（动物学专业论文）一种海洋游仆虫细胞皮层及微管类骨架的研究.pdf

一种海洋游仆虫细胞皮层及微管类骨架的研究 专业：动物学 研究方向：细胞与分子生物学 导师：顾福康教授 硕士研究生：牛延宁 中文摘要 游仆虫类原生动物是腹毛目纤毛虫中一类皮层及核器分化较为特殊的类群， 其细胞纤毛器形成额腹棘毛一横棘毛一尾棘毛及背触毛等腹、背面纤毛结构。细 胞形成一巨大的大核和一圆球形的小核，此外细胞含有复杂的如前纵、后纵微管 束、横微管束等微管胞器，显示出了细胞结构最复杂的单细胞真核生物的典型特 征。目前，游仆类纤毛虫已受到各个领域的研究者的关注，对游仆虫细胞形态、 形态建成及其生理功能等方面的研究日益深入，研究水平已经从细胞水平发展到 亚细胞和分子水平。但是所得结果主要来自淡水游仆虫，对海水游仆虫的资料则 十分欠缺，有鉴于此，本研究以一种海水游仆虫为材料，对细胞形态结构及细胞 膜蛋白进行了研究，并与一种淡水游仆虫进行了比较。 ( 1 ) 细胞表面、皮层及细胞质的超微结构 应用扫描电镜和透射电镜技术，观察到海水游仆虫细胞表面、皮层及细胞质 的超微结构特征与报道的许多淡水游仆虫不同，其中：腹面纤毛器为1 0 5 - 5 模 式，背触毛8 9 列；表膜内存在按一定间隔分布的电子着色极深的轴杆样结构， 其功能尚须探讨；未观察到伸缩泡孔，但腹面最右一根额腹棘毛下存在一小孔， 推测可能与渗透压的调节有关。纤毛区纤毛杆内微管结构为典型的“9 + 2 ”模式， 毛基体外同样有围棘纤维篮存在。细胞质内含细胞核、线粒体及围绕基体的囊泡 状结构等细胞器。囊泡状结构可能也参与细胞内渗透压的调节。此外，对该海水 游仆虫超微结构的观察如背、腹面银线网格，背、腹表膜下微管的排列方式及走 向，纤毛器及非纤毛器微管骨架的分布等等，还有待进一步深入。 ( 2 ) 纤毛器微管胞器的形态发生、皮层微管类细胞骨架的观察 利用荧光紫杉醇直接荧光和抗n 微管蛋白抗体免疫荧光标记方法，跟踪标 记了海水游仆虫在无性生殖时期的纤毛器微管胞器的发生、迁移、定位的过程并 观察了其非分裂期皮层微管类细胞骨架。在无性生殖时期，细胞腹面棘毛从产生 原基到新纤毛器成熟直至迁移定位的一系列过程似乎都与老纤毛器有着密切联 系：新口纤毛器发生于老口纤毛器下方皮层内，从上至下逐渐组装成围口小膜： 额腹棘毛原基发生于老额腹棘毛与横棘毛之间，其中9 根来源于3 3 3 3 2 模式， 第1 0 根单独发生于口围带右侧。背触毛及尾棘毛的发生可能是在老背触毛的指 导下完成的。老背触毛可能起了模板的作用。在非分裂期，海水游仆虫皮层微管 类细胞骨架与一种淡水游仆虫相比，具有口围带小膜托架呈棍棒状，额腹棘毛区 微管束分化程度较低，放射微管束较多，腹部脊内具有横向微管束及背面主要为 横向微管束等特点，而淡水游仆虫则具有口围带小膜托架呈薄片状，额腹棘毛区 微管束分化程度较高，背面主要是纵向微管柬等特点。这些结果对游仆虫皮层细 胞骨架系统的形态、形态建成以及成分提供了补充性资料。 ( 3 ) 细胞膜蛋白的成分分析 由于研究材料的生活环境较为特殊且国内外对于游仆虫膜蛋白的研究资料 较少，因此比较了在不同生活环境下海水游仆虫和一种淡水游l p 虫膜蛋白成分的 差异。根据膜蛋白具有疏水性可以溶于非离子去垢剂中的特性，采用非离子去垢 剂抽提分级分离法提取膜蛋白，进而进行电泳分析。结果表明：两种游仆虫在 1 2 3 k d 、7 7 5 k d 和5 2 k d 具有相同的条带，但含量有差异，推测这3 种蛋白在 淡水和海水游仆虫中不存在种特异性：海水游仆虫具有1 0 2 k d 、6 3 k d 、4 3 k d 等条带，淡水游仆虫具有9 9 5 k d 、2 9 k d 、2 7 k d 等条带，这些差异可能与两种 游仆虫的不同生活环境有关。 关键词：游仆虫超微结构皮层纤毛器荧光紫杉醇抗n 微管蛋白抗体微 管胞器膜蛋白 s t u d i e so nt h ec o r t e xa n dm i c r o t u b u l ec y t o s k e l e t o n i nm a r i n e e u p l o t e ss p m a j o r ：z o o l o g y s p e c i a l i t y ：c e l la n dm o l e c u l a rb i o l o g y d i r e c t o r ：p r o f f u k a n gg u g r a d u a t e ：y a n n i n gn i u e u p l o t e si so n es p e c i a ls p e c i e so nt h ed i f f e r e n t i a t i o no ft h ec o r t e x a n dn u c l e u si nh y p o t r i c h o u sc f l i a t e s p r o t o z o a n c e l lc i l i a t u r e si n c l u d e f r o n t - v e n t r a lc i r r i ，t r a n s v e r s ec i r r i ，c a u d a lc i r r ia n dd o r s a lk i n e t i c s ，e t c t h e r ea r eo n em a c r o n u c l e u sa n do n eg l o b o s em i c r o n u c l e u si nc e l l m o r e o v e r , t h e c e l lh a st h ec o m p l e xm i c r o t u b u l a ro r g a n e l l e sw h i c hd i s p l a y t h et y p i c a lc h a r a c t e r i s t i c so ft h es i n g l e - c e l l e d e u c a r y o t ea tp r e s e n tt h e s c i e n t i s t si nm a n yf i e l d sa r ef o c u so ne u p l o t e s w i t ht h ed e v e l o p m e n to f l i f es c i e n c e sa n de x p e r i m e n t a lt e c h n i q u e st h es t u d i e sh a v ef o c u s e do nt h e f i e l d so fm o l e c u l a ra n du l t r a s t r u c t u r ea b o u tt h ec e l l m o d a l i t y , m o r p h o g e n e s i sa n dp h y s i o l o g i c a lf u n c t i o n s b u tt h ec o n c l u s i o n sm a i n l y c o m ef r o mf r e s h w a t e re u p l o t e s t h ei n f o r m a t i o nf r o mt h em a r i n e e u p l o t e si sl a c k i n g t h e r e f o r e ，w es t u d i e do n em a r i n ee u p l o t e ss p i nc e l l m o r p h o l o g ya n dm e m b r a n ep r o t e i n sa n dc o m p a r e di tw i t ho n ef r e s h w a t e r e u p l o t e ss p ( 1 ) u l t r a s t r u c t u r eo fe e l ls u r f a c e c o r t e xa n dc y t o p l a s m b y m e a n so f s c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p ya n d t r a n s m i s s i o n e l e c t r o nm i c r o s c o p y , i tw a ss h o w nt h a tt h ef e a t u r e so fe e l ls u r f a c e c o r t e x a n dc y t o p l a s m 1 m i ss p e c i e si sd i f f e r e n tf r o mo t h e rs p e c i e so ff r e s h w a t e r e u p l o t e sw h i c hh a v eb e e nr e p o r t e d i th a s1 0f r o n t a l v e n t r a lc i r r i 5 t r a n s v e r s ec i r r i ，a n d5 c a u d a ic i r r i ；8 9d o r s a lk i n e t i e s ，e t c t h e r ew a s r o d s h a p e ds t r u c t u r ei np e l l i c l ew h i c ht h ef u n c t i o nm u s tc o n t i n u et ob e c o n s i d e r e d c o n t r a c t i l ev a c u o l ep o r eh a dn o tb e e no b s e r v e db u tt h e r ew a s o n es m a l lp o r eu n d e rt h er i g h tf r o n t a l v e n t r a lc i r r u m i ti ss u p p o s e d l yt h a t t h ep o r ec a n r e g u l a t et h eo s m o t i cp r e s s u r eo ft h ec e l l c i l i aa r ec o m p o s e d o fn i n et r i p l e tm i c r o t u b u l e sa n dt w oc e n t r a lm i c r o t u b u l e s f i b r i l l a rc i r r a l b a s k e ti sa r o u n dt h eb a s a lb o d i e s n u c l e i ，m i t o c h o n d r i o na n dc o r t i c a l a m p u l ea r ei nc y t o p l a s m i ti ss u p p o s e d l yt h a tc o r t i c a la m p u l ea r er e l a t e d t ot h er e g u l a t i o no ft h eo s m o t i cp r e s s u r e t h eo b s e r v a t i o n sa b o u tt h e u l t r a t m c t u r e ，s i l v e r l i n es y s t e ma n da r r a n g e m e n to fm i c r o t u b u l e sw i l l c o m eu n d e rr e s e a r c h ( 2 ) o b s e r v a t i o no nm o r p h o g e n e s i so fm i c r o t u b u l eo r g a n d i e sa n d c o r t i c a lc y t o s k e l e t o n t h i sr e s e a r c hu s e df iu t a xa n da - t u b u l i na n t i b o d ya st h ep r o b e s t om a r kg r o w i n gp r o g r e s so fm i c r o t u b u l eo r g a n d i e si nm i t o s i sa n d o b s e r v et h ec o r t i c a lm i c r o t u b u l ec y t o s k e l e t o ni nn o n m i t o s i s d u r i n gt h e a s e x u a lr e p r o d u c t i o nt h en e w l yc i l i aa r en e a r l yr e l a t e dw i t ht h ep r i m a r y c i l i a i nn o n - m i t o s i sc o m p a r i n gw i t ht h ef r e s h w a t e re u p l o t e ss p ，t h e m a r i n ee u p l o t e ss p h a sl e s sd e v e l o p e df r o n t a l - v e n t r a lc i r r ic y t o s k e l e t o n ， m o r er a d i a t i n gf i b e r si nv e n t e ra n dm o r e 拓a n s v e r s em i c r o t u b u l eb u n d l e s i nd o r s a ls i d e o nt h ec o n t r a r yt h ef r e s h w a t e re u p l o t e ss p h a sm o r e d e v e l o p e d f r o n t a l - v e n t r a lc i r r i c y t o s k e l e t o n a n dm o r e l e n g t h w a y s m i c r o t u b u l eb u n d l e si nd o r s a ls i d et h e s er e s u l t s s u p p l y t h e c o m p l e m e n t a r i t i e s o ft h e c o m p o n e n t s o fc o r t i c a l c y t o s k e l e t o n i n e u p l o t e s ( 3 ) a n a l y s i so nc o m p o n e n t so fc e l lm e m b r a n ep r o t e i n s t h em a r i n ee u p l o t e ss p e x i s ti ns e a w a t e rw h e r ei st h ee s p e c i a l e n v i r o n m e n t t h e r e f o r et h i sr e s e a r c hr e l a t e dt ot h ec o m p a r i s o no fi n t e g r a l m e m b r a n ep r o t e i n sb e t w e e nt w oe u p l o t e s i n t e g r a lm e m b r a n ep r o t e i n sa r e c h a r a c t e r i z e db yah y d r o p h o b i cd o m a i nw h i c hi n t e r a c t sd i r e c t l yw i t ht h e h y d r o p h o b i cc o r eo ft h el i p i db i l a y e r n o n i o n i cd e t e r g e n t sa r ew i d e l y u s e df o rt h es o l u b i l i z a t i o no ft h e s ep r o t e i n s b ym e a n so ft h en o n i o n i c d e t e r g e n tp h a s es e p a r a t i o na n dg e le l e c t r o p h o r e s i s ，i tw a s s h o w nt h a t b a n d sc o r r e s p o n d i n gt o1 2 3 ，7 7 5a n d5 2 k dw e r ep r e s e n ti nt w oe u p l o t s ， b u th a dd i f f e r e n tc o n t e n t s t h em a r i n ee u p l o t e ss p h a dt h eb a n d s c o r r e s p o n d i n g t o1 0 2 ，6 3a n d4 3 k da n dt h ef r e s h w a t e re u p l o t e s s p h a d t h eb a n d sc o r r e s p o n d i n gt o9 9 5 2 9a n d2 7 k d m a y b et h e s ed i f f e r e n c e s r e l a t e dt ot h el i v i n ge n v i r o n m e n t k e y w o r d ：e u p l o t e s u l t r a s t r u c t u r ec o r t i c a lc i l i a t u r e f l u t a x qt u b u l i na n t i b o d ym i c r o t u b u l e o r g a n e l l e s m e m b r a n ep r o t e i n s 学位论文独创性声明 本人所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及 取得的研究成果据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文 不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果对本文的研究做出重 要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确说明并表示谢意 作者签名：生廷耋日期：卫盈z ： 学位论文授权使用声明 本人完全了解华东师范大学有关保留，使用学位论文的规定，学 校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电 子版和纸质版有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论 文进入学校图书馆被查阅有权将学位论文的内容编入有关数据库进 行检索有权将学位论文的标题和摘要汇编出版保密的学位论文在 解密后适用本规定 学位论文作者签名： 导黼：砌多 导师签名：倒7 矽吵 日期： 趔1 ： 日期： 2 0 0 7 年华东师范大学硕士学位论文 第一章研究综述：游仆虫类纤毛虫的皮层形态及细胞 骨架的研究 摘要；介绍了腹毛目纤毛虫游仆虫的分类地位、研究的主要意义、基本内容和研 究方法，重点阐述了国内外对游仆虫皮层形态及细胞骨架的研究现状与进展。 关键词：游仆虫皮层细胞骨架 原生动物游仆虫最早由e h r e n b e r g ( 1 8 3 1 ) 报导。它们生活于淡水或海水中， 是一类自由生活的纤毛虫，隶属于纤毛动物门( c i l i o p h o r a ) ，多膜纲 ( p o l y h y m e n o p h o r e a ) ，旋毛亚纲( s p i r o t d c h i a ) ，腹毛目( h y p o t r i c h i d a ) ，游仆 虫亚目( e u p l o t i n aj a n k o w s k i ) ，游仆虫科( e u p l o t i d a t ee h r e n b e r g ) ，游仆虫属 ( e u p l o t e se h r e n b e r g ) 。游仆虫种类繁多，关于这一属内种的记录，共包括7 0 多 个种和变种( t u f f r a u1 9 6 6 ，b o r r o r1 9 7 2 ，c a l l e r1 9 7 2 ，c u r d s1 9 7 5 ) 。 自1 8 3 1 年e h r a n b e r g 报导游仆虫至今的一个多世纪以来，世界上许多国家 的学者一直在对游仆虫进行着研究。早期对游仆虫主要是外部形态和纤毛器及附 属纤维的研究，随着人们关于生命形式及其他多方面的认识不断提高，尤其是研 究技术和手段的更新发展，对游仆虫的形态结构、生理功能等方面的研究日益深 入，研究水平已经从细胞水平发展到亚细胞水平和分子水平。 游仆虫在原生动物纤毛虫中属于分化较为复杂的一类。它除了具有纤毛虫采 集容易、培养方便、生命周期短、获得结果快且细胞体积相对较大等特点，还具 有表膜坚韧、仅有一大一小两个细胞核等特点，便于实验中的观察、操作和处理， 因此在细胞生物学、遗传学和生物化学等领域作为理想的实验材料去研究诸如真 核细胞胞器、细胞运动、细胞骨架和核质关系等。 1 游仆虫无性生殖周期中细胞结构的研究 1 1 非分裂期皮层形态 1 1 1 皮层纤毛模式 在腹毛目纤毛虫中，皮层纤毛模式通常为口围带( a d o r a lz o n eo f m e m b r a n e l l e s ，a z m ) 、口侧膜( p a r a o r a lm e m b r 锄e ，p m ) 、额棘毛( f r o n t a lc i r r i ， f c ) 、腹棘毛( v e n t m lc i r r i ，v c ) 、横棘毛( t r a n s v e r s ec i r r i ，t c ) 和尾棘毛( c a u d a l c i r r i ，c c ) 及背触毛( d o r s a lk i n e t i e s 。d k ) 。游仆虫属除具有腹毛目纤毛虫的基 本特征，即细胞有背腹分化，纤毛聚集形成口围带、额腹棘毛、横棘毛、左右缘 棘毛及背触毛等腹面纤毛器和背面纤毛器外，虫体腹面观通常为椭圆形，背腹扁 平；口围带发达，占有腹面左侧的大部分位置，约为细胞长度的2 3 4 5 ，由4 0 6 0 片片状的口围带小膜组成，呈c 型或倒l 型。口侧膜位于口围带后端右侧， 仅有一片，形成刷子样结构，活体不易观察到。额棘毛和腹棘毛汇聚在一起，形 2 0 0 7 年华东师范大学硕士学位论文 成额腹棘毛( f r o n t - v e n t r a lc i r r i ，f v c ) ，分布于口围带右侧区域，在大多数游仆 虫中都是9 根，某些海水种游仆虫如e u p l o t e sp l i c a t u m 等有1 0 根额腹棘毛 ( v a l b o n e s t 等，1 9 9 7 ) 。横棘毛为5 根，位于细胞腹面右后，右数第一根至第四 根位于同一直线上，第五根在第四根左上方，与第三根相对。缘棘毛( 1 2 根) 和尾棘毛( 通常2 3 根) 各位于细胞后端的左右侧，显示相似的定位特征。细 胞含一个巨大型的大核和一个圆球型的小核。银线系发达，背面通常为规则的稀 疏格状( 少数为不规则的细密网格状) 。腹面纤毛器较粗大，是运动胞器；背面 纤毛器细小，只由单根纤毛构成。 1 1 2 皮层银线系 应用银浸法显示，游仆虫类纤毛虫的背、腹面有一层与硝酸银物质起反应后 沉淀形成的网状结构，其中腹面的网格大小不等，在口围带末端与口侧膜交汇处 及横棘毛周围的网格较小且较为密集，其他部位网格较大；背面的网格大小相近 且按规则排布，如同在草履虫( p a r a m e c i u m ) 中所见的银线网那样，常将这类网状 结构称为银线系( s i l v e r l i n es y s t e m ) 或嗜银系( a r g y r o m e ) ，其网的形态特征也 是种水平分类的依据之一( t u f f r a u ，1 9 6 0 ) 。 应用扫描电镜技术对锇酸固定液固定的游仆虫样品也可显示其背、腹面的网 格，网格的形态与银浸法获得的嗜银网结构相一致( g u 等，1 9 8 7 ) 。这些网络结构 的成分目前还不清楚。游仆虫背面的银线系根据相邻两列背触毛之间银线系的列 数而分成三种基本类型：单线型、双线型和多线型( 图1 - 1 ) 。双线型又分别以阔 i ：1 游仆虫( e u p l o t e se u r y s t o m u s ) 和盘状游仆虫( e u p l o t e s p a t e l l a ) 为代表而分为 d o u b l e e u r y s t o m u s 型和d o u b l e p a t e f l a 型。单线型银线系的特征是相邻两列背触毛 之间只有一排近似长方形或正方形的网格；双线型的为两排长方形或正方形网 格；多线型则是在相邻两列背触毛之间有三列以上多边形网格。在d o u b l e e u r y s t o m u s 型中，两列网格的宽度和大小都近似，而在d o u b l e p a t e f l a 型中，两列 网格一列较窄，网格小，另一列较宽，网格大。在对游仆虫表面纤维网的研究中， 顾福康等( 1 9 8 7 ) 应用光学显微镜和扫描电镜观察了一种游仆虫( e u p l o t e s s p ) 的形态特征：游仆虫腹面网格结构不规则，在唇部的网格比较大，其他部位的较 小。背面背触毛之间是两排长方形网格，目p d o u b l e e u r y s t o m u s 型，网格约长0 2 7 um ，宽0 2 5pm 。庞延斌等( 1 9 9 9 ) 应用银浸干片技术显示小腔游仆虫( e u p l o t e s a e d i c u l a t u s ) 细胞表面布满银线网格，相邻两列背触毛之间均有两排近似于正 方形的长方形网格。腹面银线网格为不规则的多边形，排列紧密如同蛇皮一般。 倪兵等( 2 0 0 0 ) 应用扫描电镜观察到一种游仆虫腹面棘毛区外布满长o 0 4 i j , m 、 宽o 0 2um 的网格，背皮层纵纤维上方附着4 4 5um 的方形网格，相邻纤维网按 错落有致的方式排列，这相当于显微镜下显示的银线网的纤维构架。在腹皮层表 2 2 0 0 7 年华东师范大学硕士学位论文 膜下也偶见纤维物质围绕成大小不一的环形结构，可能是一种与游仆虫腹面银线 网构架相联系的结构。 a 单线型银线系( 示e u p l o t e sc r a $ $ 1 1 5 ) c 双线删银线系d o u b l e - p a t e l l a ( 示e u p l o t e s p a t e l l a ) b 双线型银线系d o u b l e - e u r y s t o m u s ( 示e u p l o t e se u r y s t o m u ) d 多线型银线系( 示e u p l o t e s e l e g a n s ) 图1 - 1 游仆虫银线系的类型 ( t u f f r a u1 9 6 7 ) 3 2 0 0 7 年华东师范大学硕士学位论文 1 1 3 皮层微管骨架 1 1 3 1 表膜和表膜下纤维系统 与大多数纤毛虫一样，游仆虫的表膜也有明显的分化。游仆虫的表膜含质膜 和表膜泡两种膜结构。表膜泡内膜和外膜有明显的空间。每两个表膜泡间有间隔 分开。腹面棘毛基部着生腔开口其镶边状的表膜趋于增厚。全部各层膜结构中， 质膜连续覆盖于细胞表面，表膜泡则成块状分布。 在表膜下纤维系统的研究中，r o t h ( 1 9 5 7 ) 应用透射电镜技术首先观察到盘状 游仆虫的表膜下微管结构；g r i m ( 1 9 6 7 ，1 9 7 2 ) 应用同样方法显示了阔口游仆虫的 表膜下微管并构建了棘毛基部骨架的三维图；而值得一提的是，g r i m 及合作者 ( g r i m ，1 9 8 2 ；g r i m 等，1 9 8 0 ) 成功地应用生化去膜技术和扫描电镜术相结合的 方法显示了游仆虫表膜下纤维层、口皮层纤维和腹面棘毛中毛基体水平的纤维骨 架等立体结构，将纤毛虫皮层细胞骨架的研究从二维水平发展到三维水平。刘大 海等( 1 9 9 4 ) 观察到包囊游仆虫( e u p l o t e se n c y s t i c u s ) 背面表膜下微管中，每三 根微管形成“品”字形微管单元，与表膜平行，沿细胞长轴纵走。倪兵等( 2 0 0 0 ) 应用非离子去垢剂抽提和扫描电镜样品制备、观察相结合的方法观察到一种游仆 虫背、腹表膜下的纤维网。顾福康等( 2 0 0 3 ) 应用同样的方法揭示了镰游仆虫 ( e u p l o t e sh a r p a ) 表膜下纤维系统由纵纤维层、球形纤维层和深部纤维层三层 纤维组成。对镰游仆虫去除表膜后，显露出表膜下一纵纤维层，其中许多按细胞 长轴定向的单根纤维在一个平面紧密地排列在一起，纵行于细胞前、后端，在纤 维的下方附着有稀疏分布的横纤维。在整个纵纤维层区，纤维层按一定间隔断开 成纵沟，将纤维层分成几部分条带。在纵纤维层紧下方，许多大小相近的小球样 结构聚集在一起，形成密密的一层。在纵纤维层条带间的沟槽内，也常显露出这 样的小球样结构。在该两层结构下相当于额腹棘毛区皮层下深部，纤维或纤维束 形成纵横交错的网络。网络的左缘与口纤毛器骨架接续，网络的后部，粗细不同 的纤维和纤维束交织在一起，形成更致密的一层。朱慧等( 2 0 0 4 ) 得到小游仆虫 ( e u p l o t e s g r a c i l i s ) 腹面表膜下纤维层是由粗细相近的纵纤维和横纤维交错在一 起形成的薄薄的一层结构。 1 1 3 2 纤毛器及纤毛器骨架 口围带骨架口围带骨架与其上方的口围带相对应。倪兵等( 2 0 0 2 ) 观察到 的一种游仆虫口围带每个小膜托架的右端固着在紧密聚集的纤维层中，与相应部 位的纤维结构形成扎根样联系，左端处于稀疏分布的纤维网中，且其上方有少数 2 0 0 h m 直径的纤维附着经过，形成非游离状。处于小膜托架上、下方的纤维，大 部分以纵向定位与托架成垂直状态排布，以至明显地形成对托架固定作用。顾福 康等( 2 0 0 3 ) 观察到镰游仆虫整个口围带骨架约由5 5 个小膜骨架组成，骨架的 4 2 0 0 7 年华东师范大学硕士学位论文 左、右缘各有1 根纤维纵行于骨架的前、后端，联接所经之处的小膜骨架。每个 小膜骨架为一个长方形薄片，各按一定间隔依次排列。前端的几个小膜骨架较短， 中部的小膜骨架长，基部的小膜骨架逐渐变短。去除毛基体后的口围带骨架显示 出由纤维交织在一起组成的小膜托架单元。各个小膜托架由粗细相近的纤维编织 而成，托架的前、后缘附着一根较粗的纤维。朱慧等( 2 0 0 4 ) 观察到小游仆虫去 膜后，在整个口围带区暴露出由纤维编织成的各个按序排列的小膜骨架单元。每 个小膜骨架上有3 列毛基体，其中前一列短，后两列长。去基体后在基体下水平 的骨架中，每个小膜骨架形似一个长条形的薄片，各个小膜骨架单元中纤维形成 不同密度的网，其相当于基体下位置的纤维物质紧密聚合在一起。 口侧膜骨架口侧膜骨架也与上方的口侧膜相对应。口侧膜纤维骨架位于原 有口围带基部左侧，其中在一根向细胞右前方伸展的粗纤维的左侧，由横向定位 伸展出许多紧密排列的细纤维，组成一种相当于u f l , 膜形态的刷状构造骨架。据 报道，在镰游仆虫中，口侧膜骨架是一个长椭圆形的薄片。去除毛基体后显示的 口侧膜托架是由两部分各约3 0 股平行排列的纤维交互编织而成，每股纤维含2 根 细纤维，纤维相交处有小孔。这些规则分布的小孔可能是毛基体的着生位置。小 游仆虫去纤毛后，口侧膜骨架上的裸毛基体显示规则排列的形态，每个毛基体呈 中空的球形，相邻基体间有纤维连接。去毛基体后，骨架呈一狭长带形的薄片， 薄片由两部分各平行排列的纤维束交错编织而成。 额腹、横棘毛骨架及其附属纤维额腹棘毛骨架位于密集的皮层纤维网中。 去除纤毛杆后留有毛基体的棘毛骨架，尚可分辨出围棘纤维篮、前纵微管束、后 纵微管束和放射微管。围棘纤维篮在不同位置的棘毛处，其篮的大小各异，但均 显示为不等边多角形。前纵微管束、后纵微管束和横微管束或放射微管是在围棘 纤维篮的表面下位置由其外缘分别向前、后和横向发出的微管束，穿行于皮层纤 维网中。 在额腹横棘毛骨架中最明显的是五根横棘毛基部发出的5 束前纵微管束，向 细胞质前方延伸靠拢最后汇集并终止于额部前方，外观如同五根琵琶弦。每根微 管束由多根微管聚合在一起组成，其起始部位与所在的整个横棘毛基部区镶嵌联 系起来。在大多数情况下，这5 根前纵微管束前端伸展到第1 、3 根额腹棘毛之间 的位置，其全长几乎达到虫体长度的2 3 ，相应之下，横棘毛基部区没有可区分 的后纵微管束和横微管束。每根横棘毛基部伸出多根放射微管，相邻的微管纵横 交错在一起。 1 2 非分裂期细胞核 游仆虫有一大一小两个细胞核。大核c 形、m 形或镰刀形，由多倍染色体 组成，负责细胞无性生殖时基因的转录与表达。小核圆球形，为二倍体，在有性 5 2 0 0 7 年华东师范大学硕士学位论文 生殖过程中起着保存和传递遗传信息的作用( 图1 2 ) 。 3 倒? 1 3 7 9 i c ：3 图l - 2 游仆虫的大核和小核 c r u m - a u1 9 6 7 ) 2 游仆虫无性分裂过程中细胞结构的变化 2 1 皮层结构的演化 腹毛目纤毛虫纤毛原基通常形成于细胞表面，为表层发生型，而游仆虫的纤 毛原基则形成于皮层下的一个封闭的腔室内，为深层发生型。纤毛原基深层发生 型较少见，除在游仆虫外，也偶尔见于尾柱虫类( 宋微波，2 0 0 4 ) 。 大部分游仆虫在分裂期间老的口围带的部分小膜解体后原位重建( 顾福康 等，1 9 8 7 年) ，为前仔虫所继承。老口侧膜在前仔虫中维持不变。后仔虫的口围 带及口侧膜一律来自口原基及口侧膜原基。在空间定位上，口原基基本出现在横 棘毛前方及腹面中线的左侧，经增值、扩大并延长至老的口围带的后端，然后在 原基内由前至后组装成紧密排列的小膜，后经迁移形成后仔虫的口围带。口侧膜 原基通常与口原基无直接的联系，在口原基右侧前方出现。 当口原基扩展成棒锤状时，老口侧膜右侧、额腹棘毛与横棘毛之间，出现五 列虚线状的纵向排列的棘毛原基。随着原基的增殖，每列原基从中部断开，形成 前后两个棘毛原基区，原基继续增殖，使原基列逐渐变成粗实线。然后原基列分 段，自左向右排成3 3 3 3 2 的模式，每段原基继续增大，并在腹面迁移，最终 定位在前后仔虫额腹、横棘毛的位置。当原基列分化成为小段时纤毛生出，随着 原基增生，纤毛也逐渐增多，最终成为成熟的棘毛。原基扩展的同时，皮层微管 系统也随着聚集，在五根横棘毛基部形成琵琶弦。在具有1 0 根额腹棘毛的种类 中，第l o 根额腹棘毛是在第一列3 段原基的左侧、口围带右侧单独发生的。 额腹横棘毛原基开始分段时，前后仔虫口围带左缘与细胞左缘之间的皮层下 6 今c 9 3 。 ，9 2 0 0 7 年华东师范大学硕士学位论文 各形成一列短线，短线进而分段，发育为前后仔虫的左缘棘毛。 背触毛发生的典型特点是新基体在老背触毛后面发生。当腹面棘毛原基列变 为粗实线时，背触毛条索的中部表面下，新背触毛单元在老毛基体的后部稍侧发 生，随后两侧背触毛列的中部区域老毛基体后也长出新毛基体，新毛基体的后面 进一步形成第二、第三个新毛基体当分裂沟出现时，背触毛条索以此为界分 成前后两组，分别分配到前后仔虫中去。细胞右侧的某两列背触毛的中部和后部 分别形成两个球状原基，成为前后仔虫的尾棘毛。 2 2 细胞核的变化 在腹毛目纤毛虫中，多大核种类在无性分裂期会发生核的融合现象，而游仆 虫由于仅有一个大核和一个小核，故细胞核的演化过程比较简单。在纤毛器进入 发生期以前，大核两端各出现一条复制带，两端的复制带同步向中心汇集而完成 d n a 复制。随着分裂的不断进行，大核拉直并从赤道横缢处裂成两端分别进入 两个子细胞。小核的核相变化启动较晚，经有丝分裂后一分为二。 3 游仆虫形态学研究的方法 游仆虫是一种腹毛目纤毛虫，因此对于纤毛虫形态学研究的方法也适用于游 仆虫。与多细胞动物相比较，对单细胞的纤毛虫形态学的研究主要难点在于个体 小，操作困难，许多性状无法直视，故需借助多种特殊染色方法加以显示。 3 1 活体观察法 活体观察主要用以获取纤毛虫活体细胞的大小、外形、运动、纤毛器、伸缩 泡、食物泡、内质颗粒及射出胞器等生物学特征，以补充单纯染色方法的不足， 在纤毛虫形态学研究中占有重要地位，可以快速地鉴别虫体所属的类群。而且最 重要的是，活体观察能够获得染色法所无法得到的一些特征，因为许多重要的种 的特征在染色中难以发现或已经被改变了。但活体观察往往受到经验的限制，而 且细胞在压片时也容易变形。因此，唯有通过活体观察并结合细胞染色方能对纤 毛虫的形态学进行全面的描述。 3 2 蛋白银法 2 0 世纪6 0 年代起蛋白银染色技术( p r o t a r g o lm e t h o d ) 应用于原生动物 ( d r a g e s c o ，1 9 6 2 ：t u f f r a u ，1 9 6 7 ) 。自倪达书第一个成功地用于显示纤毛虫的结 构以来，这种染色方法已成为纤毛虫研究工作者一种常用的手段，并且也是在纤 毛虫研究中应用最广且最重要的染色法，主要用以显示虫体的皮层及内部结构， 如纤毛下器、毛基体、核器及各种表膜下纤维系统等，而银线系统则不被染色。 该法对经验和操作技术依赖较大，需要研究者不断积累经验以获得对不同种类的 良好染色效果，还存在着耗时多、过程复杂、掌握困难等不足之处。庞延斌等 ( 1 9 8 3 ) 以t u f f r a u 方法为基础，针对以上的不足，加以适当改进，形成一套在腹 2 0 0 7 年毕东师范大学硕士学位论文 毛类纤毛虫中适用面更广的蛋白银染色方法，使实验过程更易于操作，结果更趋 理想。 3 3 银浸法 银浸法( s i l v e ri m p r e g n a t i o nm e t h o d ) 又称湿银法，亦称镀银法，是将切片浸 于银盐( 硝酸银) 染料中，使银盐沉淀在这些结构的表面而显出黑褐色，其他结 构不着色，是显示网状纤维的一种方法。由法国人c h a t t o n - - l w o f f 首次使用，经 c o r l i s s 介绍后而被广泛应用于纤毛虫银线系研究。银浸法主要用以揭示纤毛虫 的表面纤毛图式以及银线系，内部结构( 核除外) 则不能显示。该方法的优点在于 能显示出蛋白银法所无法显示的银线系，同时细胞形状通常可完好地保存。但对 于虫体体位无法控制，且对虫体数量要求较高。此外，银浸法又有价格昂贵，耗 时长，染色条件不易控制的缺点。 3 4 黑色素染色法 黑色素最早用于衬托显示草履虫的毛基体，d i l l e r ( 1 9 6 6 ) 用此方法来显示游仆 虫的纤毛器。此后因蛋白银和扫描电镜的使用，很少有人再使用黑色素法。史新 柏( 1 9 8 9 ) 将此方法加以改进，认为它对腹毛目纤毛虫的纤毛器有突出好的显示 作用。在保证显示这些纤毛器的真实长度与形状上优于蛋白银法。对显示纤毛器 的原基也不亚于蛋白银法，而且染色手续远远比蛋白银法简化，加之本法的贴片 方法保证了材料的不丢，因而是研究纤毛虫形态学、分类学以及形态发生学的一 项有用的技术。 3 5 荧光标记法 荧光标记法是近几年来兴起的方法，主要用于细胞微管胞器形态学研究，可 分为直接荧光标记法和间接免疫荧光标记法。 a r r e g u i ( 2 0 0 2 ) 等首次使用荧光紫杉醇染色( f l u o r e s c e n tt a x o i d ，f l u t a x ) 方法来显示纤毛虫的微管细胞骨架。此前，人们已利用它成功地研究了哺乳动物 的细胞骨架( e v a n g e l i o 等，1 9 9 8 ：a b a l 等，2 0 0 1 ) 。f l u t a x 是一种水溶性紫杉 醇荧光衍生物，是紫杉醇祸联一个氨基自由基7 o ( l - a l a n y l ) ，再与荧光素共价 结合的产物。目前使用的f l u t a x 有f l u t a x 1 和f l u t a x - 2 两种。这类衍生 物与紫杉醇类似，能与微管特异性地结合，具有很强的亲和力。 间接免疫荧光标记法是随着抗微管蛋白抗体的广泛应用而发展起来的。 a r r e g u i 等( 1 9 9 4 ) 利用昼微管蛋白抗体标记和鞣酸一透射电镜术显示t e u p l o t e s f o c a r d i i 的左侧表膜下纤维结构，梁爱华等( 1 9 9 8 ) 应用y 微管蛋白抗体研究八 肋游仆虫( e u p l o t e s o c t o c a r i n a t u s ) ，田沁等( 2 0 0 2 ) 利用c 1 、b 微管蛋白抗体 标记包囊游仆虫。 实验证明，与以往的方法相比荧光标记法实验周期短，操作更加便捷，但是， 2 0 0 7 年华东师范大学硕士学位论文 该方法也存在不足之处，如荧光的稳定性校差，标本无法长期保存等。 3 6 扫描电镜及透射电镜观察法 扫描电镜及透射电镜技术的发展为进一步揭示细胞表面及细胞内的亚显微 结构提供了可能。 g r i m 等( 1 9 8 2 ) 成功地应用生化去膜技术和扫描电镜术相结合的方法显示 了游仆虫表膜下纤维层、口皮层纤维和纤毛器水平的纤维骨架等立体结构，将纤 毛虫皮层细胞骨架的形态观察从二维水平发展到三维水