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1 淡水鱼肌肉亮氨酸氨肽酶的分离纯化与性质研究 摘 要 亮氨酸氨肽酶（leucine aminopeptidase，lap）是一类从肽链氮端对亮氨酸残基有最高 切割效率的氨肽酶的总称，对于鱼类及其加工品的风味和营养物质的形成有重要作用。但 目前国内外还没有关于鱼类肌肉中亮氨酸氨肽酶的报道。本文首次以鲤鱼、草鱼、鲢鱼三 种典型的淡水鱼为原料，对其肌肉亮氨酸氨肽酶进行分离纯化，并研究了它们的酶学性质， 为 lap 在鱼类肌肉中的生理学功能研究提供理论依据。 本文采用硫酸铵分级盐析、deae- sephacel离子交换层析、sephacryl s- 200 凝胶过滤 层析、羟基磷灰石层析、phenyl sepharose 6- fast flow疏水层析和 econo- pac macro- prep high q 离子交换层析等方法，从鲤鱼、草鱼、鲢鱼肌肉中分离纯化得到 lap，分别命名 为 cmlap（鲤鱼） ，gmlap（草鱼）和 smlap（鲢鱼） 。 sds- page 和凝胶过滤结果表明，纯化的 cmlap、gmlap 和 smlap 都是单体结构， 分子量约为 105 kda。三者的最适反应温度为 35- 40，热稳定性较差，最适 ph 为 7.0- 7.5。 金属螯合剂 edta, egta 和 1,10- phenanthroline 能有效抑制其活性，而其它抑制剂没有明 显抑制作用，说明三者都是金属蛋白酶。bestatin，一种选择性抑制氨肽酶的蛋白酶抑制剂 对三者有强烈抑制作用。金属离子对三种 lap 作用存在细微的差别，但总体看来，mg2+ 和 mn2+有轻微的激活作用，co2+, cu2+, zn2+对酶都有不同程度的抑制作用。另外，巯基试 剂对于保持酶活性是必不可少的。除了 leu- mca，酶对其它很多种氨基酸残基也有一定 分解作用，而对内肽酶对应的荧光底物和大分子量天然蛋白如肌原纤维蛋白和牛血清白蛋 白没有分解作用。以 leu- mca为底物，cmlap 的 km 和 vmax 分别为 4.6 mol/l 和 9.62 mol min- 1 mg- 1。以上结果表明，lap 在所研究的淡水鱼肌肉中是普遍存在的，它们在生 物化学性质方面具有较高的相似性。 关键词：亮氨酸氨肽酶，鲤鱼，草鱼，鲢鱼，纯化 2 purification and characterization of leucine aminopeptidases from the skeletal muscle of freshwater fish abstract leucine aminopeptidases (laps), a class of cellular exoproteases preferably catalyze the hydrolysis of leucine residue from the amino- termini of proteins or peptides， play important roles physiologically and in the formation of flavor. however, till now no report on lap from fish muscle has been documented. in the present study, laps from the skeletal muscle of three typical freshwater fishes, namely common carp, grass carp and silver carp, were purified to high homogeneity and their biochemical characteristics were investigated. the purification and characterization of laps in the present study represents a primary step in answering specific questions about the physiological function of such enzymes in vivo. using the same methods, three laps could be purified from common carp, grass carp and silver carp, and they were named cmlap, gmlap and smlap, respectively. the purification procedure consisted of ammonium sulfate fractionation and sequential chromatographic steps, including deae- sephacel, sephacryl s- 200, hydroxyapatite, phenyl- sepharose 6- fast flow, and econo- pac macro- prep high q column (only used for cmlap purification). the molecular masses of the three enzymes were all estimated to be approximately 105 kda by sds- page and gel filtration chromatography on sephacryl s- 200, and they were all monomers. the enzyme activities were optimal at 35- 40 and ph 7.0- 7.5 and of poor thermal stability. metal- chelating agents edta, egta and 1,10- phenanthroline specifically inhibited enzyme activities, while inhibitors to other proteinases did not show much effect， indicating they were metalloproteinases. furthermore, bestatin, a specific aminopeptidase inhibitor strongly inhibited their activities. divalent cation ions such as mn2+ and mg2+ enhanced the enzyme activities slightly, while co2+, cu2+ and zn2+ inhibited the activities to different extents. in addition, sulfhydryl reagent was necessary to maintain enzyme activities. all of the three enzymes preferentially hydrolyzed substrate leu- mca followed by other substrates, while they did not reveal any endoproteinase activity toward n- terminus blocked substrates and did not exhibit any proteolytic activity toward protein substrates such as myofibrillar proteins and bovine serum albumin. the apparent km and vmax values of cmlap were 4.6 mol/l and 9.62 mol min- 1 mg- 1, respectively for substrate leu- mca. in conclusion，laps are quite possibly ubiquitous in freshwater fish muscle and have similar biochemical functions and characteristics. keywords：leucine aminopeptidase，commom carp，grass carp，silver carp，purification 学术诚信声明 兹呈交的学位论文，是本人在导师指导下独立进行的研究工作及取 得的研究成果。除文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。本人依法享有和承担由此 论文产生的权利和责任。 声明人（签名） ： 时 间： 保护知识产权声明 本人完全了解集美大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校 有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意集美大学可以 用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 作 者（签名） ： 导 师（签名） ： 时 间： 淡水鱼肌肉亮氨酸氨肽酶的分离纯化与性质研究 1 第一章 绪论 氨肽酶是一类从蛋白质或肽链的氨端选择性切割氨基酸残基的外肽酶的总称, 是人们 较早发现的一类酶，在植物，动物和微生物界都有广泛的分布，对于维持细胞的正常生理 功能有重要作用1- 3。亮氨酸氨肽酶（leucine aminopeptidase，lap）是一类从肽链氮端对 亮氨酸残基有最高切割效率的氨肽酶的总称，lap 通常表现出较为广泛的底物特异性。由 于其底物和结构特异性以及分布的广泛性，lap 成为氨肽酶家族中最典型的代表4。 氨肽酶的切割特性决定了它的主要酶解产物为游离氨基酸和小肽1- 2。 由于游离氨基酸 和小肽是食品中重要的风味和营养物质，因而在食品加工业和保健品工业中受到广泛的关 注5- 7。 鱼类肌肉中氨肽酶的研究具有重要的意义。在水产品保鲜和加工工业中，由于鱼肌肉 组织结构和其酶活力的特点，鱼类肌肉的软化和腐败速度比哺乳动物更快，这给食品加工 带来了很大的困难8。因此，关于鱼类肌肉中相关酶类的研究一直是受到水产品保鲜和加 工工业的关注，例如引起鱼肌原纤维结构蛋白降解的组织蛋白酶8、钙蛋白酶9等酶类的 研究。相比之下，国际上对鱼类氨肽酶的研究很少，除了从阿拉斯加鳕鱼卵中纯化到的氨 肽酶10和从金枪鱼的幽门盲囊中得到的氨肽酶外11, 未见到其它研究报道。 1.1 氨肽酶的研究概况 有关氨肽酶组成和性质的研究报道很多1- 3，尤其是近三十年来，有关氨肽酶的研究不 断深入，内容涉及氨肽酶的晶体结构, 作用机理, 生物学功能和表达调控等诸多方面2。然 而，现有的研究主要以微生物，植物和哺乳动物为原料，却极少涉及鱼类尤其是淡水鱼类。 1.1.1 氨肽酶的分类与命名 氨肽酶种类繁多, 其命名也较为复杂, 一般按照以下性质分类。 1）根据从底物氨基端切割氨基酸数目的不同分类：aminopeptidase，从蛋白或肽链氨 基端切割单个氨基酸；aminodipeptidase，切割释放二肽；aminotriprptidase，切割释放出三 肽。它们的 ec 编号分别是 e.c.3.4.11- 3.4.1312。 2）根据氨肽酶对各种氨基酸残基切割效率不同分类：亮氨酸氨肽酶（lap）对氨基端 为亮氨酸残基最有效， 同样， 还有 arginine- ， methionyl- ， aspartyl- ， alanyl- ， glutamyl- ， prolyl- ， cystinyl- 氨肽酶1, 3。 3）根据其定位不同分类：有些氨肽酶分布在细胞质，微粒体，或与膜相结合，有些 则存在于溶酶体，细胞核或线粒体中。例如，膜结合型氨肽酶和 methionine 氨肽酶分享一 个命名- 氨肽酶 m1。 4）根据对抑制剂 bestatin 的敏感性不同分类1。 5） 根据其所含金属离子的不同分类. 氨肽酶主要结合 zn2+或 co2+, 另外还有一些特例, 集美大学硕士学位论文 2 如 mn2+1,3。 6）根据其最适 ph 不同分类：可分为酸性氨肽酶，中性氨肽酶，碱性氨肽酶3。 7）根据蛋白酶抑制作用可分为金属蛋白酶类氨肽酶，半胱氨酸氨肽酶和丝氨酸氨肽 酶。三分之二的氨肽酶都是金属蛋白酶。亮氨酸氨肽酶也是一种金属蛋白酶3。 氨肽酶的种类繁多，且各种分类方法是根据不同目的而划分的，它们之间相互交错， 这使得氨肽酶的分类更为复杂且仍处在不断变化中1, 4。 1.1.2 氨肽酶的分布 氨肽酶在自然界中分布很广泛，原核、真核微生物，植物，动物组织（肾脏，肝脏， 脑，小肠，胎盘，血液，肌肉）中都有氨肽酶的存在1, 3。 1.1.3 氨肽酶的功能 氨肽酶是酶系统中的一个大家族，主要在多肽分解的最后阶段发挥作用, 因为由各种 内切酶或蛋白酶体水解形成的肽链在经过氨肽酶分解后就成为蛋白质的最小组成单位 氨基酸, 从而实现蛋白质的转化和新陈代谢的平衡2, 4。因此，氨肽酶对于细胞的成熟, 生 长和防御都具有重要作用，维持着细胞的动态平衡1- 2。 首先，氨肽酶通过分解外源蛋白，为机体提供营养物质。在动物消化系统中，人们发 现了氨肽酶以高活力存在，这说明氨肽酶参与降解食物中的外源蛋白质，为肌体的新陈代 谢提供氨基酸有重要的意义11, 1 3。如乳酸乳球菌（lactococcus lactis）作为奶酪和酸奶生 产中重要的菌种, 对营养的需求非常苛刻, 而牛奶本身不能提供其所需的氨基酸，研究发 现，它自身的氨肽酶活力很高，能够以酪蛋白及其降解产物为底物进行分解，满足对氨基 酸的生长需求14。 其次，氨肽酶参与降解内源蛋白和肽链，对于蛋白的转化，特异性蛋白的识别，蛋白 的成熟等都有重要的意义。甲硫氨酸氨肽酶可以从新合成的肽链氮端切割甲硫氨酸，促使 蛋白成熟15- 16。 再次, 氨肽酶还有许多特殊的性质。 近年的研究表明, 在微生物和动物界, 除了从氮端 切割残基的作用外, 氨肽酶还作为转录调控因子, 特异性位点的重组因子, 毒素受体, 参 与抗生素的活化和转运。 除此之外, 还有很多功能有待更深入研究2- 4。大肠杆菌中氨肽 酶 a 对于稳定高拷贝的 cole1 质粒17，pyroglutamyl 氨肽酶对释放肽链氮端 pyroglutamyl 残基18，微生物 o.anthropi 中 d- 氨肽酶对于细胞壁肽聚糖的合成和降解等都有重要作用 19。在动物胎盘中，特别是在动物怀孕和哺乳期间，氨肽酶的含量和活性都会有很大提高， 从而调控激素的分泌等20。在脑细胞中，氨肽酶可降解神经肽，调节神经传递和激素分泌 21- 22。 在肌肉组织中，氨肽酶，羧肽酶与内切酶共同参与肌肉组织的分解代谢。肌肉组织包 括多种细胞内降解机制，主要包括有泛素- 蛋白酶体途径，溶酶体途径，钙激活蛋白酶途径 23。泛素- 蛋白酶体途径中，n 端带有碱性氨基酸（精氨酸、赖氨酸、组氨酸）或疏水氨基 淡水鱼肌肉亮氨酸氨肽酶的分离纯化与性质研究 3 酸（苯丙氨酸、亮氨酸、色氨酸、酪氨酸、异亮氨酸）残基的蛋白更易于被降解，蛋白的 这种特性被称为降解信号23。varshavsky报道蛋白 n 末端的特性与蛋白半衰期有相关性， 这就是所谓的 n- 末端法则24。按照 n- 末端法则，那些特征性的蛋白更容易共价结合到泛 素上（泛素化） ，所以能更快被 26s 蛋白酶体降解23- 24。因此，氨肽酶通过修饰肽链末端 残基而调节肌肉蛋白的水解率的理论已越来越受到关注25。 另外，在动物死亡后，肌肉组织会经过一个僵直、软化的过程，在此期间，首先由各 种内切酶，包括组织蛋白酶 b, l8，钙调蛋白9等对肌肉蛋白降解为肽链，随后，各种氨 肽酶对形成的肽链进行降解，释放出游离氨基酸，而使肌肉变嫩，风味改善5- 7。 1.1.4 氨肽酶的应用与前景 由于氨肽酶具有以上功能，在食品加工，酶工业，医学，营养学等方面都得到了广泛 的应用。在食品工业中, 氨肽酶被用在各种蛋白质食品和保健品的脱苦处理中，从而避免 了使用化学试剂所带来的安全隐患。例如利用乳酸菌的内外肽酶水解牛奶蛋白, 释放小肽 和游离氨基酸, 一方面获得了菌自身生长所需氨基酸, 另一方面可使牛奶制品水解物无苦 味26- 27。在肉类加工中, 氨肽酶可以增加游离氨基酸的量, 改善风味, 提高营养价值, 缩短 加工周期5- 7。酱油,酱料,鱼露等调味料生产中, 来源于原料和发酵微生物的氨肽酶对于调 味料风味和营养物质的形成有重要的作用28。 酶工业中, 利用微生物发酵生产氨肽酶是近年来酶制剂生产的热点，各种适合工业化 生产的菌种被分离出来并进行了筛选和优化3, 29- 31。这些氨肽酶可用作蛋白序列测定的工 具及重组蛋白或融合产物的固定剂。在医学研究中，氨肽酶的研究有助于许多疾病的治疗 和从分子水平研究许多生理现象3, 26,。 1.2 亮氨酸氨肽酶的研究概况 1.2.1 亮氨酸氨肽酶的分类与命名 lap 由 m1 和 m17 类蛋白酶家族成员组成，所以有关 lap 的命名较为复杂, 表 1- 1 列出了主要的 lap 的分类，同系物和命名4。 集美大学硕士学位论文 4 表 1- 1 亮氨酸氨肽酶：分类，同系物和别名6 table 1- 1 leucine aminopeptidases: classification, homologs and aliases 1.2.2 亮氨酸氨肽酶的结构 lap 大多属于 m17家族, 是由分子量为53- 55 kda的单体组成的六聚体,在结构上有一 定特殊性：它们不存在 m1 家族所含有的 hexxh 锌结合体 motif，一级结构高度保守32。 特别是其 c 端序列较 n 端更保守4, 番茄 lap 的 323- 571 氨基酸序列与其它植物(马铃薯、 淡水鱼肌肉亮氨酸氨肽酶的分离纯化与性质研究 5 大麦、小麦、 西芹)中的 lap 的序列相比, 同源性高达到 76- 92%, 与非植物来源(牛、人、 大肠杆菌) lap 的序列相比, 也有 41- 46%的同源性33。 m17家族中lap的每个亚基具有两个不同的金属结合位点, 它们都位于一个鞍状的 - 折叠结构的边缘, 其中一个金属结合位点隐藏较浅，更易接近，较容易被置换，另一个则 埋藏较深，不易被置换，但二者在结合底物和催化过程中都有作用4。另外, 哺乳动物中 还有一些 m1 类蛋白酶（胎盘 lap，嘌呤霉素迟钝性氨肽酶，膜结合丙氨酸氨肽酶）具有 lap 活性，它们的命名则是根据其功能，定位等各有不同4。 1.2.3 亮氨酸氨肽酶的功能 lap 在维持细胞新陈代谢中发挥重要作用。哺乳动物中，lap 参与主要组织相容性复 合体类抗原分子（major histocompatibility, mhc）的提呈, 当干扰素 ? 水平升高时， 氨肽酶（包括 lap） 、抗原肽运载体（transporters associated with antigen presentation, taps） 和 mhc 的水平会相应升高34。 lap 还参与生物活性肽(荷尔蒙, 后叶加压素, 脑啡肽)的 形成2, 4。最近研究发现，从大鼠肝脏和牛晶状体中提取的 lap 能有效切割 cys- gly 的肽 键而控制 cys- gly 含量，这一特性对细胞的生存和发育有重要意义35- 36。因为 cys- gly 是 谷胱甘肽（细胞内重要的抗氧化因子）合成的壁垒，在铁或铜离子存在时，cys- gly 自身 也能够产生氧活性因子，并且 cys- gly二硫化物能够使蛋白质巯化。新近的研究发现， lap 活性高低会影响眼睛的健康状况，晶状体球蛋白被钙蛋白酶和蛋白酶体降解后，形成的肽 链再进一步被其他内切和外切酶降解，lap 活性的降低和这些部分降解的蛋白肽链的过多 堆积有很大关联，这些过多的部分降解产物是导致白内障发生的原因37。 在微生物界, lap 保证氨基酸的正常循环，从而被认为是“管家”蛋白。另外，它可 以结合 dna, 调控转录的进行, 从而控制嘧啶, 藻酸盐, 霍乱毒素的生物合成4, 38。在植物 中, lap 在病害防御, 植物激素受体的跨膜转运, 减数分裂期间都有重要作用, 它们的其他 功能有待进一步阐明4, 39- 40。 1.2.4 亮氨酸氨肽酶的分布及其纯化 lap 是很早发现的一种氨肽酶，是氨肽酶中最有代表性的一种。1941- 1952 年, smith 等人在猪肠黏膜内中发现了 lap, 并对其进行了初步纯化41。 1950 年, snoke 等人在兔肌肉 中也发现了 lap 的存在42。在随后的五十和六十年代, 关于 lap 的研究进一步深入，在 各种组织如血液43，胎盘44，胸腺45等中都发现了其存在。其中，最为详细和系统是 spackman等人进行的关于lap的部分纯化和性质的研究， 1955年， 他们猪肾中提出了lap， 并对其性质进行了初步研究, 研究表明了mn2+和mg2+对于保持酶活力有重要作用, 并对酶 有激活作用。研究还探索了 lap 对激素等底物的分解作用 46。 随后, 人们陆续从其它动物的不同器官中纯化到了 lap 47- 49。其中最为系统和成熟的 是牛晶状体 lap 的研究。 从 lap 的分离提取, 生物化学性质到晶体结构, 抑制剂与其结合 模型都作了详细研究，为其它 lap 的研究提供了理论依据50- 55。 集美大学硕士学位论文 6 微生物中氨肽酶得到人们的关注是近几十年的事, 第一个关于微生物氨肽酶的研究是 大约 40 年前3。目前，大肠杆菌（e.coli）和气单孢菌属（aeromonas proteolytica）中的亮 氨酸氨肽酶（peptidase a, pep a）的晶体结构已经得到确认56- 57。随着微生物学和发酵技 术的不断发展, 以利用微生物发酵生产氨肽酶用于工业化生产和研究为目的的许多产氨肽 酶菌种被分离出来并用于酶制剂的生产3, 26。 植物中氨肽酶的研究相对较晚, 上世纪七十到八十年代的一些报道证明了植物组织中 氨肽酶的存在, 并从一些组织中提取了氨肽酶4。1975 年, sopanen 从大麦中纯化到了 lap58, 随后, 又从番茄, 马铃薯, 拟南芥叶子, 云豆子叶, 大麦种子等植物中纯化到了 lap59, 其中番茄 lap 是研究较为深入的植物性 lap60- 62。这些 lap 在植物组织中的功 能也逐步被揭示。 随着基因工程的发展, 许多lap 的基因被报道, 利用分子克隆技术表达重组 lap 的研 究也越来越多62- 63。 在肌肉 lap 的研究方面，1948 年，smith 在骨骼肌，心肌，子宫肌中发现了 lap 的 存在64。1960 年, koszalka 等在大鼠骨骼肌中发现了 lap, 并证明了此酶的活性在 ph8.5 到 9.0 的范围内最高65。1964 年 bodwell 在牛肌肉中发现 lap 的存在66。1966 年在这些 报道的基础上, joseph从猪的骨骼肌中部分纯化到了 lap67，并发现其性质与猪肾中 lap 性质相似46, 这是肌肉中有关 lap 纯化的最初报道。随后在很多其他动物，如鸡，兔等肌 肉中都有发现 lap68- 69，但是并没有见到有关 lap 纯化的报道。1991 年，mantle等人从人 的肌肉中提取了这种酶并对其性质进行了部分研究70。 1.3 本文的研究内容与意义 鲤鱼、草鱼和鲢鱼是我国水产养殖业中具有代表性的三种淡水鱼。鲤鱼属于鲤科，是 原产于亚洲的温带淡水鱼，分布在除澳洲和南美洲的全世界,是淡水鱼中品种最多、分布最 广、养殖历史最悠久、产量最高的鱼类。草鱼和鲢鱼也属鲤科，是我国重要淡水经济鱼类 中“四大家鱼” ，在我国有广泛分布。草鱼因食性简单，饵料来源广泛，且生长迅速，个 体大，产量高，常被作为池塘养殖和湖泊、水库、河道的主要放养对象。其肉质肥嫩，味 鲜美，营养丰富。鲢鱼生长快，疾病少，不需专门人工投饲。肉味虽没有青鱼、草鱼好， 但目前仍是池塘养殖特别是城郊养鱼的主体鱼，产量居首位，特别在江浙一带，占养殖总 产量的 40- 60。 中国是淡水渔业最发达的国家，但产量占我国渔业总产量 50以上的淡水水产品，其 加工比例却不足 5。我国淡水鱼加工业起步较晚，技术落后也严重制约了淡水渔业的发 展，特别是产量高的低值鱼类（鲢鱼，草鱼，鳙鱼等） ，大部分以鲜活形式销售。多年来 我国主要采用的加工方式主要是冷冻保藏或采用腌制、干制等传统工艺加工71。因此，扩 大淡水鱼加工规模，改进淡水鱼加工工艺，提高水产加工的技术含量，生产高附加值的水 产加工产品对于解决我国目前淡水鱼生产和加工之间的矛盾，促进水产加工和食品工业的 淡水鱼肌肉亮氨酸氨肽酶的分离纯化与性质研究 7 发展意义重大。例如利用低值淡水鱼生产鱼粉，鱼糜制品，鱼露，鱼骨粉，保健、美容品 等71- 72。 研究与淡水鱼鱼类贮藏、对淡水鱼原料和加工品的品质如弹性，风味，营养等有重要 作用的各种蛋白酶可以为水产加工提供重要的理论依据。如肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶 （myofibril- bound serine proteinase, mbsp）在鱼糜制品凝胶裂化中的作用73，肌肉金属蛋 白酶对胶原蛋白的分解作用74等。 氨肽酶是一种肌肉中普遍存在的蛋白酶，对于肉制品和鱼露等调味料中小肽、氨基酸 等风味物质和营养物质的形成起重要作用，lap 是最具有代表性的一类氨肽酶，但目前国 内外尚未见关于淡水鱼类中 lap 的报道。因此，本课题首次从鲤鱼、草鱼和鲢鱼这三种具 有代表性的淡水鱼肌肉中分离纯化 lap，并对其进行生物化学性质的分析与比较，试图对 lap 在淡水鱼肌肉中的分布和性质有所了解，对于更深入研究 lap 及其在肌肉中的生理 学功能和在淡水鱼加工中的应用具有重要理论价值，也为进一步探索鱼肌肉组织的生理学 变化提供理论依据。 集美大学硕士学位论文 8 第二章 材料和方法 2.1 材料 2.1.1 动物 鲜活鲤鱼、草鱼、鲢鱼，购于福建省厦门市集美区菜市场。 2.1.2 试剂 1deae- sephacel, sephacryl s- 200 hr 和 phenyl sepharose 6- fast flow 为 amersham biosciences 公司产品。羟基磷灰石为中科院过程研究所产品。 2econo- pac macro- prep high q column为 bio- rad 公司产品。 3荧光底物 arg- mca, boc- phe- ser- arg- mca， boc- leu- arg- arg- mca 为 peptide institute (osaka, 日本)公司产品。 4蛋白酶抑制剂 bestatin, pmsf，edta，egta，1, 10- phenanthroline monohydrate 和 其他荧光底物为 sigma 公司产品；e- 64 为 amresco (solon, oh, 美国)公司产品；pepstatin 为 roche (mannhem, 德国)公司产品。 5sds- page 用 protein marker 为 fermentas (lithuania)公司产品； 6牛血清白蛋白（b s a ）为北京经科宏达生物技术有限公司产品； 7考马斯亮蓝 r- 250 为 sanland- chem公司产品；丙烯酰胺，sds 为美国 bio- rad 公 司产品；temed，溴酚蓝为美国 sigma 公司产品； dtt 为美国 bio- rad 公司产品； 8以下试剂均为分析纯：tris 为德国 roche 公司产品；过硫酸铵为 sanland- chem 公 司产品；二甲亚砜为天津市光复精细化工研究所产品；硫酸铵, 氢氧化钠均为广东汕头市 西陇化工厂产品；磷酸氢二钠，磷酸二氢钠，氯化钠均为上海化学试剂公司产品。 2.1.3 实验所用溶液及其制备 2.1.3.1 pbs 系列缓冲液 （1）组织捣碎缓冲液 溶液 a：27.6 g nah2po42 h2o / l ( 0 . 2 m o l / l ) 溶液 b ：5 1 . 6 3 g na2hpo41 2 h2o / l ( 0 . 2 m o l / l ) 将溶液 a 和溶液 b 分别稀释配制成含有 0.02% nan3的终浓度为 25 mmol/l的溶液。 两者混合至 ph 为 7.0, 加入终浓度为 1 mmol/l 的 dtt 和 pmsf。 （2） 缓冲液 a 缓冲液 a 不加 pmsf, 其余同上。 （3）其它 pbs 缓冲液 溶液 a： 3.9 g nah2po4 2 h2o / l ( 2 5 m m o l / l ) , 1 1 . 6 9 克nacl （0.2 mol/l） ， 0.2g nan3/ l （0 . 0 2 w / v ） 淡水鱼肌肉亮氨酸氨肽酶的分离纯化与性质研究 9 溶液 b ：6 . 4 5 g na2hpo41 2 h2o / l ( 2 5 m m o l / l ) , 1 1 . 6 9 克 nacl （0.2 mol/l） ，0.2g nan3/ l （0 . 0 2 w / v ） 将溶液 a 和溶液 b 按适当体积比混合至 ph 为 7.0, 加入终浓度为 1mmol/l 的 dtt， 制得含 0.2 mol/l nacl的 25 mmol/l 的 pbs 缓冲液。含有 0.5 mol/l nacl的 pbs 缓冲液 和 1 mol/l (nh4)2so4的 pbs 缓冲液制备方法类似。 2.1.3.2 sds- page所用溶液 1）凝胶储备液（30%） ： 29g丙烯酰胺和 1g n， n- 亚甲叉双丙烯酰胺溶解于总体积为 60 ml 的去离子水，加热至 37溶解之，补加水至终体积为 100 ml 。用 nalgene 滤器（0.45 m 孔径）过滤除菌，查证该溶液的 ph 值应不大于 7.0，避光保存在棕色瓶中。 2）sds（10%） ：10g sds 粉末溶解于 100ml 去离子水，贮存于室温中。 3）temed（n,n,n ,n - 四甲基乙烯二胺） 。 4）过硫酸铵（10%） ：溶解于去离子水, 配制成 10%(w/v)的贮存液，保存 4。 5）tris- 甘氨酸电泳缓冲液：含 25 mmol/l tris 碱，250 mmol/l甘氨酸(电泳级)（ph 8.3）, 0.1% sds, 可配制成 5贮存液备用。在 900ml 去离子水中溶解 15.1g tris 碱和 94g甘氨 酸, 然后加入 50 ml 10%(w/v)的电泳级 sds 贮存液, 用去离子水补至 1000ml 则成 5 贮存液。 6）4sds 凝胶加样缓冲液：200 mmol/l tris- hcl，400 mmol/l 二硫苏糖醇（dtt） ， 8%sds， 0.4% 溴酚蓝，40%甘油。 7）1.5 mol/l tris- hcl（ph 8.8） 。 8）1.0 mol/l tris- hcl（ph 6.8） 。 9）考马斯亮蓝染色液：在 90ml 甲醇：水（1：1，v/v）和 10 ml 冰乙酸的混合液中溶解 0.25g考马斯亮蓝 r250，用 whatman 1 号滤纸过滤去颗粒状物质。 10）脱色液：300 ml 甲醇，100ml 乙酸，加水定容至 1l75。 2.1.3.3 dtt 的制备 在 20 ml 0.01 mol/l 乙酸钠溶液（ph 5.2）中溶解 3.09 g dtt，制得 1 mol/l的 dtt， 过滤除菌后分装成 1 ml 小份贮存于- 20。 2.1.3.4 pmsf的制备 用 dmso 溶解 pmsf 成 174 mg/ml （1 mol/l） ，分装成小份贮存于- 20。 集美大学硕士学位论文 10 2.1.4 实验所用仪器 仪器名称： 生产商： 垂直电泳槽 bio- rad，美国 紫外- 可见光分光光度计 eppendorf，德国 ph 计 beckman，美国 高速冷冻离心机 beckman，美国 超纯水系统 millipore，美国 凝胶成像装置 vibler lourmat，法国 涡旋振荡器 ika，中国 蛋白纯化系统 bio- rad，美国 组织捣碎机 kinematica，瑞士 荧光机 jasco，日本 恒温水浴锅 memmert，美国 脱色摇床 南达生物技术开发公司，中国 超低温冰箱 revco，美国 低温冷柜（4 ） 海尔，中国 电子天平 上海精科天平，中国 2.2 方法 2.2.1 lap 酶活的测定 酶活测定以 leu- mca为底物，参照 umetsu文献报道13，并进行适当修改：适当稀 释的酶液(100 l)加入至 850 l的缓冲液 a， 再加入 10 mol/l 底物 50 l并同时开始计时， 在 37 反应 10 min 后加入 1.5 ml 终止液（甲醇：异丙醇：水=35；30；35, v/v）终止反 应 ， 反 应 液 放 入 荧 光 测 定 仪 测 定 反 应 后 释 放 的 7-氨 基 - 4-甲 基 香 豆 素 (7- amino- 4- methylcoumarin, amc)的荧光强度，活力测定的激发波长为 380 nm，发射波长 为 450 nm，光径为 1 cm，消光系数按 2.5109 mol - 1lcm- 1。活力单位（u）定义为每 min释放 1 nmol amc 需要的酶量。 2.2.2 蛋白浓度测定 酶纯化过程中，用紫外分光光度计以 280 nm 下吸收值确定蛋白含量；纯化蛋白含量 用 lowry法测定76，以牛血清白蛋白为标准蛋白。 淡水鱼肌肉亮氨酸氨肽酶的分离纯化与性质研究 11 2.2.3 sds- 聚丙烯酰胺凝胶电泳（sds- page） 2.2.3.1 sds- page胶的制备 1）安装玻璃板。 2） 确定所需凝胶溶液体积, 按表2- 1中数值在一烧杯中按所需的丙烯酰胺浓度配制一定体 积的分离胶溶液，依次混合各成分。 表 2- 1 10sdspage 分离胶所用溶液 table 2- 1 reagents of resolving gel of 10% sds- page 凝胶体积 5 ml 去离子水 丙烯酰胺溶液 1.5 mol/l tris- hcl （ph8.8） sds（10%） 过硫酸铵溶液（10%） temed 1.5 ml 1.4 ml 1.0 ml 0.04 ml 0.04 ml 0.02 ml 3）迅速在两玻璃板的间隙中灌注丙烯酰胺溶液, 留出灌注积层胶所需空间。用移液枪小心 地在丙烯酰胺溶液上覆盖一层去离子水。将凝胶垂直放置在室温下。 4）凝胶聚合完成后, 吸掉覆盖层水。 5） 按表 2- 2 配制积层胶, 依次混合各成分, 在已聚合的分离胶上直接灌注积层胶, 立即在 积层胶溶液中插入干净的梳子。小心避免混入气泡, 将凝胶垂直放置于室温下。 表 2- 2 5%sds- page 积层胶所用溶液 table 2- 2 reagents of stacking gel of 5% sds- page 凝胶体积 1 ml 去离子水 丙烯酰胺溶液 1.5 mol/l tris- hcl （ph8.8） sds（10%） 过硫酸铵溶液（10%） temed 0.68 ml 0.17 ml 0.13 ml 0.01 ml 0.01 ml 0.001 ml 2.2.3.2 酶的 sds- page 取粗酶液, (nh4)2so4分级盐析后样品, 过 deae- sephacel, sephacryl s- 200, 羟基磷灰 石, phenyl sepharose 6- fast flow 和econo- pac macro- prep high q柱层析后酶液各60 l, 加 集美大学硕士学位论文 12 入 20 l sds 凝胶加样缓冲液, 95加热 10min 后上样于 10%聚丙烯酰胺凝胶, 每孔加样品 15 l。 将电泳装置与电源相接, 凝胶上所加电流设为 12 ma, 待溴酚蓝染料进入分离胶后设 为 15 ma, 继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部, 断开电源。 从电泳装置上卸下玻璃板, 小心撬开玻璃板取下凝胶后用考马斯亮蓝染色液浸泡, 微 波炉加热染色 220s, 倒出染色液后用甲醇/乙酸脱色液浸泡并缓慢摇动, 使凝胶脱色至条 带清晰为止75, 77。 2.2.4 提取纯化方案 纯化过程中, 温度控制在 4。 2.2.4.1 原料预处理 鲜活鱼敲击头部致死，冰水中充分冷却，去内脏，皮，骨后洗净，收集骨骼肌并切碎。 2.2.4.2 样品预处理 将500g切碎的肌肉放入3倍体积的含有1 mmol/l pmsf、 1 mmol/l dtt和0.02% nan3 的 25 mmol/l磷酸缓冲液（ph 7.0）中, 用组织捣碎机 15 sec /次, 分 12 次进行捣碎。将捣 原料预处理 deae- sephacel 离子交换层析 sephacryl s- 200 hr 凝胶过滤层析 羟基磷灰石层析 phenyl sepharose 6- fast flow 疏水层析 econo- pac macro- prep high q 离子交换层析 宰杀 样品预处理 粗酶液 硫酸铵分级沉淀 淡水鱼肌肉亮氨酸氨肽酶的分离纯化与性质研究 13 碎后的粗酶液, 以 10,000g离心 15 min，取上清液。 2.2.4.3 硫酸铵分级沉淀 2.2.4.3.1 硫酸铵“分馏”的确定 先进行辅助性的初实验，用宽范围的“馏分”确定所需活性的沉淀范围，初步确定从 40%硫酸铵浓度开始，以 20%饱和度为间隔测定。 预处理的样品液慢慢加入固体硫酸铵至饱和浓度为 40%， 同时搅拌溶液使浓度均匀 地增加，放置 1 h 后，离心收集所得沉淀并溶解于少量的缓冲液 a 中，同时取离心所得上 清边搅拌边缓慢加入固体硫酸铵至终浓度为 60%，放置 1 h 后，离心收集沉淀并溶解，离 心所得上清边搅拌边加硫酸铵至终浓度为 80%， 放置 1 h 后，离心收集沉淀并溶解，同 时收集所得上清。测定每步所得“馏分” （溶解的沉淀和上清）的蛋白含量和总活力，计 算各部分比活力。以比活力最高的部分确定“分馏”所使用的硫酸铵浓度。 2.2.4.3.2 硫酸铵分级沉淀 按照上面所得结果，粗酶液边搅拌边添加硫酸铵至终浓度为 40%，静止 1 h 后，以 12,000g离心 15 min，取上清液边搅拌边添加硫酸铵至上步所确定的终浓度，静止 2 h ， 以 12,000g离心 15 min，弃上清取沉淀。 沉淀用最少量的缓冲液 a 溶解，将溶解后的样品装入透析袋，以相同外液透析 18 h ， 期间更换 4 次透析液，每次 2 l。透析后样品以 15,000g离心 20 min，弃取不溶杂质，上 清液用 4 层纱布过滤，得到的酶液即可进行柱层析。 2.2.4.4 deae- sephacel 离子交换层析 将酶液上样于事先以缓冲液 a 平衡好的离子交换柱 deae- sephacel (2.525 cm), 并 以缓冲液a流洗去除杂蛋白后， 0 0 . 5 m o l / l n a c l 作线性梯度洗脱, 洗脱总体积为600 ml , 流速为 1 ml /min，同时以 5 ml /管收集。测定 a280, 检测并收集活性较高部分, 用 ym- 10 超滤膜进行超滤浓缩。 2.2.4.5 sephacryl s- 200 hr 凝胶过滤层析 以含有 0.2 mol/l nacl、1 mmol/l dtt和 0.02% nan3 的 25 mmol/l磷酸缓冲液（ph 7.0）平衡凝胶过滤柱 sephacryl s- 200 hr (1.598 cm), 将浓缩后的样品上样于该柱，然后 以相同的缓冲液洗脱, 每管收集 1 ml。样品测定 a280, 检测酶活力后, 将活性部分收集并 以缓冲液 a 透析。 2.2.4.6 羟基磷灰石层析 以缓冲液 a 平衡的羟基磷灰石(2.55 cm)，将透析后的样品上样于该柱后，以缓冲液 a 流洗。 待流洗去除杂蛋白后, 以 25100 mmol/l磷酸缓冲液 （ph 7.0， 含有 1 mmol/l dtt 和 0.02% nan3）进行线性梯度洗脱，洗脱总体积为 80 ml ，流速为 0.5 ml /min。每管收 集美大学硕士学位论文 14 集 1 ml 。测定 a280, 检测酶活力后, 将活性部分收集。 2.2.4.7 phenyl sepharose 6- fast flow疏水层析 将活性部分边搅拌边加入硫酸铵至终浓度为 1 mol/l，立即上样于事先以 1 mmol/l dtt、0.02% nan3和 1 mol/l （nh4）2so4的 25 mmol/l磷酸缓冲液（ph 7.0）平衡的疏 水亲和层析柱 phenyl sepharose 6- fast flow（14 cm） 。待流洗去除杂蛋白后，以 1 0 mol/l （nh4）2so4的 25 mmol/l磷酸缓冲液（ph 7.0，含有 1