（水生生物学专业论文）溶藻菌的溶藻物质分离与初步鉴定.pdf

所取得的研究成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或 集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在 文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。 作者签名： 际鄹己 日期：2 0 年罗月；j 7 日 学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解华中师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：研 究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属华中师范大学。学校有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许学位论文被查阅和借阅； 学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以允许采用影印、缩印或其它复制手 段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后遵守此规定) 保密论文注释：本学位论文属于保密，在年解密后适用本授权书。 非保密论文注释：本学位论文不属于保密范围，适用本授权书。 作者签名：际默 日期：年s 月1 日 导师挑讹版融耳 日期：垆f ，犁r 月7 日 f 本人已经认真阅读“c a l i s 高校学位论文全文数据库发布章程，同意将本人的 学位论文提交“c a l i s 高校学位论文全文数据库”中全文发布，并可按“章程”中的 规定享受相关权益。圄意途塞握銮卮溢厦；旦坐生i 旦= 生；旦三生筮查! 作者签名：j 陈耽 日期：少f f 年s 月弓7 日 孙张谢枝如备 日期：加j 1 年l r 月；7 日 j 硕士学位抡文 m a s t e r st h e s i s 摘要 面对当前严重的湖泊富营养化情况，研究者们开发了各种方法来控制、解决藻 类水华的发生。但是相对于物理、化学的方法的控藻的效果，生物控藻的方法是最 有前景的。 本实验室中通过喷雾干燥技术将放线菌a n 0 2 的发酵上清液制备成一种溶藻粉 剂。这种粉剂在云南滇池的现场小范围的试验中有着明显的溶藻效果。本实验过程 中，通过对粉剂的初步处理后进行液相色谱试验，旨在分离及鉴定出粉剂中的溶藻 活性物质。通过对液相条件进行优化，最终确定了液相条件：检测波长为1 9 8 r i m ， 色谱柱为a g i l e n t x d b c 1 8 ，5 u m ，4 6 x 2 5 0 m m ；水：甲醇= 8 5 ：1 5 ( v v ) ，流速为 0 4 m l m i n 。通过定时的收集馏分的方式，最终确定了7 - 8 r a i n 的馏分有明显的活性。 从7 - 8 m i n 馏分中收集到一单峰，分子量为6 4 5 2 。 在用粉剂处理d s 藻的过程中，发现藻出现沉淀、黄化死亡现象。将乙醇处理 后的粉剂上清，在溶藻活性较高的粉剂上清投加比例条件下( 1 ：5 0 ，1 ：1 0 0 ，1 ：2 0 0 ) 加到d s 藻中后，第1 天到第3 天藻细胞沉降明显，说明从第l 天到第3 天是藻发 生沉淀的关键时间段。在有明显溶藻活性的粉剂上清投加比例前提下，发现从第1 1 天开始，沉淀中的藻细胞数量明显减少，说明投加乙醇处理后a n 0 2 粉剂上清液后 的第1 1 天可能是沉淀中的藻细胞走向破坏死亡的一个关键时间点。 关键词：溶藻粉剂；活性物质；沉淀；黄化 a l g l c i d a le f f e c ta tl a k ed i a n , y u n n a n 1 1 l ea i mo ft h es t u d yi st oi s o l a t ea n di d e n t i f yt h e a c t i v es u b s t a n c e si nt h ep o w d e rb yp r e l i m i n a r yt r e a t m e n ta n dt h e nh p l c t 1 圮h p l c c o n d i t i o nh a sb e e ni d e n t i f i e db yo p t i m i z a t i o n n l ec h r o m a t o g r a mw a sd e t e c t e da tl9 8m n t h em o b i l e p h a s e i s w a t e r m e t h a n o li nr a t i o no f8 5 15 ( v v )w i t h a g l l e n t ) a d b - c18 ，5 u m ，4 6 x 2 5 0 m r n ；t h ef l o wr a t ei s0 4 m i n 1 1 1 ef r a c t i o no f7 8 m i nh a ss h o w e d l d 曲a l g i e i d a le f f e c tb yt i m e l a p s ec o l l e c t i o n f r o mt h ef r a c t i o no f7 - s t a i nia l s og r a n ta s i n g l ep e a ：kw i t ht h em o l e c u l a rw e i g h to f6 4 5 2 u s i n gp o w d e rt ot r e a td s w 色f i n dt h a td sh a ss w u mt ot h eb o t t o mb e f o r ei t b e c o m e sx a n t h i c i fw ea d dt h ep o w d e rs u p e r n a t a n tt r e a t e db ye t h a n o lt od sa tar a t i o n o fl l i 曲a c t i v i t y , w ec a r lf i n dt h a td sw i l ls i n kb e t w e e nm el 砒d a ya n dt h e3 甜d a y , t h i s s u g g e s t st h a tt h et i m ef r o mt h el 鲢d a yt ot h e3 酣d a yi sac r u c i a lj u n c t u r ef o rd st os i n kt o t h eb o t t o m o nt h ep r e m i s eo fh i g l le f f e c ta ts o m ep o w d e ra d d i t i o n a lr a t e ，w ef i n dt h a tt h e n u m b e ro ft h ea c t i v ed s a l g ah a sd e c r e a s es h a p e l ys i n c et h e11 m d a y n l i ss u g g e s t st h e 11 1d a ym a yb ea ni m p o r t a n tt i m ew h e nt h ep o w d e rs u p e m a t a n tt r e a t e db ye t h a n o lh a s b e e na d d e d k e yw o r d s ：a l g i c i d a lp o w d e r ；a c t i v es u b s t a n c e ；s i n k ；b e c o m ex a n t h i c 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 目录 摘要“”i a b s t r a c t 第一章文献综述 l 1 淡水藻形成水华的原因及其产生的危害l 1 1 淡水藻形成水华的原因“1 1 2 水华的危害2 2 现阶段治理水华的常用方法和手段3 2 1 物理的方法3 2 2 化学的方法”4 2 3 生物的方法4 2 4 治理水华的其他方法9 3 生物分泌的胞外产物的研究9 4 本文的研究目的、内容及意义l l 第二章w 6 号茵溶藻物质的初步研究一一一一1 2 1 材料与方法1 2 1 1 试验材料”1 2 1 2 方法13 1 3 叶绿素a 含量的测定”1 4 1 4 数据处理1 4 2 结果和分析1 4 2 1w 6 菌的乙醇沉淀试验1 4 2 2w 6 的乙酸乙酯萃取试验1 5 3 讨论1 5 第三章a n 0 2 粉剂溶藻物质的分离与鉴定一一一1 6 1 材料和方法1 6 1 1 试验材料1 6 1 2 实验流程及方法l7 1 3 数据处理”l8 3 讨论”3 7 参考文献 致谢 3 8 4 2 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 第一章 淡水藻形成水华的原因及其 1 1 淡水藻形成水华的原因 改革开放以来，随着社会经济的飞速发展，人类在生产生活中产生了大量的n ，p 等营养元素，这些营养元素由于人为及自然的原因排入淡水河流、湖泊中后会导致 藻类的大量繁殖，然后异养微生物通过代谢活动会使水体中的含氧量下降，水生动 植物大量死亡，水体颜色从澄清透明变浑浊，而且散发出各种刺鼻性气味，这种情 况发生在淡水中即形成了水华。一般认为当水体中的有机氮的含量达n o 3 m g l ，总 磷达n o 0 1 m g l ，b o d 含量达至l j l o m g l ，叶绿素a 的含量达n 1 0 u g l 时就认为水体 达到富营养水平i u 】。 当湖泊中产生水华时，最主要的藻来自蓝藻纲【3 】，还有少许的微囊藻，颤藻等。 在某些情况下，有的硅藻，甲藻和栅藻也能形成水华。 作为生态系统的一部分，水体同样与周围的环境通过能量流动与物质循环【4 】紧 密联系。通过生态系统的水循环过程，会将土壤中的有机物，如n ，p 等源源不断地 输入到湖泊，河流中，从而为各种淡水藻的生长提供了营养基质【5 】。同时，水生生 态系统中的分解者如各种微生物会将动植物的残体分解、矿化成无机物供藻类的生 长使用。所以如果条件合适，在自然环境中本来就有可能形成天然的水体富营养。 但是在没有人为干扰时，天然的水环境要形成富营养是一个十分慢长的过程，往往 甚至需要几个世纪才有可能。 但是工业革命以来，人们在生产生活过程中，将工业废水，生活废水，化肥农 药残留，畜牧排泄物等大量的排入水中，而这些排放物中都还含有大量的营养元素 有机物，水中的各种微生物通过代谢过程将有机营养物分解成多种无机盐，从而为 有害藻类的大量生长提供了丰富的基质，促进了水体形成富营养。同时当自然力的 侵蚀，风蚀等作用时营养盐也可被释放出来。 水华的发生与许多生态因子，如水流，温度、光照、含氧量、p h 等有着明显的 关系【6 j 。一般情况下，在水流慢的水体中，如内陆湖泊，池塘等区域更容易产生富 营养化。冬季时由于温度低，光照弱，藻类大多会沉到水体的底部，水体自然就不 会形成富营养。但夏天时温度高，光照强，藻类可以很好的利用光照，通过旺盛的 光合作用疯长，在很短的时间内就会产生非常严重的后果。此外，水体中的p h 值也 能够影响有害藻类水华的发生，水环境最容易发生水华的p h 值是中性。水体中的生 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 物的生命活动也会在很大程度上介入水中营养元素的循环、利用，有可能加速营养 物在水体中的浓度不断地加大。 1 2 水华的危害 水生生态系统是一个物种和物种之间，物种和环境之间相互作用，相互牵制的 动态的系统体系。在这个系统中，起始于初级生产者固定太阳能通过能量流动过程 和养分循环、水分循环等物质循环一直处于一种动态的、相对平衡的状态。而藻类 水华作为一种强烈的干扰因素对水生生态系统的结构、组成、功能等有非常明显的 影响。这些影响对水生生态系统的各种生物的不同性质和非生物环境作用明显，通 过量变到质变，最终造成水环境的变差，水生生态系统的动态平衡遭到破坏，水生 生物遗传多样性，物种多样性，生态系统多样性和景观多样性的降低。具体危害表 现为： ( 1 ) 水体会呈现出各种颜色，如绿色、红色、蓝色等，水会变浑浊。由于水 中的各种微生物细菌及藻在日常的代谢活动中会产生许多的杂质，这些杂质会影响 水体的感官性状1 7 j 。由于大量的藻漂浮在水面上，下面的水层得不到充足的光照， 造成水体的透明度降得很低。 ( 2 ) 当藻类死亡时，在分解这些残体过程中，水中的微生物会消耗大量水中 的氧气，使得水中的含氧量下降明显，最终形成缺氧，厌氧的水体环境。 ( 3 ) 水体中的厌氧微生物、淡水藻在新陈代谢过程中会分泌出各种气味物质， 使得水中散发出各种难闻的刺激性气味【8 一。 ( 4 ) 富营养化水体中的藻会产生各种藻毒素【1 0 , 1 1 , 1 2 ，这些藻毒素不仅会伤害水 生动物，而且可能对人类养殖的家禽、牛羊等和人类本身产生致病作用。藻毒素可 以在水生生物中富集，最后在人类体内浓度越来越高，使人类产生严重的疾病，甚 至造成人类的死亡。如p n 一甲氨基一l - 丙氨酸( b m a a ) ，被认为是神经退化性疾病 的重要环境因子，这类病有曾经在太平洋关岛发生过的a l s p d c ( 肌萎缩侧索硬化 一帕金森痴呆综合征) 。在大多数独立生活和共生生活的蓝藻种类中能检测到 b m a a ，如淡水，海水等。a i f e n gl i 1 3 】等在本研究中采用两种液相一质谱联用 ( l c e s i d 讧s ，l c e s i m s m s ) 的方法检测b m a a ，从中国蓝藻水华中检测到神 经毒素b k j t a 。水环境中，毒素的产生伴随着微生物生长的衰败，动物和藻类群落多 样性的减少和毒素在食物链中的积累。当前，有许多关于蓝藻毒素的研究都是关注 着它们对脊椎动物和人类健康的危害，但对藻类和细菌的影响研究甚少。r u t v a l d o r l l 4 通过观察毒素对水中藻类和细菌的影响来进一步证实了蓝藻的提取物会抑 制某些藻类和细菌生长，认为颤藻的提取物较念珠藻对藻类的抑制作用持续时间更 2 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 长，效果更显著 ( 5 ) 藻类的大量繁殖会污染日常饮用水的水源，使得过滤池大的效率下降， 危害人们的身体健康。2 0 0 7 年5 月，太湖突然爆发大规模的蓝藻水华，造成了将太 湖作为主要水源的无锡市民的饮用水危机，大批市民只能去超市购买瓶装水才能够 维持日常的生活，对人们的生产活动和社会稳定造成严重的影响。 ( 6 ) 破坏水产资源。造成渔业产量减岁1 5 】。其次水华藻类的大量异常繁殖， 会堵塞贝类的进水孔，出水孔；藻还能堵塞鱼类的呼吸器官，使得水生动物最后窒 息死亡。 总之，藻类水华已经成为了一种世界性、全球性的严重危害。在亚洲各国，如 中国、日本、韩国；欧洲如英、法、德，美洲如巴西、美国等世界的各个角落，在 夏季都会经常发生水华现象，对人类社会的生存与发展产生了极大的影响，必须想 办法解决。 2 现阶段治理水华的常用方法和手段 2 1 物理的方法 2 1 1 人工对水体的搅动 在自然的环境中，湖泊会有分层的现象。在冬季时，由于气温低，光照弱，水 体不容易形成分层。但是在夏季时，气温高，光照强，温度较高的水面非常适合藻 类的生长，而在水低的水温则较低，不适合藻类的生长。如果通过人为手段扰动水 体，例如通过大功率的空气泵，向水体中注入空气等可以打乱水体的分层，进而妨 碍水华的发生。 2 1 2 除去水体中的氮、磷 氮、磷等营养元素对藻类的生长至关重要，如果能够通过人工干预除去水中的 氮、磷就可以延缓淡水藻类的生长繁殖【1 6 】。如向水体中添加铝盐等化学絮凝剂，可 以借助于它们的絮凝沉淀作用将水体中的磷除去。当藻类缺少了生长元素时便不能 够正常的代谢，从而可以大大的减少水中的藻类。 2 1 3 杀菌杀藻过滤设备 当前已经有单位开发了一种通过过滤水体来净化水质的设备。该设备核心的结 构是波浪形光触媒网。在紫外灯的照射下，利用光触媒原理，在水中将光能转化为 化学能，形成催化作用，把水中的0 2 及h 2 0 转化为高氧化能力的自由负离子。这些 负离子能够分解水体中有害的有机物、无机物，最总完成杀菌杀藻。 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 2 1 4 透析原理控藻 即通过抽水设备将湖水抽到岸边，经过含硅藻土的净水设备除磷元素后，将净 化后的水再重新排回湖中。通过这个过程不仅可以减低水中的磷含量，而且可以增 强湖水的流动，最后降低水体中的藻的生物量及密度，使水体质量得到改善修复。 但是该方法只适用于小型池塘等水体的使用，无法用于大型水体。 2 1 5 仿生式蓝藻清除设备 南京地湖所研制出一种“仿生水面蓝藻的清除设备 ，在巢湖市水源地的水华 治理过程中取得了很好的效果。该设备根据鱼类通过口滤食藻类的原理，结合巢湖 地区的实际情况设计完成。该设备以一定的流量吸取湖水，通过第一次过滤除去水 中的藻体，然后将藻液经过二次过滤进一步浓缩为藻浆，用特制的收集袋将藻类储 存并进一步处理。 2 2 化学的方法 j a n ak v 7 l d e r o v a 【1 刀研究了2 5 m g l 链霉素和5 0 m g l 青霉素对两种广泛生长的赖 盐性藻俄克拉何马绿藻和杜氏藻的生长和光合作用的影响。测量了生长率，氧化率， 叶绿素荧光动力参数，结论是抗生素对俄克拉何马绿藻的作用较小，而对杜氏藻却 无明显作用【3 1 。a n n e t th e h m a n n 1 8 】等选用赖氨酸对蓝绿藻纲，硅藻，绿藻纲的1 8 种 藻进行了实验。只有微囊藻( 蓝绿藻) 对赖氨酸敏感；其他藻不受影响。当赖氨酸 的浓度为0 6 至5 0 i n g l 时，7 种微囊藻在4 8 小时后全部死亡。a h s c r a g g 等1 1 9 研究表 旺j a g n 0 3 能够抑制小球藻，绿藻v t 1 的生长。a 9 2 + l 蜞他金属更能抑制小球藻的生 长绿藻v t - 1 对氯酚有更强的赖受性，对a g n 0 3 更加敏感，在a g n 0 3 浓度为0 0 5m g l 时生长完全被抑制。 日常生活中常用硫酸铜来控制藻类水华。但是在使用硫酸铜时要注意一定要在 春季时使用，此时藻类还没有大量的繁殖，如果在夏季时使用该物质，当硫酸铜杀 死大量大的藻细胞后，各种微生物通过代谢作用将藻类分解时消耗大量的氧气，使 水体中的氧气含量降低，而且有的藻类可以释放出藻毒素，会造成鱼及其他水生动 物的大量死亡。 同时，化学控藻剂可能富集在水生生物中，通过食物链的放大作用对高营养级 的生物和人类造成更大的伤害。 2 3 生物的方法 物理、化学方法虽然能够对控制藻类水华有显著的作用，但是也存在着明显的 缺点。如花费大量的人力、物力，财力。对电力等消耗巨大，而且很多物理化学方 4 硕士学位论文 m a s t e r s t h e s i s 法只能起到暂时性抑制和初步处理的作用，对从根本上解决藻类水华作用不大，有 许多化学试剂在控藻的同时可能会形成二次的污染，对环境产生更大的危害。 基于物理、化学方法的诸多弊端，近年来许多学者都致力于开发用生物的方法 来预防，治理水华。生物本来就是生态系统中的组成成分网，对自然环境的影响较 小，生物方法相对于其他方法有许多的优点，诸如对藻类的作用明显，产生作用所 需的时间短，能够在一定范围内从根本上解决水华带来的危害。现在主要的生物的 杀藻的方法有： 2 3 1 利用水生动物的取食过程来控藻 王文委等【2 1 2 2 】利用鲢鱼来对富营养水体中的藻类进行一定的控制，而且产生了 不错的效果。众所周知，鲢鱼生活在水体的中层和上层摄取水生动物的排泄物， 但是以水中浮游的植物为主食。该鱼是一种经济价值较高的水产鱼类。该鱼进食的 方式很特别有特殊的结构能够阻止水中的藻随水流滤出自身体外，从而藻类也成 了该鱼的取食对象。甚至，在某些水生浮游的植物量很少的水体中该鱼能够主要 取食沉积物中的藻屑为生。 总之，上述的技术就是根据了鲢鱼爱吃水体中藻类的日常活动习惯能够对易 生长藻类的池塘、水流慢的湖泊、大型水库等区域实施水华藻类的现场去除，而且 同时可以提高鲢鱼的产量增加当地的经济收入。实施过程中，应将鱼根据实际情况 投加到含藻的水体中，通过一段时间的作用，最终能够有效地控制藻在水体中的生 物量和密度，使水体的质量得到提高，恢复水体的生态平衡。 2 3 2 某些植物提取物或分泌物的杀藻活性 有些植物在长期的进化，演化的过程中为了能够生存下来，会产生一些分泌物 及体内产物，可以对周围的植物产生抑制作用，从而可以更好的利用资源，空间， 不断地增加种群数量和分布范围。同时有的植物为了防止自身被草食动物过多的取 食，导致最终灭绝，在体内和体表会产生有毒或是有刺激作用的物质，从而防止了 被动物的过多取食，调节了种群数型2 3 1 。通过研究，近年来发现有的植物的某些分 泌物或体内物质对藻类有抑制作用，可以作为一种潜在的控藻，杀藻试剂。 m y u n g h w a np a r k 2 4 】等做了稻壳提取物对铜绿微囊藻，两种绿藻( 卷曲纤维藻，四 尾栅裂藻) 和浮游动物( 大型蚤) 的抑制作用。在四个不同浓度的稻壳提取物( 1 ，1 0 ， 1 0 0 和1 0 0 0g l ) 下，通过测量藻的生长量及浮游动物的存活率来衡量抑制活性强 弱。结果显示对微囊藻的活性最强( 平均值：9 8 ，范围：9 5 9 9 ) ，大型蚤为( 平 均值：2 2 ，范围：1 0 - 4 7 ) ，卷曲纤维藻为( 平均值：2 0 ，范围：1 6 0 o - 2 4 ) ，四 尾栅裂藻为( 平均值：8 ，范围：0 0 o - 1 5 ) 稻壳提取物对绿藻和大型藻只有很弱的 5 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 活性，特别是在浓度为1 1 0 0 9 l 时。本研究表明对铜绿微囊藻有强烈的溶藻活性。 c h u n g 2 5 】等鉴定出九种化感化合物，包括从三种水稻品种的稻壳中提取的水杨 酸。这些化合物对杂草显示出异种克生作用。九种酚类化合物中水杨酸对铜绿微囊 藻的抑制活性最强。而且，稻壳中的化感物质p 一谷甾醇_ b d 一配糖物对铜绿微囊藻 有很强的抑制活性。然而，不是对所有的被测藻种都有活性。d a n i e le t e d i z z i l 凋 等研究表明麦秆提取物对沟鞭藻，红色裸甲藻，矮盐千屈菜有抑制作用；对条纹环 沟藻，微小原甲藻，海洋原甲藻有促进作用；而对叉角藻，多甲藻没有影响。 f e n g m i nl i 和h o n g y i n gh u 2 7 】从禾本科植物芦苇中分离得到了抑菌化感物 质。分离出的化感物质表现出对蛋白核小球藻和铜绿微囊藻有抑藻活性，但是对小 球藻没有抑制活性。化感物质对蛋白核小球藻和铜绿微囊藻的e c 5 0 分别为0 4 9 和 0 7 9 m g l ，该物质的活性具有种问专一性。通过核磁共振和气质色谱鉴定该化感物 质为乙酰醋酸甲酯。合成的乙酰醋酸甲酯对蛋白核小球藻和铜绿微囊藻有化感活 性。e c s o 分别为0 4 9 和0 6 5m g l 。 2 3 3 微生物的控藻、杀藻活性 当前关于微生物对藻作用的研究很多，主要分为以下几类： 2 3 3 1 以藻类为宿主的藻类病毒 藻类病毒是一类能够入侵藻类的病毒。按照病毒的宿主差异性，可以分为两类： 原核藻类病毒和真核藻类病毒。噬藻病毒可以按照宿主形态分为单细胞噬藻病毒和 丝状噬藻病毒，两者之间的侵入、复制、表达方式有着显著的不同。1 9 6 3 年s a f f e r m a n 等阑首先发现了裂解蓝藻的l p p 型原核藻类病毒。张维娟【2 9 】研究发现，小球藻病毒 p b c v - 1 能够降解小球藻的细胞壁，而参加该病毒溶藻活性的酶包括壳聚糖酶、几丁 质酶等。在这些酶中，壳聚糖酶的溶藻活性强弱与它自身活力高低并不成明显的正 相关。 2 3 3 2 有溶藻活性的放线菌 在细菌中有一类特殊的群体叫做放线菌，均为革兰氏阳性茵。放线菌在自然界 中分布的很广泛。放线菌可以从水中、土壤中分离得到，这类菌可以产生各种酶类， 抗生素，维生素等【3 0 】。放线菌产生的产物有的具有溶藻活性，能够作为一种控藻方 法。当前已经有很多研究表明，具有溶藻活性的放线菌大多数属于链霉菌属【3 l 】。y 0 k 0 y a m a m o t o 3 2 】在一个富营养湖泊湖底分离的8 3 株放线菌，大约有一半有溶藻活性。 其中鉴定出一种溶蓝藻放线菌命名为s 9 ，鉴定为生暗链霉菌属，在含有蓝藻的平板 上生长良好，而且能迅速的杀死蓝藻细胞。该菌分泌的l 一赖氨酸可以杀藻。电子显 微镜下观察l 一赖氨酸可以破坏藻的细胞壁。崔妍等【3 3 】从海滩土壤里分离到一株对鱼 6 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 腥藻有抑制活性的灰霉素链霉菌，通过实验确定该茵溶藻活性物质是脂溶性的。 w h y t e 等【3 4 】在土壤中发现一株不产色链霉菌可杀死鱼腥藻。梁锏文等【3 5 】分离到一株 弗氏链霉菌，发现该菌体本身及菌的胞外分泌物都对铜绿微囊藻有抑制活性。 2 3 3 3 有溶藻活性的细菌 溶藻菌的溶藻方式主要有以下几种：菌外产物，接触破坏杀藻，进入藻细胞的 内部破坏结构杀藻。 溶藻细菌是这样的一大类细菌，它们能够通过直接、间接手段来阻碍水华藻正 常的生长，或是可以溶解藻细胞，直至杀死藻细胞。早在上个世纪的2 0 年代就有了 最早的杀藻细菌的报道。这是一种黏细菌属( m y x o b a c t e r ) ，能够寄生于刚毛藻 体表，一段时间后将藻溶解杀死【2 l 】。当前已经有很多报道分离出了各种溶藻细菌， 主要包括从水中，土壤中分离得到。 最重要是方式是通过分泌菌外产物来杀藻。常见的有分泌多肽的 3 6 , 3 7 ，分泌 蛋白的【3 8 3 9 1 。m ur u i i i l i n 【4 0 】从活性污泥中分离出了一株溶藻细菌b 5 ，通过1 6 s r d n a 鉴定和生理生化特征，其属于纺锤芽孢杆菌。实验中藻种为铜绿微囊藻，绿藻和斜 生栅藻。结果表明，起始的菌液浓度和藻细胞浓度影响溶藻活性。起始菌浓度越大， 藻叶绿素含量降低的越快；起始藻细胞浓度越大，藻叶绿素含量降低的越慢。当菌 细胞浓度达到3 6 x 1 0 7 个m l ，叶绿素含量几乎可以降低9 0 。b 5 是通过释放代谢物 进行溶藻，而且这种代谢物是热稳定的。 生物表面活性剂已经被认为是一种控制有害藻类的一种方法，但是更多深入的 证据还在调查中。s g u s t a f s s o n l 4 l 】研究了一种产生于绿脓杆菌的生物表面活性剂，作 用于5 种海洋藻和一些以前没有被测试过的淡水藻。包括海洋生态系统中的微小亚 历山大藻，甲藻，硅藻。淡水中的扁形膝口藻和铜绿微囊藻。该实验检测了生物表 面活性剂的致死和亚致死浓度。除此之外，其对水蚤的作用也进行了测试。结论表 明在低浓度( 5 u g m l ) 的生物表面活性剂可以降低光合效率和细胞的活力，测试 的4 种有害藻中，高浓度( 5 0 u g m l ) 的生物表面活性剂有致死作用。该研究表明了 生物表面活性剂可以在水华还未造成负面效应时用于提前预防，在必要时还可以起 到杀藻作用。k h b a k e r 【4 2 】等报道了一种假单胞细菌，这种菌可以释放出一种可以 溶解硅藻的高分子量的化合物。c h i y o n g a h n 4 3 】发现枯草芽孢杆菌c 1 可以分泌出枯 草菌脂肽，当枯草菌脂肽浓度达至u l o m g l 时可以完全地抑制微囊藻的生长。可以在 2 天内杀死8 5 的微囊藻( 叶绿素a1 0 0 0 u g l ) ，且加入l m mc a 2 + 后可以提高去除率。 鱼腥藻也可被去除7 0 ，但是对硅藻却没有作用。t a k u j in a k a s h i m a l 4 4 在一株海洋细 菌y - p r o t e o b a c t e r i u m q 】发现抑制赤潮的溶藻物质。j o h npb 等分离到一株有溶藻活性 7 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 的交替假单胞菌y 研究表明其对有害的水华藻( g y m n o d i n i u m , c h a t t o n e l l a , 月a 纪弦占匆托) 有较强的溶藻活性【4 5 1 。y o u n g k il e e 等【4 6 】从所有培养的微囊藻中都能够 分离出一株脱硫细菌k w r 2 包括加入2 ( v v ) 该菌的上清到四种铜绿微囊藻和多变 鱼腥藻中后，5 天后，溶藻效果可达7 5 8 8 。但是对真核藻类如小球藻和栅藻没有 抑制活性。k w r 2 的胞外产物对蓝藻的抑制活性达到9 4 ，分子量小于8k d a 。h o n g z h a n g 等a 7 】从巢湖中分离出一株名n q c h 2 2 的恶臭假单胞菌，这株菌对铜绿微囊藻有 溶藻活性，当加入1 5 ( v ) 该菌的上清到藻中后，7 天后9 8 8 的藻死亡。该菌可能 能够抑制藻的光合作用，而且是通过释放胞外产物来溶藻，对藻有广谱的活性。以 上的结果表明富营养湖泊中的土著微生物维持着浮游植物和细菌之间的生态平衡， 因此能够减少蓝藻水华的发生。 通过直接接触破坏的方式杀藻1 2 i j ； 进入藻细胞的内部破坏结构杀藻，这种情况不常见。c a i o l a 在铜绿微囊藻体 内分离出了一株与蛙弧菌相似的细菌【3 l 】，这种菌向外可以分泌外毒素，这种毒素可 以使得藻细胞壁的某些特定位点溶解，此时细菌在细菌表面可以形成一种类似于 “桥”构造，细菌能够穿过“桥径直达到藻细胞壁的某个位点，最后进入到藻体 内部，将藻细胞破坏，达到溶藻效果。 2 3 3 4 有溶藻活性的真菌 真菌是一项丰富且广泛存在的自然资源，某些代谢物在工业上有广泛用途，如 柠檬酸、酶制剂、抗生素等。本实验室已经从土壤中分离到一株具有杀藻活性的真 菌j 2 0 ，该真菌为青霉属( p e n i c i l i i u m ) 。实验表明该菌株分泌的胞外产物可以杀死铜 绿微囊藻d s ，溶藻物质有一定的热稳性的非蛋白物质。将该菌的发酵上清液在投加 比例为1 ：1 0 0 时，到第3 天试验组比对照中叶绿素a 含量下降8 2 。 2 3 3 5 藻对其他藻的抑制作用 自然环境中，有的藻类能够抑制、杀死其他的藻，通过这种方式有可能找到一 条抑制有害水华藻的新途径。j i u n n t z o n g w u 4 8 】发现多甲藻能分泌出对铜绿微囊藻 有溶藻活性的物质。这篇文章中研究了多甲藻水相提取物的溶藻活性。对多甲藻的 提取物处理后，铜绿微囊藻的光谱吸收值变化巨大，特别是在5 0 0 6 5 0 和4 2 0 - 4 6 0n m 。 吸收值增加的原因是藻胆素，藻青蛋白及异构体。然而，没有检测到叶绿素。藻胆 素有短期活性，在接入1 小时后就有活性。接入多甲藻的提取物后铜绿微囊藻中的 质膜和类囊体膜被破坏，此文推测多甲藻的提取物作用于细胞膜，破坏了膜的渗透 性，破坏藻胆素的完整性，但不破坏类囊体膜的叶绿素。i n e ss c h l e g e l 等一j 从全球 各地分离出了1 9 8 株蓝藻，从中筛选出对绿藻中空星藻，栅藻，单壳缝藻有抗菌活 8 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 性的种类，发现了1 0 株费氏藻，7 株念珠藻和3 株丝状蓝藻产生有广谱活性的化合物。 而且测试了2 0 种藻对其他蓝藻的活性，包括桶形鱼腥蓝藻，这种藻能在光照和黑暗 条件下都生长的很好；至少一种费氏藻对绿藻叶绿体的光合作用电子传递有直接的 活性，然而，其他的藻没有直接活性。 2 4 治理水华的其他方法 有研究者开发出了一种新颖的杀藻控藻方法。即利用刚毛藻，草鱼、透明潘等 水生生物的相互协调，共同作用来杀藻。这个研究的初衷是为了解决当前的杀藻技 术存在的成本高、易造成二次污染、副产物多的问题。这个方法首先是将一定体重 草鱼放在富营养化的水体中饲养，然后再把自浮式网格投入水体中，自浮式网格的 孔径是4 m m 。通过这个设备能够有效下降水体中的含藻量，缓解水体的营养水平， 并且节约了人力、物力、财力，提高了水体的质量。这个研究很好地利用了各种生 物不同的取食习惯，和当前的水华治理方法相比，这个方法有着结构简单，管理、 运行成本低，控藻效率高等优势。 现在又出现了运用现代生物技术来解决水环境问题的趋势，即通过基因工程， 细胞工程，发酵工程，酶工程手段来解决藻类水华问题，如通过基因工程茵，生物 强化技术，生物驯化技术，生物活液，细胞固定化，酶固定化等方法来处理水华。 同时，现在还出现了运用多种手段结合运用，将各种工序、设备串联起来来解决藻 类水华的方法。 生物分泌的胞外产物的研究 张涵之等【5 0 】在对溶藻细菌l 7 所分泌的溶藻活性物质进行分离和纯化后，通过 一系列的分析手段对该活性物质进行了初步鉴定结果表明，质谱分析出第1 2 # 组分 中的5 种物质分子量分别为2 4 3 7 ，3 6 4 0 ，5 0 8 1 ，6 0 2 1 ，6 7 8 7 。紫外光谱扫描分析出溶 藻细菌l 7 溶藻活性代谢产物可能含有2 个共轭的不饱和键红外光谱扫描和薄层层 析特征显色结果显示，其可能含有芳香醛类、氨基酸类、醇类或糖类物质，但一定不 含有酚类物质。 s u n - o gl e e 【3 9 j 等研究发现海洋细菌假交替单胞菌菌株a 2 8 能够杀死硅藻中肋骨 条藻n i e s 3 2 4 。通过试验表明假交替单胞菌株a 2 8 产生的溶藻活性物质为胞外丝 氨酸蛋白酶。 m o c h a m m a da m i na l a m s j a h t 5 l 】等发现裂片石莼的溶藻化合物，显示溶藻物质是 多不饱和脂肪酸，十六烷一4 ，7 ，1 0 ，1 3 一四亚乙基四胺酸( h d t a ) c 1 6 ：4n 3 ，十八烷 9 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 一6 , 9 ，1 2 ，1 5 一四亚乙基四胺酸( o d t a ) c 1 8 ：4n - 3 ，a 一亚麻酸( a l a ) c 1 8 ：3n 3 和亚油酸 ( l a ) c 1 8 ：2n - 6 。结果显示，溶藻效果好的物种，裂片石莼和孔石莼h d t a 和o d t a 的含量较高。同时也分析了从培养基培养的海藻中浓缩的这些不饱和脂肪酸。发现 这些不饱和脂肪酸对卡盾氏藻、海洋卡盾藻、微小塔玛亚历山大藻、异弯藻，米氏 凯伦藻有显著的溶藻活性，对环状异甲藻，微小原甲藻，反曲原甲藻，锥状斯氏藻 有一些的溶藻活性，而对链状亚历山大藻和多环旋沟藻溶藻活性很低。 u c h i d a 等【5 2 j 本试验中通过反相色谱，薄层层析等手段从海月水母的分泌物中分 离出了一种溶藻物质。通过质谱的鉴定及同e p a 商品的对比和在薄层层析中脂肪酸 的时值确定该溶藻物质为二十五碳烯酸( e p a ) 。 d a k h a m a 等发现一株铜绿假单胞菌能产生一种对试验蓝藻、绿藻有强烈抑制作 用的胞外物质。该杀藻物质在4 c ，黑暗条件下，在琼脂中放置3 个月还有溶藻活性。 铜绿假单胞菌可以释放出许多的抗生素，例如不同的糖脂类，吩嗪色素等。试验结 果显示该菌通过产生琼脂扩散性的吩嗪色素对试验藻类产生抑制活性【5 3 】。 b a n i n 等拉4 j 发现珊瑚褪色弧菌能合成及分泌一种胞外肽毒素p ，能够抑制珊瑚的 共生的虫黄藻的光合作用。甘油能够抑制毒素p 的产生。毒素p 为十二肽 p y p v y a p p p w p 。在n i - h c l 含量为1 2 5 m m 时，毒素p ( 1 0 u m ) 在5 m i n 内使l m l 虫 黄藻( 5 x 1 0 6 个m e ) 的光合产量减少6 4 ，抑制程度与毒素p 的含量成正比。在 n h 4 c l 和毒素p 同时存在情况下，溶液的p h 值迅速从7 8 降到7 2 ，表明毒素p 能促进 n h 3 进入细胞。已有报道表明n h 3 进入细胞后能破坏p h 梯度并且阻断光合作用。 k a w a n o 等在柄细菌中的p k 6 5 4 菌中分离得到一种抗生素，名n q t h i o t r o p o c i n 。这 种物质能够明显的控制试验中的赤潮异湾藻和中骨条藻【5 5 l 。 y o s h i k a w a 等t 5 6 j 分离出了一株有蓝藻杀藻活性的细菌c 0 7 9 ，该菌为海洋弧菌属， 通过一系列的分离手段确定了纯化的有溶藻活性的强亲水性胞外产物物为s g 基l 丙氨酸( l c n a i a ) 。 k o d a n i 等从不忍池和护城河的表层水( 日本东京) ，分离至l j l 2 株溶藻细菌菌株。 通过分析1 6 s r d n a 序列，其中有9 株为属于假单胞菌属。利用纸盘法，假单胞杆菌 k 4 4 1 的甲醇提取物表现出抑藻活性。采用硅胶柱色谱和高效液相色谱法( 肿l c ) ， 从假单胞杆菌k 4 4 1 的培养液的乙酸乙酯提取物中分离出哈尔满碱( 1 甲基咔啉) 。 哈尔满碱表现出对一些蓝藻的溶藻活性【5 7 1 。 s e o n g y u nj e o n g 等i 3 6 j 从有很高溶藻活性的芽孢杆菌s y - l 中分离鉴定出溶藻物 质b a c i l l a m i d e ，借助二维n m r 技术表明溶藻物质的结构为一种多肽化合物，其最大 吸收峰在2 7 9n l n ，实验表明这种多肽能够明显抑制多环旋沟藻。 1 0 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 4 本文的研究目的、内容及意义 本实验通过喷粉干燥工艺将一株放线茵a n 0 2 的发酵上清液制备成了一种高效 的杀藻粉末，这种粉末在滇池现场试验中发挥了很好的效果，对于控制水华的发生 起到了一定的作用。当前，国外对于溶藻菌溶藻物质的鉴定报道较少，国内的报道 更是凤毛麟角。造成这种情况的主要原因一是菌液上清中溶藻物质含量未知，不便 于收集及进行进一步的分离鉴定试验；二是溶藻物质的活性具有一定的时效性，将 菌液上清放置一定的时间后，溶藻活性会迅速地下降；三是做溶藻活性物质鉴定工 作需要用到诸如气相色谱、液相色谱，质谱，核磁共振等高级的仪器设备；四是需 要掌握微生物、无机化学、有机化学、分析化学、质谱学等多种知识。 在做溶藻物质鉴定试验过程中，将a n 0 2 粉剂的处理液加到铜绿微囊藻d s 中 后，一段时间后发现藻类有先沉淀后黄化死亡的现象，通过实验确定了产生沉淀及 发生黄化的初步时间。通过这个实验为确定藻沉淀和黄化的关键时间点，对暂时性 控藻及从根本上杀藻有着重要的意义。 本文中进行的a n 0 2 粉剂活性物质鉴定避免了用直接用菌液上清做鉴定工作的 不便之处。因为粉剂可以长时间的保存于室温，而且单位体积内的溶藻物质含量可 以通过浓缩等手段得到极大的提高，便于溶藻测试试验的开展。实验过程中借助于 高效液相色谱，通过分段收集的手段得到了一分钟有溶藻活性的液相色谱馏分。通 过这个实验已经将溶藻物质锁定在很少的几个峰内，为以后最终分离、鉴定出具有 溶藻活性的单峰奠定了基础。 单蒸水 1 0 0 0 0 m l 1 2 将上步处理后的上清于6 0 通过旋转蒸发仪浓缩至3 0 m l ，将该3 0 m l 的液体 倒入三角瓶中，再次加入9 0 m l 的无水乙醇，手摇震荡片刻后室温静置1 0 m i n ；1 0 m i n 后将该混合液5 0 0 0 r r a i n 离心10 r a i n ，分别收集离心后的上清和沉淀。 将上步在重复一次，最后将3 次收集到的上清用旋转蒸发仪于6 0 蒸干，加入 3 0 m l 的灭菌b g l1 定容，记为溶解相；3 次收集到的沉淀于6 0 的烘箱烘干后同 样加入3 0 m l 灭菌b g ll ，搅拌使沉淀完全溶解，记为沉淀相。 溶藻试验过程如下：将w 6 的发酵液离心后的上清、溶解相、沉淀相分别按照 1 ：1 0 0 ( v ) 的比例加到1 0 0 m l 的d s 藻中。 1 0 0 m l 藻液作为对照。以上各个实验组设3 个平行，恒温的光照培养箱中放置 上有机相和水相分别用旋转蒸发仪于6 0 蒸干，分别加入3 0 m l 的灭菌b g ll 定容， 最后分别记为水相及有机相。 溶藻试验过程如下：将w 6 的发酵液离心后的上清、溶解相、沉淀相分别按照