、辣根过氧亿物酶( 壬差r p ) 刚、细胞 色素c 氧化酶【3 i j 等含有血红素的蛋白质，都可实现f e ( i i i ) f e ( i i ) 电对与电极之间 直接、可逆、快速的电子传递过程。在表面活性剂膜中，蛋自质表现出较强的 催化活性【3 羽。表面活性剂的结构和所带净电荷对蛋白质在电极表面的取向有一 定影响p 引。双层类脂膜在结构上与天然生物膜相似，能将生物分子嵌入其中同 时保持其生物活性。利用各种固相载体支撑的自组装双层类脂膜或混合层类脂 膜的高度有序且稳定性良好的特点【3 训，作为仿生膜，可以模拟氧化还原蛋白质 生物代谢过程的特性。 1 。3 分子自组装技术 随着生命科学、材料科学和纳米科学的发展，在化学修饰电极逐渐发展的 基础上，出现了分子有序自组装化学。分子自组装化学，尤其是分子有序单层 及多层组装膜越来越引起科技界广泛关注。通过对自组分子的设计，可以达到 人为控制表面组成、结构及其功能的豳的【3 】。 分子自组装是分子与分子在一定条件下依赖非共价键分子闻作用力( 氢键、 范德华力、静电力、疏水作用力、兀一丌堆积作用、阳离子一7 c 吸附作用等) 自发连 接成结构稳定的分子聚集体的过程。其原理是利用分子与分子或分子中某一片 段与另一片段之间的分子识别，相互通过非共价作用形成具有特定排列顺序的 分子聚合体 3 5 】。分子自组装是各种复杂生物结构形成的基础，最初出现在仿生 物过程的化学体系中。 分子自组有序膜( s a m s ) 是分子自发地强化学吸附在固液或气固界两，是 有机分子的头基与基底之间通过自发的化学反应形成化学键，并在基底形成高 度致密，二维有序排列的有机超薄膜，热力学稳定和能量较低的有序体系【3 6 1 。 东北电力人学硕上学位论文 1 3 1分子自组装有序膜 1 3 1 1 分予自组装单层膜 自组装单分子膜是固体表面在稀溶液中吸附活性物质形成的有序分子组 织。自组装单分子膜的形成是基于长链有机分子的头基与基底之间强烈的化学 键合作用、囱组分予之间的范德华相互作用以及分子链内或末端特殊功能团之 间的相互作用。 自组装单分子膜从结构上分为三部分：一是分子的头基，它与基底表面的 反应点数共价键或离子健结合，这是一个放热反应，活性分子会尽可能的占据 基底表面的反映点；二是分子的烷基链，链与链之间靠范德华力作用使活性分 子在固体表露有序且紧密排列，分子链闻可通过分子设计引入特殊的集团使自 组装单分子膜具有特殊的物理化学性质；三是分子末端基团，通过选择末端基 团以获得不网物理化学性能的界面或借助其反应活性构筑多层膜。 自组装膜提供了一个条件温和的类似生物膜的微环境，保证了蛋自质分子 的优势取向，有效的促进了蛋白质在模拟膜上的电子转移过程的发生，从而得 到了细胞色素e ，肌红蛋自，趣红蛋自的直接电化学。在金电极上固定的自组装 单层膜，还能进一步促进细胞色素c ，肌红蛋白，血红蛋白的还原。 1 3 1 2 有序多层膜 自从1 9 6 6 年i l e r 等首次提出关于带相反电荷胶体微粒的层层自组装方法 后，推动了有杭超薄膜的发展。与自组装单层膜相比，由层层岛组装法制备的 多层膜，其每一层的组装可以巧妙地控制和操作，可在分子水平上设计和制备 各种器件，具有潜在的优势【3 】。 按组装机制不同有序多层膜分为静电作用、氢键作用、亲合反应、配位反 应和共价作用五种类型，其中基于静电相互作用的多层膜最首关注。基于静电 相互作用的多层膜有如下的优点：一是从二维猁三维组装，可控制多层膜的结 构和厚度；二是成膜材料便宜，实验容易进行；三是对于基底的要求没有限制； 图是沉积的过程比较简单。 由于多层膜组装体系的诸多优点，被认为是构筑复合有机无机超薄膜的有 第1 镦绪论 效方法。其中蛋白质也可于聚合物形成多层膜。这类多层膜的主要特点是膜的 生物相容性好，位于多层膜中的蛋白矮不会变性，为蛋白质提供了温和的生存 空间，含有生物分子的聚电解质多层膜对生物传感器制备具有重要的意义。 。3 。 。3 纳米有序膜 纳米粒子一般是尺寸在l - - l o o n m 之间的微粒。由于小的体积和大的比表面 积，纳米粒子具有独特的光、电和异相催化特性，并成为表面纳米工程和功能 化纳米结构的理想研究对象。 纳米粒子单层膜的制备比较简单，一般是通过电极表面或是纳米粒子表面 的修饰来实现。如觚纳米粒子在带有氨基或另一巯基的硫醇修饰金电极表面组 装的单层膜、t i 晚纳米粒子在羧酸衍生物修饰金电极表面组装的单层膜【3 7 】等。 金属纳米粒子由于其小的尺寸和大的毙表面积，在电催化反应孛起重要的 作用，其催化效率主要与微粒和反应剂间的相互作用，以及微粒的比表面积有 关。纳米粒子和蛋自质的结合组装使酶酶活性中心更接近电极表面，使电子转 移易于进行。 。3 2 自组装膜的表征 自组装膜具有有序、密集和稳定等特点，但是在制备过程中会受到许多因 素影响，因此常需进行表征，焉微观表征手段的不断进步又直接推动鸯组装技 术的发展和完善。目前大部分的研究多集中在金表面，以硫醇类s a m 体系为代 表，可以分为物理方法和化学方法两大类。常用的物理表征方法有润湿接触角、 椭圆光度法、表面等离子体共振法( s p r ) 、红外光谱( i r ) 、石英晶体微天平( q c m ) 、 表顽增强拉曼光谱( s e r s ) 、x 。射线吸收光谱、x 射线光电子能谱( x p s ) 、俄歇电 子光谱( a e s ) 、程序控制解吸( t p d ) 、扫描电子显微镜( s e m ) 、表面解离质谱 ( s i m s ) 、激光解析质谱( l d m s ) 、扫描隧道显微镜( s t m ) 、原子力显微镜( a f m ) 、 荧光光谱及压电方法等方法，用以表征物质的存在形式、分子结构及健合方式 用于研究单个分子的行为成为了可能。 化学法中主要是电化学的循环伏安( c v ) 法翻交流阻抗o 三i s ) 法和电化学扫描 显微镜( s e c m ) 等。电化学方法是研究融组装膜缺陷的最有利工具。根据自组装 东北电力入学硕上学位论文 膜修饰电极表面发生电化学反应的电流、电位和电量等参数间的关系可以获得 自组膜界恧结构和性质的直接信息，如针孔缺陷分布、吸附组分的氧化还原性 质、动力学和单分子膜形成机理等。阻抗技术通过测量界面电容和单分子膜电 阻可以了解界面电子转移过程。 电化学方法研究自组膜的另一优点是可现场给出翻组膜缺陷大小及形态分 布的直接证据，这对研究金属防腐、宪善和发展电子转移理论具有重要意义。 1 3 3 分子自组装膜在毫分析化学中的应用 在过去2 0 年中，分子自组装膜在电分析化学领域显示出巨大的优势，通过 对膜的预先设计和修饰，能获得特殊的性质和功能。目前研究工作主要集中在 膜表面的电予传输、电催化、分子识别、离子选择电极和生物传感器等方面的 应用。人们对于菲电活性及电活性体系的自组装单分子膜的结构和性质已有了 较为详细的研究与认识，并积极探索复杂的研究和应用。 1 选择性检测近年来，应用自组装技术对金属离子、有机或生物分子进 行选择性测定引起了人们的广泛的兴趣。由于是组装技术有很高的稳定性，已 成功地应用于生物传感器的研制。引入特定集团或化合物的自组装膜修饰电极 对盒属离子= 特定的有机或生物分子具有选择性的响应，可制成离子选择性电极 或特定有机物的选择性电极。自组装膜的选择性主要来自两个方面。首先，当 自组装膜不完全致密时，其选择性主要归因子疏水分子对自组装膜内烷基链的 亲和性。此特性被用于液相色谱的电化学分离检测中性及粒子型物质 3 8 - 3 9 l 。其 次，主要是来自于静电作用，即在自组装膜的末端离子上，对相反电荷的被测 物种电化学信号的增强，而对相同点和的被测物种被大大的抑制i 4 0 1 。例如， m a n d l e r 【4 q 利用巯基羧酸s a m 修饰的电极对溶液中的多巴胺进行了选择测定，在 大量抗坏血酸阴离子存在下，对多巴胺的检测不干扰。 2 电催化催化是自组装体系的基本性质之一，研究自组装膜修饰电极在 电催化方面的应用具有重要的意义。自组装在电催化种主要起两种作用，首先 自组装膜本身带有的功能集团对电化学反应有序化作用，o h s a k a l 4 2 t j 、组研究了 第1 审绪论 胱胺对抗坏衄酸的电催化作用。其次，自组装膜可以为电催化剂或酶的固定提 供了种灵活的方法，董绍俊 4 3 | d x 组合成并研究了含紫耪基团硫醇s a m 的电化 学行为和辣根过氧化物酶的生物电催化。 此外，自组装在检测物的预富集和选择性健、生物大分子的电化学和生物 传感器等方面有很广泛地应用。 。4 微透镜阵列 微透镜阵列是指一系列直径在1 0 9 m 到1 0 0 9 m 之间的微型透镜按一定的方 式瓣列丽成酶阵列。微透镜阵列表面爨有特定的微孔结构，因此这种材料具有 特殊的光学性质、疏水性质等。自从9 0 年代以来，人们研究了很多动植物，如 蝴蝶的翅膀、豆娘( 蜻蜒的一种) 的翅膀、鲨鱼皮、搿叶表面的疏水结构、蛋 壳膜等。蝴蝶和蜻蜒的翅膀因其表面的微结构在阳光下呈现缤纷的色彩；鲨鱼 皮肤上的细小纹理减小了前进的阻力：荷叶表面的粗糙结构使其疏水，自清洁 等等，自然界中的许多生物都为我们制备微透镜有序材料提供了模板。 1 。4 1 微透镜有序阵列的特性 1 光子学特性z h o n gl i nw 抽g 脚】等人以a 1 2 0 3 为原料，利用原子层沉积 法复制了大闲蝶翅膀。经研究表明，得到的复制品不仪完整的保留了模板的形 态，还保留了模板的光学特性。在原来的翅膀和复制品上发现了紫色蓝色范围 的反射峰；而因为周期性和折射率的变化，氧化铝薄层反射峰产生红移。其 原函是一定波长的光能够在凹稽中传播，而与纳米正方形母体的光子带隙相应 波长的光会被困在中空的主肋中，这就实现了二维的光子学晶体波导排列。氧 化铝复制品也显示了相似酌作为波导和光散射的实用的结构。y u y i t 4 5 】等人以蛋 壳膜为模板，合成了b a c r 0 4 阵列。当激励波长是3 1 0 n m 时，体相材料的发射波 长为4 4 0 n m ，树枝状产物为4 3 5 n m ，羽毛状产物力4 2 5 n m 。产物的紫外可见光 谱也不同于体相材料。体相材料的吸收波长为4 2 6 n m ，而树枝状和羽毛状产物 的分别为3 8 1 n m 和3 7 4 n m ，与体相材料相比较分别“蓝移”4 5 n m 和5 2 n m 。这 可能是通过量子尺寸效应和构成树枝状和象羽毛状产物的纳米离子的带隙变化 形成的。而且，紫外可见的吸收范围的形状与纳米离子的颗粒分布一致，这表 东北电力人学硕上学位论文 明纳米离子的尺寸是比较均一的。 2 疏水特性a l e x a n d e ro t t e n 4 6 1 等人对一些植物叶子的抗水性的物理依据 进行了研究，证明了某些植物叶子的抗水性可由表面粗糙度和覆盖在表面的弹 性结构( 毛发) 解释，对于多毛的植物叶子，毛发的弹性系数和覆盖面积是一 个重要的附加参数。 1 。4 2 微透镜有序阵列的制备 目前，制备二维有序阵列的方法主要有传统的石板印刷术法和自组装方法 等。 照相平版法照相平舨法向下涂料技术，它能量消耗大，并且需要复杂 的仪器。 2 壹组装法岛组装膜是分子在溶液( 或气态) 中自发通过化学键牢固地 吸附在固体基底上而形成的，体系主要包括有机硅烷羟基化表面( s i 0 2 s i 、 a 1 2 0 3 a i 、玻璃等) ；硫醇a u 、a g 、c u ；醇和胺p t ；羧酸a 1 2 0 3 、a g 等。皇组 膜中分子成键有序排列、缺陷最少、呈“结晶态 ，易于近代物理和化学的表征 技术研究以便调控膜结构和性质的关系，是研究有关表面和界嚣各种复杂现象 诸如腐蚀、摩擦、湿润、磨损、粘接、生物发酵和表面电荷分布、电子转移理 论的理想模型体系，同时对膜的实际应用具有重要理论指导意义。 水协助法洚7 】( w a t e r - a s s i s t e df o r m a t i o n ) 是新近发展起来的舀组装法的一种 新形式，它是利用微小水珠在聚合物表面冷凝从而制得有序的微孔蜂窝状结构。 它在微阵列制备方面有如下优点： 这种方法不需要任何昂贵的机械设备和材料，是个低花费、低能耗的 制备过程： 样板特征的尺寸易于控制。通过改变制备过程中的用水量，可将微孔尺 寸控制在2 0 0 n m l o o 蹦之闻； 这种方法适用于大量的亲油增水性聚合物； 这种方法适用于大规模的微阵列制备。 第l 章绪论 ：, , i ii,i i i i i i i i i 皇曼皇量量鼍 1 5 本课题的研究内容 本课题主要用电化学手段研究蛋囱质的氧化还原过程，由于分子结构庞大， 电活性中心不易暴露以及在电极表面的吸附变性，通常情况下蛋白质在般固 体电极上的电子传递速度缀慢。为实现蛋自质一电极之间的直接电子传递，本课 题主要研究以下几个方面： ( 1 ) 构建聚丁二烯微透镜阵列分子自组装复合体系，并研究细胞色素c 在该 体系修饰玻碳电极上的直接电子传递。 ( 2 ) 构建聚丁二烯微透镜阵列金纳米粒子复合体系，并研究细胞色素e 在 该体系修饰玻碳电极的直接电子传递。 ( 3 ) 研究上述两种修饰电极对过氧化氢的电催化作用，初步探讨构筑以上述 两种电极兔基础的生物传感器的可行性。 东北电力人学硕上学位论文 第2 章聚丁二烯微透镜阵n 细胞色素g 复合体系 电化学性质研究 2 。1引言 细胞色素c 在细胞呼吸链中具有重要的作用，它几乎存在于从细菌、酵母、 昆虫、无脊椎动物、脊椎动物到哺乳动物所有的原核生物和真核生物体中。细 胞色素c 分子大小为3 0 0 n m 3 0 0 n m x3 0 0 n m ，由一个血红素和一条肽链结合而 成。血红素是细胞色素c 的核心单元，也是蛋白分子发生氧化还原反应的活动 场所。在盎红素结构中，由予铁与卧啉环的配位结合，使得从任何方向进入珏 啉环流出的电子最终都体现在铁离予的氧化还原上。血红素与多肽链的结合也 是遴过铁上的配位键实现豹。血红素为一两亲分子，卟啉平面为疏水端，它的 第三、第四吡咯环上的丙酸集团为亲水端。在细胞色素c 分子中，亲水性的丙 酸基团深陷于肽链的疏水袋内，留下二、三吡咯环的共享边暴露予分子的表西。 细胞色素c 中血红素结构的排布与其特定的电子传递功能有密切的关系。可能 体现在：该结构有利于缩短分子之间电子传递的通道；该结构有利于实现 细胞色素e 分子在细胞色素氧化酶与还原酶之间的结合；血级素中的丙酸基 团的封闭可以阻止因生理环境的改变而引起丙酸的电离，进而导致细胞色素氧 化还原电位的改变。细胞色素c 分子除了结构上的两亲特性终，还有电荷分布 的上的特点。由于细胞色素c 分子的外表面分布着许多带电的氨基酸残基，使 褥箕在中性州条件下带有9 个净正电荷，且分子表面电荷的分布是不均匀的。 靠近血红素裂隙的一侧有一系列赖氨酸残基，带正电荷，而远离血红素裂隙的 一侧带负电荷。细胞色素c 分子的电荷分布特性也将会因外加电场的性质不同 而引起蛋自质分子氧化还原电位的改变。这种表面电荷的不均匀分布对细胞色 素c 分子与电极表面或其他分子的电子传递具有重要的影响。 本文首次利用聚丁二烯微透镜阵列塑性强、易于制造、易于耦合、孔隙规 则有序等特点1 4 8 1 ，研究了细胞色素c 一聚丁二烯微透镜阵列修饰玻碳电极的电化 第2 章聚丁二烯微透镜阵列细胞色素c 复合体系电化学性质研究 学性质。 2 2 试验部分 2 2 1试剂 细胞色素c ( c y t o c h r o m ec ，c y tc ) 购于s i g m a 公司，未经进一步提纯直接使 用；聚丁二烯( p o l yb u t a d i e n e ，p b ) 购于a c r o s 公司，乙醇、丙酮、磷酸二氢钠 及磷酸氢二钟等均为分析纯。实验用水u l t r a p u r ew a t e rs y s t e m ( 北京历元电子 仪器公司) 制得。 2 2 2 仪器 电化学测试采用传统的三电极系统，玻碳修饰电极为工作电极( 巾= 3m m ) ， 铂丝为对电极，a g a g c l ( 饱和k c l ) 为参比电极，c h l 6 6 0 b 电化学分析仪( 上海 辰华仪器公司) ；x s 一2 1 2 型电子显微镜( 南京江南光电股份有限公司) ；c a r y1 0 0 型紫外一可见吸收光谱仪( v a r i a n 公司) 。电化学测量前电解液通高纯氮气除氧 不少于2 0m i n ，所有试验在室温下进行。 2 2 2 修饰电极的制备 玻碳电极的处理：先用水将电极表面清洗干净，依次用粒径为1 o 、o 3 、 0 0 5 “m 的a 1 2 0 3 粉机械抛光，超纯水洗后超声处理5 m i n ，在2 m m o v l k 3 f e ( c n ) 6 】 + o 5 m o l l k c l 中扫描，直至得到稳定的标准循环伏安图。然后依次用超纯水和无 水乙醇清洗电极，高纯氮气吹干后使用。电极处理完后要立即使用，每次使用 前均需重新处理。 以聚二甲氧基硅氧烷( p d m s ) 为负向模板，采用模板法见文献 4 9 带1 j 备微 透镜阵列聚丁二烯聚合物膜，将上述聚丁二烯微透镜阵列聚合物膜裁成合适大 小后用熔融态石蜡固定在处理好的玻碳电极表面，即得聚丁二烯微透镜阵列膜 修饰玻碳电极( p b g c ) ，将此电极浸于c y tc 溶液中1 2h ，取出后用高纯水冲 洗掉弱吸附的c y tc ，得至u c y tc 聚丁二烯微透镜阵列修饰玻碳电极( c y tc p b g c ) 。 东北电力大学硕士学位论文 2 3 结果与讨论 2 3 1 聚丁二烯微透镜阵列聚合膜的表征 用电子显微镜表征聚丁二烯微透镜阵列聚合物膜的表面形貌( 见图2 1 ) 。由 图2 1 可知聚丁二烯微透镜阵列聚合物膜由表面规则的正六边形有序排列而成， 其中相邻正六边形的中心间距大约在1 0 1 x m 左右。循环伏安实验结果表明：聚丁 二烯微透镜阵列这一有序均匀、致密的修饰膜为电极表面的自组装、c y tc 固定 及电子传递提供了良好的媒界。 图2 - 1p b 微透镜阵列表面形貌 2 3 2 c y tc p b g c 电极的循环伏安行为 图2 2 是p b