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基于纳米材料修饰的电化学生物传感器的研究 摘要 纳米材料具有尺寸小、大的比表面积、优良的生物相容性等特点而受到人们 的广泛关注。将纳米材料引入电化学生物传感器中，可以大大提高生物传感器的 灵敏度和重现性等。基于纳米材料的这些独特的物理和化学性质，本文将纳米材 料用于电化学生物传感器的构建，得到两种性能优异的电化学生物传感器。其主 要内容如下： 1 、本章中基于多壁碳纳米管( m w n t s ) 与二氧化铈( c e 0 2 ) 纳米粒子之间 的协同效应研究了血红蛋白( h b ) 对双氧水( h 2 0 2 ) 的催化。通过优化m w n t s 、 c e 0 2 以及天然阳离子聚合物壳聚糖( c h i t ) 之间的比例，制作了一种优异的检 测h 2 0 2 传感器。该方法制作简单、经济实用，复合膜结合了m 帆、纳米c e 0 2 粒子以及c h i t 三种物质的优势，具有良好的电子转移能力、成膜能力和生物相 容性，这增加h b 的负载量，从而提高对h 2 0 2 的检测限。在p h = 7 0 的磷酸盐缓 冲溶液中，传感器对目标物的范围为5 0 1 0 击4 6 1 0 4m o l l ，检测线为6 5 1 0 。7m o l l ( 3 0 ) 。 2 、本章中基于纳米粒子生物条形码( b i o b a r c o d e ) 放大检测技术，构建出 一种高灵敏检测凝血酶( t h r o m b i n ) 的电化学适体传感器。凝血酶的适体i ( a p t a m e r i ) 做为捕获d n a 固载到金电极上，凝血酶的适体i i ( a p t a m e r l i ) 做为目标识别d n a ( t a r g e tb i n d i n gd n a ) 与条形码结合d n a ( b a r c o d eb i n d i n gd n a ) 按9 0 ：1 的比例同时 修饰到a u n p s ( d n a - a u n p s ) 2 ：，通过适体与目标物的高特异性、高亲和力，得到 三明治结构a u a p t a m e r i t h r o m b i n d n a - a u n p s 。标记p b s n p s 的d n a 作为信号链， 即生物条形码d n a ( b a r c o d ed n a ) ，通过与三明治结构上的b a r c o d eb i n d i n gd n a 发生杂交反应后，得到眭t a p t a m e r l i 、b a r c o d eb i n d i n gd n a 、b a r c o d ed n a 以及a u n p s 构成的生物形条码。因一个a u n p s 上结合了成百上千的b a r c o d ed n a ，所以每个 三明治结构上的p b s n p s 的量也被放大。凝血酶的含量与从生物形条码上溶解下来 的p b 2 + 的含量有关。另外，采用电化学阳极溶出伏安( d p a s v ) 技术检测具有良 好溶出伏安信号的金属离子p b 2 + ，使传感器的灵敏度进一步得到提高。结合这两 种技术，对目标物凝血酶的检出限为6 2 1 0 1 5m o l l ( 3 0 ) 。此外，该适体传感器 具有较高的选择性。 关键词：生物形条码；凝血酶；适体；血红蛋白；协同效应；纳米颗粒 s t u d yo ft h en a n o r 气r t i c l e s m o d i f i e d e l e c t r o c h e m i c a lb 1 0 s e n s o r a b s t r a c t n a n o p a r t i c l e sh a v ec a u g h tm o r ea n dm o r ea t t e n t i o nb e c a u s eo ft h e i rs m a l ls i z e s , l a r g es p e c i f i cs u r f a c ea n dg o o db i o l o g i c a lc o m p a t i b i l i t yc h a r a c t e r i s t i c s c o m b i n e dw i t h n a n o p h a s em a t e r i a l s ，t h e e l e c t r o c h e m i c a lb i o s e n s o rs y s t e m ，t h es e n s i t i v i t ya n d r e o c c u r r e n c ep r o p e r t yo ft h ee l e c t r o c h e m i c a lb i o s e n s o rc o u l db eg r e a t l yi m p r o v e d b a s e do nt h e i ru n i q u e p h y s i c a l a n de l e c t r o c h e m i c a lp r o p e r t i e s ，t w ok i n d so f e l e c t r o c h e m i c a lb i o s e n s o r sw i t l ll l i g hp e r f o r m a n c ef a b r i c a t e db yu s i n gn a n o p h a s e m a t e r i a l sw e r ea c h i e v e d t h em a j o rc o n t e n t so ft h et h e s i sa r ea sf o l l o w s ： 1 an o v e lh e m o g l o b i n ( h b ) b i o s e n s o rb a s e do nt h er e m a r k a b l es y n e r g i s t i ce f f e c t s o fc e r i u md i o x i d e ( c e 0 2 ) a n dm u l t i - w a l l e dc a r b o nn a n o t u b e s ( m w t c r s ) f o rd e t e c t i o n o f h y d r o g e np e r o x i d e ( h 2 0 2 ) i sp r e s e n t e d t h e h b c e 0 2 j m w n t s c h i t n a n o c o m p o s i t ew a sn a n o e n g i n e e r e db ys e l e c t e dm a t c h e dm a t e r i a lc o m p o n e n t sa n d o p t i m i z e dc o m p o s i t i o nr a t i ot op r o d u c eas u p e r i o rh 2 0 2s e n s o r t h ep r e p a r a t i o n m e t h o di sq u i t es i m p l ea n dp r a c t i c a l t h i sc o m p o s i t em a t r i xc o m b i n e dt h ea d v a n t a g e s o fm w n t s ，c e 0 2n a n o p a r t i c l e sa n dc h i t o s a n ( c h i t ) ，w i t hg o o de l e c t r o nt r a n s f e r a b i l i t y ，a t t r a c t i v eb i o c o m p a t i b i l i t ya n df i n ef i l m - f o r m i n ga b i l i t y ，w h i c hc o u l di n c r e a s e h ba t t a c h m e n tq u a n t i t ya n dh 2 0 2d e t e c t i o ns e n s i t i v i 哆i nt h eo p t i m u mp h7 0 p h o s p h a t eb u f f e r ，t h ee l e c t r o c a t a l y t i cr e s p o n s ee x h i b i t e dal i n e a rd e p e n d e n c eo nh 2 0 2 c o n c e n t r a t i o ni naw i d er a n g ef r o m5 0x1 0 石t o4 6x1 0 4m o l lw i t had e t e c t i o nl i m i t o f6 5x1 0 。7m o l l ( 3 0 ) 2 i nt h e p r e s e n ts t u d y ，a ne l e c t r o c h e m i c a la p t a s e n s o r f o rh i g h l ys e n s i t i v e d e t e c t i o no ft h r o m b i nw a sd e v e l o p e db a s e do nb i o - b a r c o d ea m p l i f i c a t i o na s s a y f o rt h i s p r o p o s e da p t a s e n s o r ，a p t a m e r ia s t h ec a p t u r ed n aw a si m m o b i l i z e do nt h ea u e l e c t r o d e t h ef u n c t i o n a la un a n o p a r t i c l e s ( d n a - a u n p s ) a r el o a d e dw i t hb a r c o d e b i n d i n gd n aa n dt h et a r g e tb i n d i n g ( a p t a m e r l l ) b yt r e a t i n ga u n p sw i t has o l u t i o n c o n t a i n i n gt h et w oa l k y l t h i o lc a p p e do l i g o n u c l e o t i d e sa ta9 0 ：1r a t i o t h r o u g ht h e s p e c i f i cr e c o g n i t i o n f o r t h r o m b i n ， as a n d w i c hf o r m a to f a u - a p t a m e r 眦r o m b i n d n a - a u n p sw a sf a b r i c a t e d a f t e rh y b r i d i z a t i o nw i t ht h e p b s n p s l a b e l e db a r c o d ed n a , b i o b a rc o d ec o m p r i s e do fa p t a m e r l i b a r c o d eb i n d i n g d n a , b a r c o d ed n aa n dk 心娃sw a so b t a i n e d s i n c eas i n g l ea un a n o p a r t i c l ec o u l d b el o a d e dw i t hh u n d r e d so fb a r c o d eb i n d i n gd n a , e a c hb a r c o d eb i n d i n gd n ac o u l d f u r t h e rh y b r i d i z ew i t ht h eb a r c o d ed n a , s ot h ea m o u n to fp b s n p sc o u l db ea m p l i f i e d o np e rs a n d w i c hf o r m a t 1 1 l ec o n c e n t r a t i o no ft h r o m b i nw a sm o n i t o r e db a s e do nt h e c o n c e n t r a t i o no fl e a di o n sd i s s o l v e df r o mt h eb i o b a r c o d e ap r e c o n c e n t r a t i o np r o c e s s o fl e a di o n st h r o u g hd i f f e r e n t i a l p u l s ea n o d i cs t r i p p i n gv o l t a m m e t r i cp p a s v ) t e c h n o l o g yf u r t h e ri n c r e a s e dt h es e n s o rp e r f o r m a n c e a sar e s u l to ft h e s et w o c o m b i n e de f f e c t s ，t h i sa p t a s e n s o rc o u l dd e t e c ta sl o wa u s6 2 x 1 0 。1 m o l lt h r o m b i n i n a d d i t i o n ，t h es e n s o re x h i b i t e de x c e l l e n ts e l e c t i v i t ya g a i n s to t h e rp r o t e i n s k e yw o r d s ：b i o b a r c o d e ；t h r o m b i n ；a p t a m e r ；h e m o g l o b i n ；s y n e r g i s t i ce f f e c t s ； n a n o p a r t i c l e s 基丁纳米材料修饰的电化学生物传感器的研究 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢中所罗列的内容以外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得其他教育机构的 学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在 论文中作了明确的说明并表示谢意。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。 本人签名：开眵爷签字目期带月孚日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人 授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。本人离校后发表或使用学位 论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，署名单位仍然为青岛科技大学。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 本学位论文属于： 保密口，在年解密后适用于本声明。 不保密口。 本人签名：并重尹 签字r 期：炒罗年6j 弓1 8 日 导师签字：刁l 嵌虹 签字日期：矽哆年占月馏同 青岛科技大学研究生学位论文 第一章前言 近2 0 多年来，传感器技术领域有了很大的进展，生物传感器以其出色的灵 敏度以及高度的选择性引起了广泛的关注。生物传感器的应用已使过去被认为极 难进行的科学实验变得相对容易，因此，它的研制开发已被认为是当代生物工程 的重大领域之一。 纳米材料具有尺寸效应、小尺寸效应、表面效应及宏观量子隧道效应这些独 特的性质，与传感器所要求的多功能、微型化、高速化相互对应。另外，作为传 感器材料，还要求功能广、灵敏度高、响应速度快、检测范围宽、选择性好、耐 负荷性高、稳定可，纳米微粒能较好的符合上述要求。纳米技术的出现为纳米粒 子在分析化学领域的发展开辟了新的思路，有利于推动生物传感的发展，使其应 用范围更加广阔。 1 1 生物传感器组成、工作原理、分类及固定化方法 1 1 1 生物传感器的组成 生物传感器由生物敏感元件和信号转换器两个主要部分组成。传感器是一种 信息获取与处理的装置。对物质成分传感的器件就是化学传感器，它是一种小型 化的、能专一和可逆地对某种化学成分进行应答反应的器件，并能产生与该成分 浓度成比例的可测信号。 1 1 2 生物传感器的工作原理 当待测物质与生物敏感膜( 含有能与目标物进行选择性作用的生物活性组 图1 - 1 生物传感器原理图 f i g 1 1s c h e m a t i ci l l u s t r a t i o no ft h eb i o s e n s o r 基丁纳米材料修饰的电化学生物传感器的研究 分) 接触时，生物活性组分与目标物之间相互作用产生生物学反应信息。换能器 则能敏感捕捉反应信息，并将其表达为可检测的物理信号，如电化学、光学、热 学、压电学等响应信号，其大小与待测物的含量存在定量关系，从而实现对待测 物质的定量检测，其原理如图1 - 1 所示。 1 1 3 生物传感器分类 生物传感器一般可以从以下两个角度来进行分类：按识别元件上的敏感物质 和按转换器件。 根据生物传感器中生物分子识别元件上的敏感物质的属性可分为：酶传感器 【1 1 、d n a 传感器【2 】、免疫传感器【3 】、微生物传感器【4 】、细胞传感器【5 l 等。 按转换器件分类，可分为：化学生物传感器、热生物传感器、光生物传感器、 半导体生物传感器和声生物传感器等。其中电化学生物传感器是以生物活性物质 为分子识别物，并以适当的电极将浓度信号转换成电信号，以电势、电流或电容 为特征检测信号的生物传感器。 1 1 4 生物传感器中生物敏感元件的固定化方法 生物传感器的选择性主要取决于生物敏感材料，而灵敏度的高低则与信号转 换器的类型、生物材料的固定化技术等有很大的关系。为了研制灵敏度高，选择 性好和寿命长的生物传感器，生物识别分子固定化技术显得非常重要。经过近2 0 年的发展，已经建立了对各种不同生物功能物质的固定化方法，大致可划分为以 下方法：物理或化学吸附法、包埋法、共价键固定法、交联法，随着膜技术的发 展一些新型的成膜技术例如分子自组装技术，纳米粒子修饰技术【6 ，7 】等也开始广泛 应用于制备生物传感器。 1 1 4 1 吸附法 经非水溶性载体物理吸附或离子结合作用使生物敏感元件固定，称为吸附 法。吸附法的优点是方法简便、操作条件温和，无需化学试剂，活化和清洗的步 骤较少，对酶活性影响较小。l k a r i y a m a 等【8 】采用微铂电极，在含有氯铂酸和葡萄 糖氧化酶的溶液中进行恒电流或恒电位电解，由于铂黑的微粒有较大的比表面 积，对酶产生强烈的吸附，使酶分子吸附在电解过程中产生的铂黑微粒上。吸附 法不足之处是生物分子与固定表面结合力弱，使制得的生物传感器易于发生生物 分子的泄漏或解脱，生物组分的寿命较短，灵敏度低，重现性差。 1 1 4 2 包埋法 该技术的特点是：操作条件比较温和，膜的孔径和形状可以随意控制，一般 不产生化学修饰，对生物组分活性的影响比较小，并可采用其他固定化技术如共 2 青岛科技大学研究生学位论文 价键合和交联进一步改善膜的稳定性。缺点就是需要控制很多实验因素。迄今为 止，应用最普遍的固定化技术是采用凝胶聚合物包埋，如溶胶凝胶聚丙烯酰胺 能将酶分子或细胞固定在高分子聚合物三维空间网络结构中，形成稳定的敏感 膜。 1 1 4 3 共价键合法 使生物活性分子通过共价键与电极表面结合而固定的方法称为共价键合法， 这种方法通过特殊键的形成而将生物分子固定化于固体表面，因而不易发生分子 的泄漏，并且改善了分子在表面的定向、均匀分布状况。通常要求在低温、低离 子强度和生理p h 条件下进行，并常加入酶的底物以防止酶的活性部位与电极表 面发生键合。共价键合法的缺点是生物分子易失活、操作复杂、耗时、成本较高。 1 1 4 4 交联法 通过采用双功能团试剂，在酶分子之间、酶分子与凝胶聚合物之间交联网状 结构而使酶固定化的方法称交联法。最常用的交联试剂为戊二醛，它能在温和的 条件下与蛋白质的自由氨基发生s c h i f f 碱反应。该固定方法程序简单，结合牢固， 因此被广泛用于酶膜和免疫分子膜的制备【9 】。该法的缺点主要是膜的形成条件不 易确定，形成的酶蛋白质层蓬松、坚固性差，所需生物样品量多。 1 1 4 5 分子自组装技术 所谓自组装( s e l f - a s s e m b l y ) ，就是通过分子间化学键或超分子作用在一定 的条件下自发地形成特定的有序结构。这类膜最大的优点在于：( 1 ) 这种方法 适用于大多数水溶性蛋白质；( 2 ) 膜的组成和层数可人为控制；( 3 ) 组装条件 温和，不易使蛋白质失活；( 4 ) 高密度堆积和低缺陷浓度；( 5 ) 制备相对简单， 不需昂贵的设备。由于自组装膜结合了l br l a n g m u i r - b l o d g e t t ) 膜的分子有序性和 化学吸附的稳定性，并且其本身具有广泛的仿生及生物亲和性，因此在化学和生 物传感器方面展示出诱人的应用前景。随着研究的深入，分子自组装膜的制备方 法也由最初的简单吸附得到的单层膜发展到三维结构的多层膜【1 0 l 。 s h i 等【1 1 1 利用带负电的金纳米粒子和带正电的硫堇层层组装构成多层复合 膜，这种多层复合膜为癌胚抗体( a n t i c e a ) 的固载提供了平台，检测癌胚抗原 ( c e a ) 时具有良好的线性范围0 2 8 0 0n g m l ，检测线达到0 0 7n g m l ( 3 0 ) 。 y o o n 等【1 2 , 1 3 利用s c h i f f 碱共价力在金电极表面组装了葡萄糖氧化酶第四代 聚酰胺接枝聚合物多层膜，修饰后的金电极的生物电催化活性与膜的组装层数直 接相关。 k e r r n a n 等f 1 4 j 使用e d c 和n h s 为键合试剂将寡聚核苷酸探针固定在3 巯基 丙酸( m p a ) 自组装膜上，并对其固定机理进行探讨，认为单链d n a 上的氨基 与n i - i s 活化的毓基丙酸自组装膜形成肽键，从而将单链d n a 固定，并可以进一 3 基丁纳水材料修饰的电化学生物传感器的研究 步发生杂交反应。 1 2 酶传感器 酶传感器是生物传感器中研究和应用最多的一种，是生物传感器的最典型代 表。自1 9 6 2 年以来，c l a r k 和l y o n s i l 5 】将葡萄糖氧化酶和电极结合起来制成第一 支酶传感器，酶传感器便迅速发展并成为新的分析装置，它兼备酶法和电极法的 优点，测定迅速而准确。与传统分析方法相比，酶生物传感器具有独特的优点： ( 1 ) 选择性高，能够直接在复杂试样中进行测定；( 2 ) 反复多次使用； ( 3 ) 响应快；( 4 ) 体积小，可实现在线监测；( 5 ) 成本低，便于推广普及。由于这 些优点，酶传感器广泛应用于工业发酵、临床监测及监护等方面。 1 2 1 酶传感器的原理及分类 酶生物传感器由固定化的酶与换能器组成。其中，酶作为生物敏感基元，可 敏感而专一地作用于某种底物产生生物信号，由换能器将生物信号转化为可测量 的光信号、电信号以及热信号等，从而实现对目标物含量的测定。 按测量信号不同，电化学酶传感器又可分为电流型、电位型、电容型【1 6 】和电 导型r 7 1 。其中，电流型酶传感器是生物传感器领域中最重要、研究得最多，且最 灵敏的一种类型。电流型酶传感器的原理是利用固定在电极表面上的酶对酶底物 的催化氧化或还原，产生可在电极上还原或氧化的组分，获得电流信号【1 8 1 。酶氧 化还原活性中心与电极表面之间的电子传递，在电流型酶传感器中起着关键性的 作用。 1 2 2 酶传感器的发展历程 酶传感器的研究主要经历了以下三个发展阶段。 第一代酶生物传感器是由固定了酶的非活性基质膜与电化学电极组成，直接 检测酶反应底物的减少或产物的生成。 第二代酶生物传感器是介质型酶生物传感器，加入媒介体来促进电子传递过 程，通过检测媒介体的电流变化来反映底物浓度的变化。各种媒介体的使用，使 得电流型酶传感器的响应速度和灵敏度都得到了很大的提高。目前，常用的媒介 体有二茂铁及其衍生物、四硫富瓦烯、有机染料等【1 蛇1 1 。 以媒介体为桥梁的蛋白质的间接电化学研究的主要缺点是，它无法真正深入 研究氧化还原蛋白质的电化学性质及其电极过程，因为所有的电化学响应实质上 都来自于媒介体而不是蛋白质本身。第三代酶生物传感器中无媒介体存在，利用 酶自身与电极间的直接电子转移来完成信号的转换，提高了酶生物传感器的灵敏 4 青岛科技人学研究生学位论文 度。研究氧化还原蛋白质的直接电化学不仅可以提供能量转换和代谢过程的生命 信息，为开发第三代生物传感器的制备提供理论指导，而且对了解它们在生命体 内的电子转移机理和生理作用机制具有重要意义f 2 2 1 。 1 2 3 血红蛋白直接电化学行为的研究进展 血红蛋白( h b ) 作为最为典型的一种氧化还原蛋白质，其结构是目前研究得 最为清楚的蛋白质之一、分布的广泛、价廉易得，一直是研究血红素类蛋白质甚 至其它氧化还原蛋白质直接电化学以及生物传感和电催化的理想模型( 图1 2 ) 。 h b 直接电化学研究的一个重要应用就是制备无媒介体型的第三代生物传感器， 可作为类酶催化检测一些生物小分子，如h 2 0 2 【2 3 】、0 2 【刎、n o t 2 5 1 和一些环境污染 物如n 0 2 2 6 2 7 1 。但是h b 空间结构庞大，电活性中心往往紧紧地被酶蛋白本体所 封闭，使其难于接近电极表面，因而在普通电极上的电子转移速率很低。为此， 不少学者对其进行了研究。 f n e e 图1 - 2 血红蛋白的结构 f 适1 - 2t h es t r u c t u r eo fh e m o g l o b i nc a b ) 近来，利用薄膜修饰电极来研h b 的直接电化学行为是一种最主要的方法。 被修饰在电极表面的薄膜不仅能为h b 提供一个类似于其生物膜的微环境，保持 其自然结构和生物活性，而且能阻止杂质以及加速h b 与电极之间直接快速的电 子交换。同时在薄膜修饰电极中，蛋白质和酶的用量极少，这为蛋白质的直接电 化学研究提供了极大的便利。 1 2 3 1 室温离子液体界面 室温离子液体作为一类新型的软功能材料f 2 8 1 ，具有许多优良的性能，如高的 离子导电性、宽的电化学窗口、有良好的溶解性，以及良好的化学和热力学稳定 性等，使其在电化学的许多方面都有巨大的应用前景。在直接电化学应用方面， 离子液体既可以作为电解质，又可以作为固定材料来使用。研究发现固定于含有 5 基丁纳米材料修饰的电化学生物传感器的研究 离子液体复合材料中的蛋白质、酶具有良好的稳定性和催化活性，并且能发生直 接电子转移【2 9 删。 s u n 等【3 1 】利用直接涂布法将f r o 、碳酸钙纳米粒子和n a t i o n 层层修饰到自制 的离子液体 b m i m i p f 6 修饰碳糊电极表面，制成了相应的h b 修饰电极。实验结 果表明，h b 在膜内基本保持了其生物活性，并且其电子传递能力明显增强，在 缓冲溶液中描出现一对准可逆的氧化还原峰，为h b 血红素辅基f e ( i i i ) f e ( i i ) 电对 的特征峰。检测h 2 0 时，在8 0 1 0 6 。2 0 1 0 4m o l l 浓度范围内呈现良好的线 性。 w e n 等【3 2 】将h b 固载到室温离子液体 b m i m p f 6 与含多糖的植物凝胶形成的 复合膜中，紫外可见吸收光谱、循环伏安法( c v ) 和交流阻抗法( e i s ) 均表明 h b 在该复合膜中能保持生物活性，并对h 2 0 2 表现出良好的催化效果。 l u 等【3 3 】人将亲水性离子液体1 丁基3 甲基咪哇四氟硼酸盐( b m i m b f 4 ) 、 壳聚糖和h b 按照一定比例配成混合溶液后涂布于玻碳电极( g c e ) 制备出h b 修饰电极，循环伏安扫描可以得到f e ( i i i ) f e ( i i ) g b 对的一对准可逆氧化还原峰， 表明l i b 在该复合膜中能保持良好的生物活性。对环境污染物质t c a 的检测时， 0 4m m o l l 到5 6m m o l l 范围内具有良好的线性关系，取得良好的实验效果。 1 2 3 2 模拟生物膜界面 在生命体内，类脂和蛋白质共同组成了生物膜，类脂属于一种具有疏水基团 和亲水基团的表面活性剂。将某些表面活性剂通过吸附、滴涂、共价键合、自组 装或l b 膜转移等方法引入到电极表面，由表面活性剂所组成的双分子层与生物 细胞膜中类脂所组成的双分子层结构很类似，故而称为模拟生物膜。h b 在模拟 生物膜界面中的电子转移类似于h b 在生命体内的电子转移，因此研究l i b 在该模 拟生物膜上的直接电化学对于研究生命体内的电子转移机制有着实际的意义。 r u s l i n g 等【3 4 1 人探讨了h b 在涂布于石墨电极上的双十烷基二甲基溴化铵( d d a b ) 多双层表面活性剂薄膜上的可逆电化学信号。在p h5 5 的乙酸缓冲溶液中，h b 在界面上表现出一对峰形可逆的氧化还原峰，式电位为8 4 6m v ( v s s h e ) ，对 应于h b 的氧化还原中心f e ( r i ) f e ( i i ) 的相互转换。 1 2 3 3 溶胶凝胶界面 用溶胶凝胶可以为生物分子提供一个水溶液的微环境，其多孔网状结构使其 能作为生物大分子合适的固定载体。溶胶凝胶包埋固定的优势在于可以较好地保 持蛋白质表面微观结构的整体性、方向性和自然性，从而对活性组分的活性和稳 定性损失较少。 n a d z h a f o v a 等【3 5 】通过电沉积方式将h b 与s i 0 2 凝胶固载到玻碳电极上，蛋白 质大分子基于物理化学作用固载于溶胶凝胶界面上，成功地实现了f r o 的直接电 6 青岛科技人学研究生学位论文 化学和生物催化活性。在醋酸缓冲溶液中，有一对可逆的氧化还原峰，峰电位分 别为0 2 9v 和0 1 7v ，对应于h b 血红素辅基f e ( r i ) f e ( i i ) 电对的特征峰。 y u 3 6 】等采用气相沉积的方法在玻碳表面得到t i 0 2 的凝胶膜，并固定h b 得到 了h b t i 0 2 凝胶界面。h b 在此膜内可以有效保持自身结构和生物活性，并对h 2 0 表现出良好的催化性能。 1 2 3 4 纳米修饰电极 如果将生物大分子和纳米粒子同时修饰到电极表面，细小的纳米粒子可渗透 到生物大分子内部接触到生物大分子的电活性中心，从而缩短生物大分子活性中 心与电极表面的距离，加快直接电子传递的速度。同时纳米粒子具有良好的生物 兼容性，对于保持蛋白质与酶等生物分子的生物活性、促进氧化还原蛋白质的直 接电子传递具有重要作用，因而受到广泛关注。 y u 等1 3 6 】通过静电作用先将h b 吸附于碳纳米管修饰的石墨电极表面，形成核 壳结构，再将碳纳米管和f i b 的混合液滴涂于此核壳结构表面，形成复合的 h b 例m n t s g p 电极界面。h b 不但在该界面上成功实现了直接电化学，同时也能 更精确地控制f i b 在电极表面的量。z h a o 等【3 7 】将多壁碳纳米管( m w n t s ) 与h b 通过静电作用形成核壳结构，将该混合液涂布到热解石墨( p g ) 电极上，h b 在 该界面上保持了很好的活性，成功地实现直接电化学。 u 等1 3 8 】利用表面活性剂g e m i n i 、还原剂1 ，3 双( 十六烷基二甲基胺) 丙烷二 溴化物( g e m l 6 3 1 6 ) 与h a u c h 合成出性质稳定、粒径均匀的纳米金颗粒 ( g e m l 6 3 1 6 - a u ) 。实验证明，g e m l 6 3 1 6 - a u 为i - l b 的固载与加速h b 和电极 之间的传递提供了一个非常有力的微环境( 图1 3 ) 。p h7 0 的p b s 溶液中，组装 电极h b g e m l 6 3 1 6 a u g c 上出现一对可逆氧化还原峰，峰电位分别为- - 0 2 5 6 v 和- 0 2 0 6 v ( v s s c e ) 。 辣拿+ o e m l 6 - 3 - 1 6 - a u 衲 hn a m q a r t i c h 2 z ，一o 日吡辱，描 一d 簟l f o e l 童张e t n t o - 溯 铸髓 g c 图1 - 3h b 在纳米复合材料g e m l 6 3 1 6 0 a u 中的电化学行为 f i g 1 - 3t h ei n t e r a c t i o n so fg e m l 6 - 3 1 6 - a un a n o c o m p o s i t ea n dh bm o l e c u l e 7 基丁纳米材料修饰的电化学生物传感器的研究 z h a o 等i ”i 采片j 气相沉积的方法在玻碳表面得到t i 0 2 的凝胶膜，将m o 银 纳米粒子( c s n s ) 固载到该凝胶膜中，c s n s 明显提高了h b 的电子转移能力。 可逆氧化还原峰电位分别为0 2 9 8 v 和03 6 4 v ( v sa g a g c i ) ，对n 0 2 表现h j 良好 的催化还原效果线性范围为：0 2 6 0 m m o l l ，检钡憾为3 4 0f z r n o l l ( 3 0 ) 。 c h r i s t o p h e r 等【柚1 采用电沉积的方式在i t o 电极上组装t i 0 2 纳米颗粒与肌醇 六磷酸( p h y t i ca d d ) 的多层膜， i b 在多孔膜中表现出良好的直接电化学行为， 实验表明坝分子纳米层的层数对h b 的电化学活性有影响。 c a o 等i “i 利用带负电荷的f e 3 0 4 纳米颗粒与带正电荷的h b 在热解石墨电极 上进行层层组装，石英晶体微天平( q c m ) 、紫外吸收光谱、以及电化学循环伏 安法实验均表明第六个双分于层印f f c 3 0 以x o 6 具有最好的生物活性。泼传感器对 多种底物( 0 2 、h 2 0 2 、n 0 2 和c c l 3 c o o h ) 表现出良好的催化活性。 c h e n 等【4 1 结合多壁碳纳米管( m w n t s ) 与金纳米粒子( g n p s ) 这两种纳米 颗粒的优点，采用自组装技术，构建第三代无介质的h 2 0 2 的传感器( 图1 _ 4 ) 。 与只m w n t s 用相比，该传感器的检测范围更宽，检测线史低，达到8 0 1 0 叫 m o i l ( 3 0 ) 。 、 n 、i 一 j f q o t ) h h 、l u 、 。 h 、m 、f t f u3 _ 。 、。 【t 、 固1 4 修饰电极的组装过程 f 1 4 i l l u s t r a t i o n o f t h ep ”p a r a t i o np r o c e s s o f m o d i f i e de l e c t r o d e 另外，利用h b d n a 界面，实现h b 的直接电化学也有报道( 4 3 ，棚。这归因于 d n a 具有独特的双链结构和良好的生物相容性，使其作为良好的蛋白质固定材 料。 1 3 电化学适体生物传感器 电化学适体生物传感器是由同定了适体的电极和电化学活性以别元素构成。 首先在适当的条件下将适体固定到电极表面，待测物与适体特异性识别导致适体 的结构发生叟化，然后通过检铡电极表面电话性识别7 l 素的电信号，达到识别和 青岛科技大学研究生学位论文 鉴定靶物质的目的。电化学适体生物传感器由于具有较高的灵敏度和选择性、价 格低廉、自动化程度高，被认为是一种有发展f j 景的分析测试方法。 1 3 1 适体优点 适体指的是经过一种新的体外筛选技术s e l e x ( s y s t e m a t i ce v o l u t i o no f l i g a n d sb ye x p o n e n t i a le n r i c h m e n t ) ，从随机单链寡聚核苷酸文库中得到的能特异结 合蛋白质或其他小分子物质的单链寡聚核苷酸【4 5 1 。核酸适体与配体结合时，通常 会通过构型适配形成一些稳定的二级结构，如发卡( h a i r p i n ) 、茎环( s t e m 1 0 0 p ) 、 g 四聚体( g t e t r a m e r ) 等。适体作为传感器的分子识别物质与其它分子识别物质 相比，具有以下优点1 4 6 , 4 7 1 ： ( 1 ) 高特异性、高亲和力：适体作为分子识别物质与目标分子的结合具有 高特异性和高亲和力，适体与配体间的亲和力常大于抗原抗体之间的亲和力【鹌1 ， 解离常数一般为l x l f f 9 。l x l o d 2m o l l 。因此，适体传感器具有良好的选择性。 ( 2 ) 目标分子范围广：抗体只可以与抗原结合，酶只与其底物结合，单链 d n a 只与其碱基配对的单链d n a 结合，而适体不仅可以与酶、抗体、细胞粘附 分子等较大的蛋白质分子结合，而且也可以与药物、氨基酸、金属离子等小分子 物质结合。因此，适体传感器应用更广泛。 ( 3 ) 体外筛选、化学合成：适体的制备不依赖于动物或细胞，而是由s e l e x 技术体外筛选产生的，可通过改变筛选条件及筛选后修饰，使筛选出的适体适应 不同反应体系的需要。筛选出的适体可以通过化学合成生产，较单抗制备更快速、 更廉价。这有利于生物传感器的批量生产。 ( 4 ) 分子量小：适体是一段由2 5 8 0 个碱基组成的单链寡核苷酸片段，分 子量一般为8 1 5k d a ，与目标分子结合空间位阻小。这有利于构建高密度阵列 生物传感器。 ( 5 ) 稳定性、可复性好：相对于酶和抗体抗原，适体不仅具有良好的稳定 性，而且可反复变性、复性，进行重复利用。这有利于提高生物传感器的寿命和 实现重复使用。 核酸适体的出现，使人们认识到核酸不仅是遗传信息的存储和转运载体，而 且也可作为各种功能分子。适体从9 0 年代初出现以后，就得到了科研工作者的 广泛关注，适体的研究工作得到了快速的发展。 1 3 2 电化学适体传生物感器的应用 电化学适体生物传感器根据有无标记可分为标记型电化学适体生物传感器 和非标记型电化学适体生物传感器f 4 9 】。 9 基丁纳米村料修饰的电化学生物传感器的研究 13 21 标记型电化学适体生物传感器 标记型适体乍物 感器主要为电流型，具有灵敏度高的优点，在电化学适体 传感器中研究较多。根据电活性标记物的不同，可分为小分予电活性物质标记( 亚 甲蓝、一茂铁) 、酶标记( 辣根过氧化物酶、葡萄糖脱氢酶) 和纳米粒子标记( 金、 银) 等。大部分标记型的电化学适体传感器均把电活性物质标记的适体固定于电 极表面，与日标分子识别后，因构象的改变使电活性物质与电极问的距离减少， 电化学信号增大，为s i g n a lo i l 型。与之相对应，因电活性物质标也的适体与待测 物结合后使电化学信号减小而进行测定的，为s i g n a lo f f 型。 r a d i 等1 5 0 报道了基于二茂铁为电化学信号物质检测钾离子的电化学适体传 感器( s i g n a l o n 型) ，他们将二茂铁标记的钾离予适体自组装周定到金电极表面， 没有目标分子存在时，标电物二茂铁离电极距离比较远，影l 嘲了电极和一茂铁之 间的电子转移；适体与钾离子结台后，适体构型改变为g 一四聚体，促使标记的二 茂铁接近电极表面，提高了电子转移效率，电流信号增太。根据适体与钾离予结 台前后电极电流的变化对试样中的钾离子进行选择性测定。基于同样的原理，埘 等m 1 将亚甲蓝做( m b ) 为电化学信号物质，构建出一种榆测血清中血小板生长 因子( p d g f ) 的电化学适体生物传感器，属s i g n a lo n 型，其检测原理如图1 5 所示。在血样和稀释血样中检出限分别达到1n m o i l ( 3 呻与5 0 p m o i l ( 3 。 图1 基于亚甲蓝标记型电化学适体持感嚣检测p d g f 的原理图 f i 9 1 5 t h e p r i n c i p l e o f a p t a m e r - b a s e dp d g f f a b r i c a t e db ya l l m b - l a b e l e da p t a m c r s i g n 蚰o f f 型是根据电活性物质标h 的适体与待测物结合后信号的减小而测 定的，存在背景电流大，检出限高等缺点。x i a o 等【5 。i 将标记m b 的适体( 3 2 个 碱基) 自组装在金电极表面上，与凝血酶结合前，呈现来折叠构象，0 i 乜极表面 距离较近，电流响应大：与凝血酶结合