（林木遗传育种专业论文）拟南芥gai基因转化小桐子的研究.pdf

海南大学学位论文原创性声明和使用授权t 一 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取 得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写 过的作品或成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 本声明的法律结果由本人承担。 论文作者签名：土 _ 一 青 日期：2 0 1 0 年6 月3 日 学位论文版权使用授权说明 本人完全了解海南大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向 国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权海南大 学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文。本人在导师指导下完成的论文成果，知识产权归属海 南大学和中国热带农业科学院。 保密论文在解密后遵守此规定。 论文作者签名：王 青 导师签名： 薛希疋 j 日期：2 0 1 0 年6 月3 日 日期：2 0 1 0 年6 月3 日 本人已经认真阅读“c a l i s 高校学位论文全文数据库发布章程”，同意将本人的学位论 文提交“c a l i s 高校学位论文全文数据库”中全文发布，并可按“章程”中规定享受相关 权益。回童途塞堡銮卮澄厦：旦圭生；旦= 生；曼三生筮查。 、- 论文作者签名：土 日期：2 0 1 0 年6 月3 日 青 导师签名： 蕊婶豇 日期：2 0 1 0 年6 月3 日 摘要 本研究以小桐子( j a t r o p h ac u r c a sl ) 为实验材料，优化了以小桐子叶柄和叶脉为外 植体的高效再生体系。实验结果表明：小桐子叶柄和叶脉均易于诱导愈伤组织，其中以 m s + 6 - b a 0 0 5 m g l + n a a 0 0 5 m g l + 蔗糖3 0 9 l + 琼脂5 5 9 l 效果最佳；一周后转入芽诱 导培养基，最佳芽诱导和增殖培养基m s + 6 一b a l 0 m g l + n a a 0 0 5 m 鲫l + 蔗糖3 0 9 l + 琼 脂5 5 l ；将长到2 - 3 c m 高的芽转入生根培养基中培养，得到最佳的生根配方为 1 2 m s + i b a 0 2 m l + 蔗糖2 0 l + 琼脂5 5 9 l 。这为遗传转化奠定了良好的基础。 测定了小桐子叶脉愈伤组织对k a r l 的抗性，得出小桐子叶脉愈伤组织对k a n 的敏 感的最佳浓度为2 0 0 m g l 。把来自拟南芥的控制植物茎伸长的g a 基因作为目的基因， 通过基因枪法和农杆菌法分别转化小桐子叶脉愈伤组织进行小桐子的遗传转化研究。 在应用农杆菌介导转化法时，研究了转化材料、侵染时间、共培养时间、共培养温 度、抑菌素浓度、乙酰丁香酮的浓度等对农杆菌遗传转化效率的影响。实验结果表明： 培养5 d 的叶脉愈伤组织，侵染5 m i n ，2 0 ，共培养2 d ，c e f 浓度2 0 0 m g l ，乙酰丁香 酮浓度2 0 0 p m o l l 的条件下，遗传转化效率最好，不但可以有效抑制农杆菌的生长，而 且愈伤组织侵染后可继续生长。两周后接种到具有选择压的m s + 6 b a l o m g l + n a a 0 0 5 m g l + k a n 2 0 0 m l + 蔗糖3 0 鲫l + 琼脂5 s g l 培养基中进行抗生分化筛选。分化后长至 2 - 3 c m 的抗性芽转入具有选择压的1 2 m s + i b a 0 2 m g 几+ k a n 2 0 0 m l + 蔗糖2 0 9 l + 琼脂 5 5 9 l 生根培养基中生根。 利用基因枪法进行的研究中发现：预培养时间、轰击距离对小桐子的遗传转化率有 较大影响。获得了基因枪转化小桐子的相关参数：叶脉愈伤组织预培养2 d ，6 5 0 p s i ，轰 击距离6 c m ，轰击1 次。 将所得到的抗性苗提取叶脉d n a 进行p c r 检测，呈阳性。扩繁后再次提取叶脉 d n a 进行p c r 检测，仍然呈阳性。初步证明g a 基因已经成功整合n 4 , 桐子的基因组 中，并可稳定遗传。提取d n a 进行s o u t h e r nb l o t 鉴定：非转化的再生植株无s o u t h e r n 杂交信号，而转化后植株d n a 经x b a i 单酶切后，s o u t h e r n 杂交后有明显的杂交信号。 表明目的基因g a 己成功整合到到小桐子基因组中。 关键词：小桐子，再生体系，g a 基因，农杆菌，基因枪，遗传转化。 a bs t r a c t p e t i o l e sa n dv e i n so fb a r b a d o s n u tw e r eu s e da st h ee x p l a n t st oo p t i m i z ei t sr e g e n e r a t i o n s y s t e m t 1 1 er e s u l t ss h o w e dt h a t ：i tw a se a s yt oi n d u c ec a l l u sa n di t so p t i m a lm e d i u mw a s m s + 6 - b a0 0 5 m g l + n a ao 0 5 m l + s u c r o s e3 0 l + a g a r5 5 e l t h ec a l l iw e r ec u l t u r e di n b u dd i f f e r e n t i a t i o nm e d i u mm s + 6 一b a l 0 m g l + n a a 0 0 5 m l + s u c r o s e3 0 l + a g a r5 5 e j l a f t e ro n ew e e k t h e nt h e2o r3c mb u d s w e r ec u l t u r e di nr o o t i n gm e d i u m1 2 m s + i b a 0 2 m g l + s u c r o s e2 0 l + a g a r5 5 y l a l lt h a tp r o v i d eg o o db a s i sf o r t h eb a r b a d o s n u tt r a n s f o r m a t i o n s y s t e m 砀ek a nr e s i s t a n c ew a st e s t e d 砀es e n s i t i v ec o n c e n t r a t i o no fk a nw a s2 0 0 m g l 强e g a g e n eo fa r a b i d o p s i st h a l i a n aw h i c hc o n t r o l st h ep l a n ts t e me l o n g a t i o nh a db e e n t r a n s f e r r e di n t ob a r b a d o s n u t sl e a fc a l l u sb yp a r t i c l eb o m b a r d m e n ta n da g r o b a c t e r i a m m e d i a t e dm e t h o ds e p a r a t e l y s o m ef a c t o r sw h i c hc o u l di m p a c tt h et r a n s g e n i cr a t es u c ha st h ea c c e p t o rm a t e r i a l s ，t h e c o - c u l t u r et i m e ，c o c u l t u r et e m p e r a t u r e ，t h ec o n c e n t r a t i o no fa sa n dt h ec o n c e n t r a t i o no f a n t i b a c t e r i a la n t i b i o t i c sw e r es t u d i e di nt h ea g r o b a c t e r i u m - m e d i a t e dt r a n s f o r m a t i o nm e t h o d t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h ec a l l ic o u l de f f e c t i v e l yr e s i s tt h ea g r o b a c t e r i u mc o n t a m i n a t i o na n d t h e yc o u l dc o n t i n u et og r o wu n d e r t h ec o n d i t i o n st h a t ：l e a fc a l l u sw a sc u l t u r e d5 d ，c o - c u l t u r e d a t2 0 f o r2 da f t e ri n f e c t i o n ，c e fc o n c e n t r a t i o n2 0 0 m g la n da s2 0 0 p m o l l t h ec a l l iw e r e c u l t u r e di nt h em e d i u s m sw i ms e l e c t i o n 。p r e s s u r ei nt h e ma st h ep r o c e d u r ed e s c r i b e di nt h e r e g e n e r a t i o ns y s t e mt w ow e e k sl a t e r i nt h ep a r t i c l eb o m b a r d m e n tm e t h o dw ef o u n dt h a t ：t h ep r e - c u l t u r et i m e2 d ，6 5 0 p s i ， s h o o t i n gd i s t a n c e6 c m a n dis h o o tf o re a c hs a m p l ew a so p t i m a lf o rt h et r a n s f o r m a t i o n t r a n s f o r m e ds e e d l i n g sw e r eo b t i a n e dw i t ht h em e t h o do fk a ns e l e c t i o n t h ep c r d e t e c t i o no fl e a v e sd n af r o mt r a n s g e n i cp l a n t sw a sp o s i t i v e a f t e rb e i n gp r o p a g a t e ds e v e r a l g e n e r a t i o n s t h ep c rt e s t i n go fe x t r a c t e dl e a v e sd n aw a ss t i l lp o s i t i v e t h i sr e s u l ts h o w e d t h a tt h eg a g e n eh a dp r o b a b l yb e e ni n t e g r a t e di n t ot h eg e n o m eo fb a r b a d o s n u ta n di n h e r i t e d s t a b l y a tl a s t ，g e n o m i cd n ao ft r a n s f o r m a t e ds e e d l i n g sw a se x t r a c t e df o rs o u t h e r nb l o t i d e n t i f i c a t i o n t h er e s u l ts h o w e dt h a t ：t h e r ew a sn os i g n a li nt h en o n t r a n s f o r m e dp l a n t l e t s g e n o m i cd n aa n dt h et r a n s f o r m e dd n ad e a l tw i t h 劢口ie n z y m eh a dac l e a rs i g n a li n s o u t h e r nb l o th y b r i d i z a t i o n i ts h o w e dt h a tt h eg a i g e n eh a sb e e ns u c c e s s f u l l yi n t e g r a t e di n t o t h eg e n o m eo ft h eb a r b a d o s n u t k e y w o r d s ：j a t r o p h a r e g e n e r a t i o n s y s t e mg a g e n ea g r o b a c t e r i u m p a r t i c l eb o m b a r d m e n tg e n e t i ct r a n s f o r m a t i o n 目录 摘 要，i a b s t r a c t 1 1 1 前言1 1 1 小桐子的生物学特征1 1 2 小桐子的主要应用价值1 1 2 1 提炼生物柴油1 1 2 2 药用价值2 1 2 3 生态价值。2 1 2 4 促进“三农”经济发展的价值3 1 3 小桐子组织培养研究进展- 3 1 4 小桐子遗传转化研究进展4 1 4 1 选择标记基因及报告基因5 1 4 2 转化方法一6 1 4 2 1 基因枪法6 1 4 2 2 农杆菌介导法：6 1 5g 4 ，基因的研究进展一7 1 5 1g a i 研究进展一7 1 5 2g a i 的基本特征8 1 5 3g a i 在分子生物学研究中的应用8 1 6 农杆菌的研究进展1 1 1 6 1 农杆菌的转化机制1 l 1 6 2 植物对转化的影响1 2 1 6 3 农杆菌转化植物的步骤1 2 1 6 4 培养方法对转化的影响1 2 1 7 研究的目的和意义1 2 1 8 技术路线1 4 2 材料与方法。1 6 2 1 小桐子的组织培养1 6 2 1 1 植物材料1 6 2 1 2 研究方法1 6 2 1 2 1 组织培养过程。1 6 2 1 2 1 1 材料处理及消毒1 6 2 1 2 1 2 培养方法1 6 2 1 2 1 - 3 培养条件1 6 2 1 2 2 培养基1 6 2 2 农杆菌法和基因枪法遗传转化小桐子18 2 2 1 材料1 8 2 2 1 1 质粒与农杆菌菌株1 8 2 2 1 2 受体材料19 2 2 1 3 农杆菌培养基1 9 2 2 1 4 重要试剂、酶、试剂盒及仪器设备1 9 2 2 2 农杆菌法遗传转化小桐子树2 0 2 2 2 1 卡那霉素( k a n a m y c i n ) 压力筛选2 0 2 2 2 2 头孢霉素( c e f a l e x i n ) 对再生的影响。2 0 2 2 2 3 农杆菌侵染液的制备一2 0 2 2 2 4 农杆菌转化步骤2 0 2 2 2 5 转化材料的选择2 0 2 2 2 6 农杆菌侵染时间对材料的影响一2 1 2 2 2 7 农杆菌侵染后共培养时间不同对抑菌的影响一2 1 2 2 2 8 共培养温度不同对抑菌影响2 1 2 2 2 9 乙酰丁香酮a s 浓度对转化的影响2 1 2 2 3 基因枪法遗传转化小桐子树2 1 2 2 3 1 基因枪法转化步骤。2 1 2 2 3 1 1 金粉的处理2 1 2 2 3 1 2d n a 包裹金粉2 1 2 2 3 1 3 轰击一2 2 2 3 转化植株的检测2 2 2 3 1 植物总d n a 提取( c t a b 法) 2 2 2 3 2p c r 扩增2 3 2 3 3 转基因小桐子植株的s o u t h e r nb l o t 检测2 3 2 3 3 1g a 目的基因的制备2 3 2 3 3 2 探针的制备2 4 2 3 3 3 基因组酶切2 4 2 3 3 4d n a 转膜2 4 2 3 3 5 杂交步骤2 6 2 3 3 6 免疫学检测2 6 3 结果与分析。2 8 3 1 小桐子再生体系的优化2 8 3 1 1 愈伤组织的诱导。2 8 3 1 2 愈伤组织的出芽诱导2 9 3 1 3 生根2 9 3 2 小桐子遗传转化的研究3 1 3 2 1 选择压浓度的确定3 1 3 2 1 1k a n 浓度对叶脉愈伤组织的影响3 1 3 2 1 2c e f 对愈伤组织存活率的影响3 1 3 2 2 农杆菌法遗传转化小桐子3l 3 2 2 1 转化材料的选择3 1 3 2 2 2 农杆菌侵染时间对材料的影响3 2 3 2 2 - 3 侵染后不同共培养时间对抑菌的影响3 2 3 2 2 4 侵染后不同共培养温度对抑菌的影响。3 3 3 2 2 5 乙酰丁香酮( a s ) 对转化的影响。3 3 3 2 2 6 转基因材料的获得与检测3 3 3 2 2 6 1 转基因小桐子的获得。3 3 3 2 2 6 2 转基因小桐子的p c r 检测及扩繁3 4 3 2 2 6 3 转基因小桐子的s o u t h e r n 检测3 5 3 2 3 基因枪法遗传转化小桐子3 7 3 2 3 1 基因枪轰击叶脉愈伤组织3 7 3 2 3 2 轰击距离对基因枪法转化小桐子的影响3 7 3 2 3 3 抗性苗的获得3 7 3 2 3 4 抗性愈伤组织的p c r 检测3 8 4 讨论3 9 4 1 小桐子树遗传转化体系建立3 9 4 1 1 外植体的选择3 9 4 1 2 不同激素配比的影响3 9 4 2 将矮化基因导入小桐子树4 0 4 2 1 农杆菌介导转化法4 0 4 2 2 基因枪转化法4 0 4 3 后续工作展望4 0 5 结论。4 1 缩写词及其英汉对照。4 2 l 咐图4 3 参考文献4 5 ，l i 谢4 9 1 前言 1 1 小桐子的生物学特征 小桐子( j a t r o p h ac u r c a sl ) ，英文名b a r b a d o s n u t ，又名麻风树、芙蓉树、臭油桐、 膏桐、黑皂等，大戟科( e u p h o b i a e e a e ) ，麻风树属( j a t r o p h al ) 植物，是分布在热带和 亚热带地区的一种大型肉质灌木或小型乔木。树高2 - 5 m ，在条件好的地段可达6 - 8 m 。 幼枝粗壮，绿色，无毛。叶互生，近圆形至卵状圆形，长宽约相等，约8 1 8 c m 。叶柄 长8 1 8 c m 。叶基心形，不分裂或3 5 浅裂。花单性，4 5 月始花，雌雄同株。雄花萼片、 花瓣各5 枚，花瓣披针状椭圆形，比萼片长1 倍。雄蕊1 0 ，二轮，内轮花丝合生。雌花 无花瓣，子房2 3 室，花柱3 ，柱头2 裂。聚伞花序腋生，总花梗长，无毛或被白色短 柔毛。花期较长，7 8 个月，具不断开花、不断结实的过程。卵形蒴果，3 - 4 c m 长，直 径2 5 3 c m 。种子椭圆形，长1 8 2 0 m m ，直径1 l m m ，干时黑色，平滑，单粒重o 5 0 7 9 ， 每千克干籽一般有1 8 0 0 粒。种子宜于果黑开裂时采收，种子重量占果重的稍多于1 2 。 种仁含油率5 0 6 1 5 ，机榨出油率4 5 ，种子的经济性状依产地不同而有差异( l u o c h a n g - w e i ，2 0 0 7 ) 。 小桐子喜光，耐热、干旱、瘠薄，适应性强。在多种土地上均能生长。野生小桐子 主要生长于干热的亚热带和潮湿的热带雨林。在年均降雨量4 8 0 2 3 8 0 m m ，年均气温 1 8 0 2 8 5 的环境下生存。常生长于海拔高度为1 6 0 0 m 以下的平地、丘陵、河谷、荒山、 坡地。一般栽于田园边、路边做绿篱，以散生或小面积纯林分布。小桐子原产于热带美 洲，现主产于热带、亚热带地区。我国引种有3 0 0 多年的历史，主要栽培或者逸生于广 东、广西、云南、贵州、四川、福建、海南等地。 1 2 小桐子的主要应用价值 小桐子是木本油料植物，除了主要作为传统用药和观赏植物( 陈钢，2 0 0 8 ) 外，近 年来由于其果实含油率可高可达6 0 ( 谭中月等，2 0 0 6 ) ，在国际社会受到了广泛的关 注。使其成为极具开发前景的生物柴油树种。我国石油的储量仅占世界储量的2 ，目 前进口依存度超过5 0 。到2 0 2 0 年，预计我国石油需求将达到4 5 亿吨，能源问题已 经影响到我国经济的可持续发展，同时也对国家产业安全构成严重威胁。 1 2 1 提炼生物柴油 小桐子果实籽粒含油率高，被生物质能源研究专家称为“黄金树 、“柴油树”。 同石化柴油相比，小桐子生物柴油是一种典型的可再生、环保型绿色燃料。生物柴油在 密度、闪点、烷烃值、热值、粘度等指标均达到或超过国际石化柴油标准。提炼改性后 多数指标优于石化柴油，可适用于各种柴油发动机，并且硫含量低，排放符合欧i i i 标准。 生物柴油具有的可再生性、清洁性和安全性，使其被称为“绿色柴油”。在少数发达国 家，早就被应用于车用燃料等矿物柴油替代中。如美国明的尼苏达州于2 0 0 7 年8 月上 旬宣布：今后8 年内将使该州生物柴油替代用量由现在的2 提高到2 0 1 5 年的2 0 。日 本、意大利、法国、瑞士等国家也出具了相应的使用生物柴油的强制性规定。 纯小桐子油还可以用于照明、烹调、发电。还能生产副产品如：化妆品中用的甘油。 再加工而成的小桐子种子饼可用作有机肥料，种子油渣、残油渣、树叶可作农药，去毒 后亦可作动物饲料。此外，小桐子一英寸宽的红色簇生花，常年开放，为易采集的红色 染料源，通过提取色素，可用于纺织品染色。 我国是全世界第二大能源消费国，能源需求严重依赖进口。能源短缺、石油危机将 严重威胁与制约我国国民经济的高速发展。大力加强、加快可再生能源的开发利用，对 高速发展我国的经济，提高综合国力和国家战略安全上都具有重大意义。 1 2 2 药用价值 小桐子原来多作为药用栽培植物，以树皮、叶、乳汁、果实等入药。中医认为其性 寒，根、树皮和叶可消肿、散淤、杀虫止痒、止血止痛，主治跌打损伤、关节挫伤、骨 折疼痛、创伤出血、麻疯、下肢溃疡、湿疹、疥癣、癞头疮、脚癣；籽油可作泻药、催 吐剂，亦可用于治疗皮肤病；树浆对治疗疥湿疹、金钱癣有效：根皮煎剂可治疗风湿、 麻疯，外用治无名疮毒。乳汁对封闭伤口、杀菌、黄蜂及蜜蜂叮咬、牙龈炎、创伤、痔 疮等有效。近来研究发现，小桐子具有抗肿瘤、病毒、真菌活性，及抗微生物、利什曼 原虫、寄生虫等效应。对杀灭钉螺，防治血吸虫病、糖尿病、终止妊娠等也有疗效。据 国外资料报道，小桐子还可用于麻醉、胃痛、利尿、治疗脱发、淋病、腹水、烧伤、胸 膜炎、全身性水肿、坐骨神经痛、梅毒等( 蔡芳等，2 0 0 9 ) 。 1 2 3 生态价值 生物柴油的能耗仅为石化柴油的2 5 ，可显著减少燃烧污染排放，且生物柴油可减 少一氧化硫、二氧化碳等污染物、温室气体的排放，保护大气层。生物柴油燃烧较为完 全，是典型的清洁燃料。由于小桐子的适应性很强，使其成为改善生态环境的优选树种。 综合利用土地资源，合理规划小桐子大面积种植，可使土地得到综合治理，提高土地利 用率，调节区域气候，改善生态环境。故小桐子可用于保水固土、防沙化、增加有机物 质、营造防护林等。小桐子枝叶和果实不能被牲畜食用，作为人工造林不易被人畜破坏， 易于成活、成林。是干热河谷地区恢复植被、改良生态的优选树种。小桐子干、枝近肉 质，含水量高，具一定的耐火能力，亦可用作营建生物防火隔离带的首选树种。 据中国环境报报道，我国天然植被在水土保持、气候调节、控制污染、防止生物灾 害等方面具有巨大价值，每年的生态系统效益高达1 1 万亿元，其中当前价值超过4 7 2 万亿元，潜在价值超过6 5 万亿元。可见发展小桐子产业的意义不仅在于保障国家能源 安全，提供工业原材料，对环境改善、二氧化碳减排、荒山绿化、调整农业结构等方面 都具有重要的意义。 1 2 4 促进“三农 经济发展的价值 农村经济的发展，农业产业结构的调整，农民的脱贫致富是各级政府正在积极探讨 和解决的问题。利用小桐子资源综合加工生产生物柴油及其副产品项目的开发建设，将 对热带、亚热带地区农业、林业发展起到重要的推动作用。百万亩小桐子生态林的建设 对生态环境、水土保持起到重要的保护作用，对推动地方经济发展、帮助农民脱贫致富 起着积极的促进作用。利用荒山坡地种植百万亩的小桐子树原料基地林带，将形成“取 之不尽，用之不竭的绿色地上油田( 李向宏等，2 0 0 9 ) 。 1 3 小桐子组织培养研究进展 目前，小桐子产量低、品质良莠不齐、适种区域狭窄等问题制约了其规模化发展。 为此，选育高产、高含油率、高抗等品种及其随后的快繁就成为促成其产业化发展的重 要基础。运用组织培养的方法可以在短期内获得大量具有优良品种特性的小桐子健壮种 苗。高效的再生体系是进行遗传转化的基础，对于小桐子优良品种的推广提供了条件。 目前，国内在小桐子的植株再生上主要是采用有胚芽( 秦虹等，2 0 0 6 ) 、叶片( 陆 达伟，2 0 0 3 ；秦虹等，2 0 0 6 ) 、子叶( 林娟，2 0 0 2 ；秦虹等，2 0 0 6 ) 、下胚轴( 林娟，2 0 0 2 ； 陆达伟，2 0 0 3 ) 、茎段( 秦虹等，2 0 0 6 ；陈金洪等，2 0 0 6 ) 、胚乳( 侯佩等，2 0 0 6 ) 、叶 柄( 陆达伟，2 0 0 3 ) 、花药( 任琛，2 0 0 6 ) 和上胚轴( 陆达伟，2 0 0 4 ) 等。其中，以叶 柄、子叶、花药、叶片、胚乳作为外植体的组织培养是通过先诱导产生愈伤组织，进而 诱导分化出芽实现的。上、下胚轴可以先诱导出愈伤组织后诱导出芽，亦可直接从表面 诱导不定芽，这种方式比先形成愈伤组织的方式要节省时间( 陆达伟，2 0 0 4 ) 。胚芽、 茎段外植体为直接诱导出腋芽。在这些研究中，选取的外植体不同，愈伤组织诱导率、 芽分化率有很大差异。 在组织培养中，使用子叶和上胚轴作为外植体容易实现植株再生。魏琴的研究表明 在m s 中添加激素组合o 2 o 7m g mb a 与o 1m g li b a ，可从上胚轴表面直接诱导出 不定芽。激素最佳组合为b a 0 5m g l + m a o 1m g l ，诱导率可达到3 8 。林娟利用子 叶诱导愈伤组织，再诱导不定芽，诱导频率为4 7 1 。生根培养好的再生苗可成功地转 移到温室栽培而无可见的变异。秦虹( 2 0 0 6 ) 等在激素组合为5 0m g l6 一b a + 0 1m g l n a a 的培养基中，使子叶和下胚轴的再生率达到了8 0 。通过子叶和上胚轴虽然能成 功诱导不定芽，但是不适合对优良无性系进行基因工程改造。 使用叶片作外植体不但能检验材料的遗传稳定性，而且有充足的外植体供应。叶片 再生不定芽，一般先诱导愈伤组织，然后再诱导不定芽。如陆伟达( 2 0 0 3 ) 等采用小桐 子的叶片作外植体，在激素组合o 5m g l b a + lm g l i b a 的m s 培养基中，先诱导出 绿色的愈伤组织，再诱导不定芽，诱导频率为5 6 。另外亦可直接从叶片诱导不定芽。 邓君萍( 2 0 0 5 ) 研究了不同抗生素种类、浓度对小桐子组织培养的影响。以小桐子的真叶、 子叶、根及对应的愈伤组织为材料，得出用于筛选转化植株的最佳抗生素为卡那霉素， 最佳抗性筛选浓度范围为1 0 2 5 m g l 。印度科研人员j o h n s o n 在m s 培养基中添加t d z ， 实现直接分化不定芽。诱导率达5 3 5 。在实验中还发现t d z 能够抑制愈伤组织的生长， 促进不定芽的分化。另外，s 吗a t h a 以无毒的小桐子叶片为外植体，先于2m g lb a + im g l i b a 的m s 培养基中培养3 周，诱导频率达到5 4 。然后转到1m g lb a + 0 5m g l i b a 的培养基中，通过降低激素浓度，不定芽的诱导率可达到9 0 。此外，另一个印度科研 人员m u k h e 巧e e ，进行了体胚发生研究。采用k t ，从幼嫩的叶片诱导出乳白色的胚性愈 伤组织，再于含i b a + k t 的培养基中诱导出球型胚。而后诱导出完整植株，实现了由 体胚发生途径来获得植株的途径。虽然无毒麻疯树再生率较高，但是有毒麻疯树再生率 比较低，将制约基因转化的研究。 李化( 2 0 0 6 ) 进行了小桐子促腋芽分枝、生根诱导实验。发现k t 、2 ，4 一d 的激素搭配 有利于诱导愈伤；培养基m s + 5 0 m g l a g n 0 3 + 1 o m g mb a + 0 0 1 m g li b a 的腋芽分枝效 果较好；p h 值对腋芽分枝的影响不大；采用高浓度生长素瞬时刺激或无激素活性炭培 养基都能得到9 2 以上的生根率。任琛( 2 0 0 6 ) 对花药进行了愈伤组织的研究，对影响 花药愈伤组织形成的因子进行了探索。发现激素搭配、低温预处理时间、花药发育时期 和蔗糖浓度对小桐子花药愈伤组织的诱导都有重要影响。低温预处理以4 。c ，3 5 d ，为 佳，单核中晚期最适宜诱导。陈金洪( 2 0 0 6 ) 对小桐子茎段离体培养、快速繁殖进行了研 究。侯佩( 2 0 0 6 ) 初步研究胚乳了愈伤组织的形成，为小桐子非整数倍体和多倍体育种 奠定了基础。 近年来，尽管国内外在小桐子组织培养方面的研究取得了一定的进展，但仍有一些 问题尚未解决。并且有些研究结果不一致，表明不同外植体对培养基激素的要求不同。 对此，对小桐子组织培养的影响因子进行更加系统的研究，以便更好地实现小桐子的快 繁。另外，目前关于小桐子组织培养遗传稳定性方面的研究很少。愈伤组织细胞再生的 植株易发生变异，因此需要对小桐子组培苗是否易发生变异作进行更加深入的研究。此 外，目前的研究仍仅限于实验室，尚未进行工厂化育苗生产实践，以后的研究应该更加 注重这一方面。 1 4 小桐子遗传转化研究进展 为了提高小桐子种子含油量以及改变油的组成，增强对病虫害的抵抗，增强对环境 的适应能力，需要对小桐子进行遗传改良。小桐子可以通过属内种问杂交引入优良性状， 4 但是周期长，不能够获得特异外源基因，故主要通过基因转化改变遗传背景。对小桐子 基因转化需要高效的基因转化技术。 自1 9 8 3 年首次获得转基因植物以来，植物遗传转化研究发展迅速。但小桐子的遗 传转化研究则刚起步，仅有少数报道。目前的研究工作主要集中在遗传转化体系的构建 及优化上。适当的筛选物质、适当的浓度是进行遗传转化的基础。在瞬时表达测试实验 中，通过不同浓度和不同种类抗生素对小桐子的真叶、子叶、根及相应愈伤组织生长的 影响研究发现，浓度范围为l o 2 5m g l 的卡那霉素可用于筛选转化植株；小桐子子叶在 分化培养基i b a l m g l + b a 0 4 m g l 上预培养2 d ，并在预培养基和离心后的m s 0 农杆菌 菌液中加入a s ，最后瞬时表达效率达6 0 ( 邓君萍，2 0 0 5 ) 。李美茹( 2 0 0 6 ) 初步证明 了小桐子的真叶、子叶、下胚轴，都对农杆菌敏感。通过梯度实验检测不同外植体对潮 霉素、卡纳霉素、除草剂以及头孢霉素的敏感性，从而确定了基因转化筛选的最佳抗生 素浓度，使用g u s 瞬时表达法确定了最佳的转化条件。在此基础上，以子叶为外植体， 建立了以潮霉素和除草剂为筛选标记，以g u s 为报告基因的农杆菌转化体系，获得了 转基因植株。通过p c r 、s o u t h e r nb l o t 、g u s 染色检测，转化率达到1 3 。但其他遗传 转化方法还没有报道。 1 4 1 选择标记基因及报告基因 建立高效稳定的选择、报告系统是遗传转化成功的关键因子之一。报告基因( r e p o r t e r g e n e ) 是一种编码可被检测的蛋白质的基因，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。 把它的编码序列、基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或者与其它目的基因相融合。 在调控序列控制下进行表达，通过利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选 得到转化体。作为报告基因，在遗传选择和筛选检测方面必须满足以下几个条件： ( 1 ) 已被克隆并且全序列已被测定； ( 2 ) 表达产物在受体细胞中原本不存在，即无背景。在被转化的细胞中无类似的内 源性表达产物； ( 3 ) 其对应的表达产物能进行定量测定。 在植物基因工程领域，常使用的报告基因有以下几种：章鱼碱合成酶基因( o c s ) 、胭 脂碱合成酶基因( n o s ) 、新霉素磷酸转移酶基因( n p ti i ) 、庆大霉素转移酶基因、氯霉素乙 酰转移酶基因( c a t ) 、葡萄糖苷酶基因、荧光酶基因( 1 u c ) 等。，l 伽、o c s 这两个基因为致瘤 土壤农杆菌( a g r o b a c t e r i u mt u m f a c i e n s ) 的t i 质粒特有。对t i 质粒进行改造，用对应的致 瘤农杆菌转化植物时，如果外源基因转入植物体内，则这两种报告基因在植物的根茎叶 中均能表达，不受发育调控。检测时直接使用转化体提取液进行纸电泳，染色后在紫外 光下观察荧光就可以了。n p t1 1 、c a t 及庆大霉素转移酶基因，都是抗生素筛选基因。相 关的酶可以对它们的底物进行修饰( 磷酸化、乙酰化等) ，从而使得这些抗生素失去对植 物生长的抑制作用，使含有这些抗性基因的转化体能在含有这些抗生素的筛选培养基上 5 正常生长。亦可以用外用同位素标记，转化体提取液体，放射自显影筛选转化体。目前 常用的一种报告基因是夕d 一葡萄糖苷酶基因。此酶催化底物形成d 一葡萄糖苷酸。其 在植物体中几乎无背景，组织化学检测非常稳定，可用分光光度计、荧光等进行检测。 荧光酶基因( t u c ) 是1 9 8 5 年从北美荧火虫与叩头虫e d n a 文库中克隆出来的。该酶在有 a t p 、0 2 、m 矿+ 和荧光素存在时发出荧光，这样就可用于转基因植物整株或部分用x 光片或专门仪器直接进行检测。 1 4 2 转化方法 基因枪法和农杆菌介导法是植物遗传转化技术中应用最普遍的方法。其中农杆菌已 有转化成功的报道，而使用基因枪法进行小桐子转化未见报道。使用基因枪的基因转化 效率的高低受许多因素的影响，如受体的生长状态、微弹射程、轰击次数以及筛选程序 都是影响转化效率的重要限制因子。农杆菌介导法以其操作简单、转化效率高、拷贝数 少等优点，成为目前最受关注的小桐子树转化技术方法。影响小桐子树农杆菌转化效率 的因素有多种，也很复杂，主要的因素有外植体的基因型、外植体的类型及生理状态、 外植体的预处理、选择压的类型与尝试、菌种、农杆菌的预诱导培养时间、农杆菌侵染 外植体的时间等( 李美茹，2 0 0 6 ) 。 1 4 2 1 基因枪法 基因枪法又称微弹轰击法。利用被放电或机械加速的金属颗粒对细胞进行轰击。先 将外源