乙肝血清标志物检测ppt课件

乙肝血清学标志物检测及意义,1,要点,简介抗原组成传染源传播途径病原学诊断血清学模式及临床意义,End,2,前言,病毒性肝炎在我国各类传染病中发病率最高乙型病毒性肝炎在我国危害极大我国乙型肝炎患者近3千万病毒性肝炎，一般特指由嗜肝病毒感染所引起的肝炎。HBV-属嗜肝DNA病毒,3,A,病毒性肝炎HepatitisVirus,肠道传播,肠道外传播,F,TTV?其它,E,NANB,B,D,C,病毒性肝炎-背景,4,传染源,粪便,血液/,血源性物质/,体液,血液/,血源性物质/,体液,血液/,血源性物质/,体液,粪便,传播途径,粪-口,经皮肤/经粘膜,经皮肤/经粘膜,经皮肤/经粘膜,粪-口,慢性感染,否,是,是,是,否,病毒性肝炎类型,A,B,C,D,E,基因组类型ssRNAdsDNAssRNAssRNAssRNA,5,HepatitisBVirus,乙型肝炎的病原体乙型病毒性肝炎1是由乙肝病毒（HBV）引起的、以肝脏炎性病变为主并可引起多器官损害的一种传染病。本病广泛流行于世界各国，主要侵犯儿童及青壮年，少数患者可转化为肝硬化或肝癌。因此，它已成为严重威胁人类健康的世界性疾病，也是我国当前流行最为广泛、危害性最严重的一种传染病。,6,乙型病毒性肝炎无一定的流行期，一年四季均可发病，但多属散发。近年来乙肝发病率呈明显增高趋势估计全球半数以上人口已被HBV感染过，5%的人口为HBV慢性感染.中国：乙肝高发区，人群HBsAg的检出率达9.8%,7,电镜下HepatitisBVirus,8,乙型肝炎病毒HBV,乙型肝炎病毒（HBV）为专一的嗜肝病毒，近年由于核酸分子杂交技术的进展，在肝外器官细胞也能检出HBV-DNA。通过北京乙肝肝病毒试验研究提供了在肝外细胞复制的证据。人HBV也可能在肝外细胞内复制，有待深入研究。HBV感染者血清经电镜检查有3种病毒颗粒.1.大球形颗粒，完整的HBV颗粒直径为42nm，又名Dane颗粒，分为包膜与核心的两部分，外衣壳及包膜含有表面抗原，衣壳内为核心结构，有核心抗原，核心抗原下面藏有e抗原。,9,乙型肝炎病毒HBV,.小球形颗粒，阳性血清中最多的颗粒，主要为表面抗原，不含核酸及成分，为不完整的.管形颗粒，实际上是一串小球形颗粒聚合在一起的，也含有表面抗原,10,1.HBV形态结构,大球形颗粒（Dane颗粒）,小球形颗粒,管形颗粒,11,HBVvirion,TheinfectiousvirioniscalledtheDANEparticle.,12,Dane颗粒（完整的病毒）形态,HBsAg,HBcAg,HBVDNA,DNAP,（外膜蛋白）,（核衣壳蛋白）,13,BothcomprisedofHBsAg,14,HBVnomenclature,HBV:hepatitisBvirusHBsAg:hepatitisBvirussurfaceantigenHBsAb:hepatitisBvirussurfaceantibodyHBcAg:hepatitisBviruscoreantigenHBcAb:hepatitisBviruscoreantibodyHBeAg:hepatitisBviruseantigenHBeAb:hepatitisBviruseantibody,15,抗原组成(一)-HBsAg,位于病毒表面，是一种糖蛋白(曾用名：澳抗)出现时间：HBV感染后26个月（潜伏期）HBsAg有10个亚型，各亚型间存在不完全的交叉免疫。近年用亚型单克隆抗体研究表明，d和y、w和r决定簇可以同时存在于同一病毒抗原颗粒上，形成adwr、aywr、adyw和adyr复合亚型。,16,其机制为不同亚型病毒的双重感染；单一亚型病毒感染后，有的HBV-DNA发生点突变。临床表现病情反复，肝脏损害较重，因而有的HBV感染者血清中同时HBsAg阳性、抗-HBs阳性。4种亚型(adr,adw,ayr,ayw)。刺激机体产生保护性抗体即抗-HBs.,17,HBsAg血清中HBsAg阳性是HBV感染的标志。本身具有抗原性，无传染性。但由于HBsAg常与HBV同时存在，故认为是传染性标志之一。但须注意，HBV-DNA可自X基因区终点起逆向与肝细胞发生整合，整合后的S基因表达较强，不断产生HBsAg，整合的HBcAg基因组被抑制，不表达HBeAg、HBcAg，在这种情况下，即使HBV已从体内清除，而HBsAg仍可持续阳性，从理论上讲，这种HBsAg阳性血液并无传染性。,18,急性HBV感染后，血清中首先出现HBsAg，整个急性期均可阳性，至恢复期可滴度下降或转阴。如HBsAg持续阳性半年以上，称为慢性HBsAg携带者（无症状HBsAg携带者），可持续阳性达数年。一般认为HBsAg滴度与病变程度不成比例。肝功能正常，HBsAg滴度高，肝脏可重要病变，若HBsAg阴性及DNAp阴性，表示无重要传染性。反之，肝功能异常，HBsAg滴度不高，肝脏可有明显病变，如有部分肝硬化、肝癌患者呈HBsAg阴性或低滴度。无症状HBsAg携带者或慢性活动性乙型肝炎均可有相同的HBsAg滴度变化不能代表病情的轻重，因此分解此不能将HBsAg滴度的变化作为判断病情轻重和药物治疗效的指标。,19,用免疫电镜及免疫荧光法在肝细胞浆内证实有HBsAg,而血清中HBsAg阴性，其机制尚无确切解释。已知原因之一是现用的RIA检测法，其测试灵敏度为10-5,尚不能测出最低感染量(10-7)，因此有10%假阴性，故对HBsAg的判断，以阳性有诊断意义，阴性不能排除HBV感染。近年发现血清中HBV标志均阴性，而在白细胞或肝细胞内检出HBV-DNA，说明确定或除外HBV感染不能单凭HBsAg是否阳性，应与其他标志结合判断。,20,HBsAg,持续时间急性自限性肝炎：血中HbsAg大多可持续1-6周，最长可达6个月内可消失慢性肝炎或慢性HBsAg携带者：可持续阳性。,21,抗原组成(二)-HBcAg,HBcAg为HBC复制指标.位于Dane颗粒核心部分和肝细胞核内，在血清中不易检出游离的HBcAg主要成分是蛋白质刺激机体产生抗-HBc(非保护性抗体)存在于受感染的肝细胞核内，有很强的免疫原性，在乙肝急性期、恢复期和HBsAg携带者中常可检出抗-HBc。除非HBVC基因序列出现极少数变异或感染者有免疫缺陷。抗-HBcIgM阳性提示急性期或慢性感染急性发作，抗HBcIgG出现较迟，但可保持多年或者终生。,22,（抗-HBs,出现时间：急性感染后期或HBsAg转阴后（数月才能检测出）.6-12月内逐步上升至高峰，可持续多年，但滴度会逐渐下降。抗-HBs为保护性抗体（中和抗体）其出现标志着HBV感染进入恢复期-HBs对相同HBsAg亚型的HBV再感染有免疫力，但对不同亚型的HBV保护力不完全。,23,抗原组成(三)-HBeAg,位于HBV的核心,是一种可溶性蛋白抗原HBeAg和Dane颗粒出现相平行，且与DNA多聚酶在血中的消长动态相符合血中HBeAg的出现可作为HBV复制及血清有感染性的指标.急性HBV感染时HBeAg的出现时间略晚于HBsAg，在病变极期后消失，如果HbeAg持续存在预示趋向慢性。大部分情况持续存在表示患者处于高感染低应答期。刺激机体产生抗-HBe。转换过程意味着由免疫耐受转换为免疫激活，此时常有病变活动的激化。抗-HBe能与受染肝细胞表面的e抗原结合,通过补体介导破坏受染的肝细胞,抗-HBe的出现是预后良好的征象。抗HBe阳转后，病毒复制处于静止状态，传染性降低。部分病人仍有病毒复制，肝炎活动，称为HBeAg阴性慢性肝炎。,24,HBVDNA,是病毒复制和有传染性最直接的证据,检测方法：斑点杂交法、PCR法近年用多聚酶链反应（PCR）这一体外DNA扩增技术，使灵敏度提高100倍以上（10FGfg/ml），可测出极微量的病毒。HBV-DNA-p是HBV核心所具有的DNA-p，在病毒复制过程中起逆转酶作用。DNA-p活性是表示HBV复缺点活力的重要指标。HBV-DNA及DNA-p检测有助于判断HBV感染者病毒复制程度及传染性大小，较灵敏评价抗病毒药物的疗效。,乙肝,25,抗原组成(四)-Pre-S抗原,位于HBV的外衣壳上，有两种刺激机体产生抗Pre-S1和抗Pre-S2，能阻断HBV与肝细胞受体结合，从而起到抵抗病毒的作用抗Pre-S1和抗Pre-S2的出现，表示病情好转，趋向痊愈,26,传染源,患者潜伏期急性期慢性期无症状HBsAg携带者,27,高,中等,低/不能检出,血液,精液,尿,血清,阴道分泌物,粪便,伤口渗出物,唾液,汗液,泪液,乳汁,各种体液中HBV的浓度,28,血源性传播输血、注射、外科和牙科手术、针刺等剃刀、牙刷和蚊虫叮咬等母婴垂直传播宫内传播分娩时微小皮损处传播产后母婴密切接触性传播,HBV传播途径,29,30,病原学诊断(一)-抗原抗体检测,项目：HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc以及抗-HBcIgM方法ELISA(enzyme-linkedimmunosorbentassay，最常用，定性)发光免疫分析(定量)反相间接血凝试验(少用),31,ELISA的基本原理,利用抗原和抗体特异性结合主要的试剂固相抗原或抗体酶标记的抗原或抗体酶的底物,32,ELISA的主要方法,间接法:测定抗-HBs夹心法：测定HBsAg和HBeAg竞争法：测定抗-HBc中和法：测定抗-HBe捕捉法：测定抗-HBcIgM,33,病原学诊断(二)核酸检测,核酸杂交探针PCR引物,34,各项HBV血清标志物的解释,HBsAgHBV感染的标志,可能是急性或慢性Anti-HBs既往感染自然免疫/接种疫苗产生Anti-HBcIgM急性HBV感染标志Anti-HBcIgG既往或慢性HBV感染HBeAg病毒复制活跃，具有高度传染性Anti-HBe慢性感染,病毒不再复制,低传染性HBV-DNA直接测定病毒复制状态，比HBeAg更准确；临床主要用于监测治疗反应,35,为什么要开展乙肝“两对半”定量检测,乙型病毒性肝炎是世界性的传染病，严重地威胁着人类的健康。我国是乙型病毒性肝炎高发病国家。据统计全世界无症状携带者（HBsAg携带者）超过2.8亿，我国占1亿以上，且多数无症状。所以乙肝的早期诊断对控制传染源、降低发病率及疾病的治疗均具有很重要的意义。酶标（ELISA）检测始于20世纪80年代中期，它对乙肝“两对半”定性测定在疾病的诊断，病情监测，疗效观察起到了一定的作用，但酶标检测HbsAg灵敏度较低，不能真正意义上定量测定血清中HbsAg含量。随着临床医学的发展，定性检测已经远远不能满足临床及患者的要求。化学发光免疫分析定量测定乙肝“两对半”大大弥补了酶标定性测定及灵敏度低的不足。,36,血清学检测的临床意义,HBsAg抗-HBsHBeAg抗-HBe抗-HBc临床意义,急性或慢性感染(大三阳),+,-,+,-,+,+,+,+,乙肝后期或慢性感染(小三阳),-,-,+,+,-,-,-,潜伏期或急性乙肝早期,-,-,+,+,+,痊愈或恢复期,有免疫力,-,-,-,-,-,+,+,+,-,-,痊愈,有免疫力,疫苗接种或曾经感染过,有免疫力,37,血清学检测的临床意义,HBsAg抗-HBsHBeAg抗-HBe抗-HBc临床意义,血清学检测的临床意义,血清学检测的临床意义,急性或慢性感染(传染性弱),+,-,-,-,+,-,+,+,急性乙肝恢复期或既往感染,-,-,-,-,-,-,+,急性窗口期或既往感染康复期,-,-,-,-,-,未感染过HBV,+,+,-,-,+,+,+,-,-,+,急性感染趋向恢复;慢性携带者,HBV感染已恢复,有免疫力,38,Symptoms,HBeAg,anti-HBe,Totalanti-HBc,IgManti-HBc,anti-HBs,HBsAg,0,4,8,12,16,20,24,28,32,36,52,100,AcuteHBVInfectionwithRecovery,TypicalSerologicCourse,WeeksafterExposure,Titre,39,IgManti-HBc,Totalanti-HBc,HBsAg,Acute(6months),HBeAg,Chronic(Years),anti-HBe,0,4,8,12,16,20,24,28,32,36,52,Years,WeeksafterExposure,Titre,ProgressiontoChronicHBVInfection,TypicalSerologicCourse,小结,40,乙肝五项检测的影响因素,1.样本采集与处理的影响1.1标本严溶血及混有红细胞的血清易沉淀或附着在聚乙烯孔内不易洗净，残留在孔内的血红蛋白具有过氧化物酶样的活性，催化底物显色造成假阳性，严重溶血标本禁用。1.2塑料试管能吸附抗原物质，样本久置在塑料管内会使样本内抗原含量下降造成假阴性。最好使用一次性玻璃试管或真空管采血管；并使用非抗凝标本，肝素抗凝血浆会增加OD值，可能与高浓度肝素具有强大的负电荷能吸附酶标记物不易洗脱有关；EDTA、酶抑制剂（如NaN3）可抑制ELISA系统中辣根过氧化物酶活性。1.3标本凝固不全，正常血液采集后1/22h开始凝固，1824h血块完全收缩。在工作中，有时为了争取时间快速检测，常在血液还未开始凝固时即强行离心分离血清，使血清中仍残留部分纤维蛋白原，在ELISA测定过程中可以形成肉眼可见的纤维蛋白块，易造成假阳性结果；因此血液标本采集后必须使其充分凝固后再分离血清，或标本采集时用带分离胶的采血管或于采血管中加入适当的促凝剂。,41,乙肝五项检测的影响因素,2、试剂的影响2.1乙肝两对半试剂厂家较多；不同厂家出产的试剂灵敏度与特异性存在一定的差别，有资料显示，不同厂家试剂的特异性和敏感性分别为89.4%99.3%,7889%存在较大差异。有的厂家酶标板孔间A值差大于15%；标记酶的活性及显色液的稳定比较差。使用质劣的试剂必然导致结果的假阳性或假阴性。因此。选择高质量的试剂是保证结果准确的关键之一。2.2不同方法学的检测试剂，会使两对半结果出现一些不同。例如：在实际工作中常用ELISA检测HBsAg结果为阴性，而电化学发光检测为阳性。除方法学的灵敏度外；还存在使用单抗或多克隆抗体试剂的差别。单抗对变异抗原或亚型乙肝标志物检测存在差异，建议试剂厂家对剂的制备应该考虑亚型及型浓度的问题。,42,乙肝五项检测的影响因素,3、干扰物质的影响有人认为大约40%的人血清标本中含有非特异性干扰物质，可以不同程度影响检测结果；常见的干扰物质有：类风湿因子、补体、嗜异性抗体、嗜靶抗原自身抗体、医源性诱导的抗鼠Ig抗体、交叉反应物质和其它物质等。如RF因子可与标记二抗的FC段法结合造成假阳性，补体从C1q活化，使一抗和酶标二抗的抗体分子发生变构，Fc的C1q分子结合点暴露出来，则补体C1q可将二者连接起来造成假阳性，采用5630分钟灭活补体可降低假阳性率，高浓度的AFP（如孕妇），在储存过程中可能形成二聚体会导致本底过深影响检测结果。,43,乙肝五项检测的影响因素,4、药物的影响4.1高效价的乙肝免疫球蛋白会与HBsAg形成复合物，影响HBsAg的检出，所以一些HBsAg阳性患者注射乙肝免疫球蛋白后，HBsAg检测会呈阴性反应，导致乙肝两对半少见模式的出现，如我们常遇到乙肝大三阳的孕妇，为阻断乙肝母婴垂直传播时，在孕第8、9、10月常规注射乙肝免疫球蛋白，不仅影响孕妇HBsAg的检出；而且其所生产的生新儿也常出现HBsAg阴性，HBeAg阳性和HBcAb阳性等少见模式、可能是乙肝免疫球蛋白属IgG抗体能通过胎盘进入胎儿体内与胎儿血液中的HBsAg结合形成复合物；则新生儿HBsAg检测呈阴性；用0.5ML的盐酸处理标本1小时可提高出率。4.2为预防乙肝，部分HBsAg阴性人群在接种乙肝疫苗后的12周内，血清中可检出HBsAg成份，形成一过性HBsAg阳性，这可能是乙肝疫苗主要成分是HBsAg.，有方法能够把它检出；如电化学发光法，建议接种乙肝疫苗后1个月内不应作HBsAg检测。,44,乙肝DNA检测的临床意义,HBV-DNA称为乙肝病毒脱氧核糖核酸。乙肝病毒是一种部分双链DNA病毒，也就是说它的遗传物质是DNA，它载有病毒所有遗传信息，乙肝病毒靠它才可以复制、增殖、繁衍后代。研究证明，乙肝病毒的裸DNA(没有蛋白质包裹DNA)就有感染性，完成对宿主的侵袭，造成宿主体内出现完整的乙肝病毒颗粒。也就是说HBV-DNA相当于完整的乙肝病毒颗粒。因此，检测HBV-DNA是判断乙肝病毒有无复制的“金指标”