（森林保护学专业论文）喜树碱对小菜蛾的生物活性及作用机理研究.pdf

摘要 喜树碱为喹啉类化合物，主要存在于蓝果树科植物喜树中。前期工作中，研究人 员对喜树碱的提取工艺和粗提物的生物活性测定做了大量实验，结果表明，喜树碱粗 提物对小菜蛾具有多种作用方式：触杀作用较弱，具有一定的拒食、胃毒作用及较强 的抑制生长发育作用，乙醇提取物还具有一定的产卵忌避和杀卵作用。本研究通过室 内生测、酶活性测定、聚丙烯酰胺凝胶电泳等方法和h p l c 等技术就喜树碱对小菜蛾 的作用方式和作用机理进行了研究，结果表明： ( 1 ) 喜树碱对小菜蛾的致毒症状为试虫不能正常蜕皮，虫体皱缩，或形成畸形蛹等。 ( 2 ) 喜树碱各剂量对小菜蛾幼虫的触杀作用较弱，但采用浸叶饲喂法处理试虫后， 2 0 0 0 m g l 处理试虫出现较高死亡率，达到9 0 ，表明对小菜蛾具有较强的胃毒作用， l c 为7 6 2 5 5 3 m g l 。 ( 3 ) 喜树碱对小菜蛾的体重增长倍数具有较大影响，显著抑制了小菜蛾幼虫的生长 发育，抑制率最高达到2 8 4 1 5 。喜树碱处理后，小菜蛾化蛹时间延迟，异常蛹增多， 羽化率降低。对照第8 d 正常化蛹率为6 3 ，而2 0 0 0 m g l 处理组正常化蛹率仅为 6 6 7 ；5 0 0 m g l 处理后第8 d 异常蛹宰达到3 0 ，第1 2 d 正常羽化率仅为对照的3 0 左右。 ( 4 ) 对小菜蛾的产卵和卵孵化具有较强的抑制作用。1 0 0 0 m g l 浓度喜树碱对小菜 蛾的产卵抑制率达到了8 1 9 6 7 ，使小菜蛾产卵率明显降低；卵孵化率明显减少， 仅为对照的1 7 3 。 ( 5 ) 采用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定了喜树碱对酯酶的影响，在2 4 h 内，喜树碱对小 菜蛾体内酯酶活性有显著激活作用。 ( 6 ) 喜树碱使小菜蛾体内蜕皮激素滴度显著降低；同时诱导了试虫体内保幼激素的 合成，延迟了试虫正常变态的时间，从而影响了试虫的发育和变态。 上述结果表明，喜树碱对试虫具有生长发育抑制，产卵率下降、卵孵化率下降等 作用，喜树碱影响了试虫蜕皮激素和保幼激素滴度的变化可能是产生上述影响的一个 重要原因。 关键词：喜树碱；杀虫剂；抑制生长发育；不育；杀虫作用机理 a b s t r a c t c a m p t o t h e c i ni sak i n do fc o m p o u n dw h i c hb e l o n g st oq u i n o l i n e ，i tm a i n l ye x i s t si n c a m p t o t h e c i aa c u m i n a t ad e c a i s n eo fn y s s a c e a e i np r e v i o u sr e s e a r c h ，al a r g ea m o u n to f e x p e r i m e n tw a sd o n eo nc a m p t o t h e c i ne x t r a c t i o n , s u c ha si m p r o v ee x t r a c t i n gm e t h o d ， i n s e c t i c i d a la c t i v i t yo fc a m p t o t h e c i nw a st e s t e de t c t h er e s u l t ss h o w e dt h a tc a m p t o t h e c i n e x t r a c t i o nh a ds e v e r a ld i f f e r e n tt y p eo fa c t i o n ：n e a r l yh a dn oc o n t a c tt o x i c i t y , h a d a n t i f e e d a n ta c t i v i t y ，s t o m a c ha c t i v i t ya n ds t r o n gg r o w t h - i n h i b i t i o ne f f e c ta g a i n s tp l u t e l l a x y l o s t e l l ala l ld i f f e r e n te x t r a c t i o np r e s e n t e ds t r o n go v i p o s i f i o nd e t e r e n te f f e c ta g a i n s tt h e p l u t e l l ax y l o s t e l l al a d u l t s t h ee x t r a c t i o no fa l c o h o lu l t r a s o n i ch a dd i s p l a y e dp o t e n t i a l s o fo v i c i d a la c t i o n t h i sp a p e rs t u d i e do nm o d eo fa c t i o na n dm e c h a n i s mo fc a m p t o t h e c i n t op l u t e l l ax y l o s t e l l al b yb i o a c t i v i t ym e t h o da n dp a g e 、e n z y m ea c t i v i t ya s s a y 、h p l c t e c h n o l o g ye t c t h er e s u l t ss h o w e dt h a t ： ( 1 ) t r e a t e dw i t hc a m p t o t h e c i n ，e c d y s i so fl a r v a eo fp l u t e l l ax y l o s t e l l al w a s a b n o r m a l ，t e s t e di n s e c tb o d ys h o w e ds h r i n ks y m p t o m ，a n da b n o r m a lp u p a t i o na p p e a r e d ； ( 2 ) a l lc o n c e n t r a t i o no fc a m p t o t h e c i nh a dal i t t l et o x i c i t ye f f e c t st ol a r v a eo fp l u t e l l a x y l o s t e l l al b yc o n t a c tm e t h o d ，2 m g m ll e dt oh i g hl e t h a lr a t eo f9 0 ，s ow ec o u l d c o n c l u d et h a tc a m p t o t h e c i nh a ds t r o n gs t o m a c hp o i s o n o u s ，l c s oi s7 6 2 5 5 3 2 m g l ( 3 ) c a m p t o t h e c i nh a ds i g n i f i c a n ti n h i b i t i o ne f f e c tt og r o w t hi n c r e a s eo fp l u t e l l a x y l o s t e l l al a f t e rt r e a t e dw i t hc a m p t o t h e c i n ，t h et i m eo fp u p a t i o nw a sp u to f f , t h e n u m b e ro fa b n o r m a lp u p a t i o ni n c r e a s e d e c l o s i o nr a t ed e c r e a s e d t h ec o n t r o lg r o u p s n o r m a lp u p a t i o ni s6 3 3 ，b u t2 m g m lg r o u pi so n l y6 6 7 ；t r e a t e dw i t h5 0 0 m g l ，t h e a b n o r m a lp u p a t i o na b o u n dt o3 0 a t8 d ，a n dt h en o r m a le c l o s i o nr a t ei so n l y3 0 o f c o n t r o lg r o u p ( 4 ) ，b yp a g em e t h o d ，i n2 4h o u r s ，c a m p t o t h e c i nh a ds t r o n ga c t i v a t i o nt oe s t e r a s ei n p l u t e l l ax y l o s t e l l al ( 5 ) c a m p t o t h e c i ng o tt h em h t i t r e sd o w ns i g n i f i c a n t l y , i n d u c e ds y n t h e s i so fj h i i i ，p u t o f ft h en o r m a lp u p a t i o nt i m e ，s 0d i s t u r b e dn o r m a lg r o w t ha n dp u p a t i o no fl a r v a eo f p l u t e l l ax y l o s t e l l al a l li na l l ，c a m p t o t h e c i nh a de f f e c to fg r o w t hi n h i b i t i o n , e c l o s i o nr a t ed e c r e a s e d a g a i n s tp l u t e l l ax y l o s t e l l al c a m p t o t h e c i n se f f e c to nc h a n g eo fj ht i t r e sa n dm ht i t l e s m i g h tb ea ni m p o r t a n tr e a s o no ft h o s ee f f e c t k e y w o r d s ：c a m p t o t h e c i n ；i n s e c t i c i d e ；g r o w t hi n h i b i t i o n ；s t e r i l i t y ；m e c h a n i s mo f a e t i o n 独创性声明 本人声明，所呈交的学位论文，是在指导教师指导下，通过我的努力取得的成果，并且是自 己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已经作了答谢的地方外，论文中不包含其他人 发表或撰写过的研究成果，也不包含在浙江林学院或其他教育机构获得学位或证书而使用过的材 料。与我一同对本研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意。如被查有严 重侵犯他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。 学位论文作者亲笔签名日期：烂z ! ：! 论文使用授权的说明 本人完全了解浙江林学院有关保留、使j l j 学位论文的规定，即学校有权送交论文的复印件， 允许论文被夯阅和借阅；学校_ q ，以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制 手段保存论文。 保密，在年后解密可适用本授权书。口 不保密，本学位论文属于不保密。 囵 ( 请在方框内打“”) 学位论文作者亲笔签名：狮日期：口生! 里乒学位论文作者亲笔签名：毛鬯鳟日期：脚 指导撕亲笔躲蕴憋日期：业, i 喜树碱对小菜蛾的生物活性及作用机理研究 1 前言 随着农药的广泛应用，传统化学农药带来了种种弊端，如残留毒性、有害生物抗 药性的产生等。目前，许多高毒性、高残留农药品种已被禁止使用。在这种压力下， 农药的发展前景已成为人们关心和担心的问题。人们普遍认为2 1 世纪的农药将成为 一种“环境和谐农药”( e n v i r o n m e n ta c c e p t a b l e f r i e n d l yp e s t i c i d e s ) 或。生物合理性农 药( b i o r a t i o n a lp e s t i c i d e s ) ，创制的新农药品种应具有高效、安全、经济的特点。新型 农药的创制有多种途径，如经验筛选、类推合成、天然产物模型及生物合理设计等， 其中对天然产物，特别是对植物源农药的研究与开发是当前新型农药创制的热点。植 物源农药以其化学结构新颖、对环境安全、选择性高、不易产生抗药性、原料来源广 泛( 李晓玲，2 0 0 4 ) 等优点越来越受到社会的认可。 在植物源杀虫剂的开发中，最关键的技术就是具生物活性植物的发现及其活性成 分的分离、鉴定及致毒机理的研究。植物中含有许多对昆虫有特异性致毒作用的物质， 如毒杀、拒食、忌避、抑制生长发育、致昆虫不育等，这些物质为新型杀虫剂的6 , 1 5 0 提供了优良的分子模版，如氨基甲酸酯类杀虫剂以豆科植物毒扁豆碱为先导化合物合 成；新烟碱类杀虫剂合成前体为炯碱：拟除虫菊酯类则以除虫菊素为先导化合物合成； 异丁基酰胺类合成杀虫剂也是以黑胡椒中天然化合物为先导化合物。 在致毒机理方面，国外对植物源杀虫剂的作用机理研究的较为深入，已经达到分 子水平。如热带灌木r y a n i a ( r y a n ms p e c i o s a ) 中的主要杀虫物质是泥鱼丁( r y a n o d i n e ) 。 泥鱼丁占领肌质网( s r ) 释放c a 2 + 的通道，即在肌质网( s r ) 的许多小泡中，泥鱼丁 改变了c a 2 + 在小泡中的渗透性，从而提高了昆虫、甲壳动物和脊椎动物骨骼肌的肌肉 膜无去极化情况下孪缩( 胡兆农，2 0 0 1 ) 。印楝素对昆虫具有强烈的拒食、胃毒、触 杀以及抑制生长发育活性，其作用机理主要是扰乱昆虫内分泌系统，影响促前胸腺激 素( p t t h ) 的合成与释放，减低前胸腺对p 兀h 的感应而造成2 0 羟基蜕皮酮的合成、 分泌的不足，致使昆虫变态发育受阻( 钟平，1 9 9 5 ) 。相对而言，国内对植物源杀虫 活性物质作用机理的研究基本上处于常规毒理学水平。研究认为( 刘惠霞，2 0 0 2 ) ，苦 皮藤素v 对昆虫的胃毒作用主要是由于其破坏了中肠细胞质和消化酶。川楝中的川 楝素对多种害虫具有强烈的拒食、胃毒、抑制生长发育等作用，电生理研究认为，j i i 楝素抑制了昆虫下颚瘤状栓锥感受器，从而使神经系统内取食刺激信息的传递中断， 幼虫失去味觉功能而表现为拒食作用。 喜树( c a m p t o t h e c i aa c u m i n a t ad e c a i s n e ) 为一种古老、优秀的杀虫植物，且是我 国特有树种，速生。喜树的根、茎、叶和种子中含有具抗癌、杀虫、抑菌活性的多种 生物碱，包括喜树碱、喜树次碱、羟基喜树碱、甲基喜树碱等，其中喜树碱含量最高。 现代医学研究已充分证实喜树碱及其部分衍生物具有显著的抗癌作用并己将其成功 喜树碱对小菜蛾的生物活性及作用机理研究 开发为抗癌药物。从农药学的角度来看，喜树碱作为植物体内的一种生物碱，具有可 以开发为杀虫剂的多种优点。经初步研究发现，喜树碱粗提物对小菜蛾具有杀卵、产 卵忌避及抑制生长发育作用，本文以小菜蛾为试虫，对喜树碱的生物活性进行测定， 研究了喜树碱对小菜蛾体内酯酶活性的影响以及对小菜蛾体内蜕皮激素滴度、保幼激 素滴度的影响等，以期通过上述研究初步明确喜树碱的作用方式和作用机制。 1 1 植物源杀虫剂研究现状 1 1 1 植物源杀虫剂产品开发进展 植物源农药取之于自然，用之于自然，具有低毒、低残留、对非靶标生物基本无害， 对环境无污染等优点，可降低或避免目前化学农药带来的“农药公害，符合农药的 发展方向。因此，植物源农药研究是目前农药研究的热点之一。 国外研究较多的有印楝、番荔枝、巴婆、力寿菊等植物，其中最成功的当属印楝， 在其化学、毒理学、药效等理论和应用研究领域内都取得了显著的成果。我国在具活 性成份植物的筛选、活性成份的生物测定及毒理学等理论研究领域得到了显著的成 果，研究内容涉及到楝科、卫矛科、柏科、豆科、菊科等科属的多种植物。而且已成 功地开发了许多植物农药，其中，朋碱、苫参碱、楝素、茴蒿素和茶皂素等已进入工 业化生产。 两北农林科技大学无公害农药研究服务中心1 9 9 2 年成功地研制出“0 5 楝素杀 虫乳油”，为围家科委重点新产品试制推j 。项目( 罗都强，2 0 0 1 ) 。中国科学院植物研 究所研制f j “2 5 良若炕碱乳剂”，对蚜虫、棉铃虫、菜青虫等具有较强的杀伤力，杀 口减退率在9 0 以上( 郝两斌，1 9 9 8 ) 。广东省昆虫研究所等单位以鱼藤为主要成分， 研制成功一种高效低毒低残斟的新型植物杀虫剂高效鱼藤氰，投产多年累计生产 3 0 0 0 多屯( 胡楫，1 9 9 5 ) 。北京农业人学等单位研制成功的新型植物杀螨剂“螨速克”， 对棉红蜘蛛的防治效果优于或相当于目前广泛使用的化学农药( 李芝凤，1 9 9 5 ) 。另 外，吴文君等研制的植物杀虫剂苦皮藤乳油( 0 2 k p t e c ) 对菜青虫、小菜蛾等害虫有 特效，并且对温度、光照比较稳定( 吴文君，2 0 0 1 ) 。目前，我困以烟草、鱼藤、百 部、茴蒿、苦参、楝素、藜芦、印楝及羊角扭等杀虫植物为原料，登记或临时登记了 2 0 多个植物杀虫剂及其混剂产品，有效成分包括苦参碱、氧化苦参碱、烟碱、鱼藤 酮、茴蒿素、黎芦碱、川楝素、印楝素、茶皂素、苦皮藤素等，所涉及的植物种类远 远多于美国和欧洲( 陈万义，2 0 0 1 ) 。从以上成果可见，植物源农药在我国己成为一 类重要的农药，对促进农业生产、保持生态环境将发挥重要作用。 1 1 2 植物源杀虫活性成分的研究 1 1 2 1 几类重要植物活性成分研究 印楝( a z a d i r a c h t a i n d i c a a j u s s ) 是世界上负盛名的杀虫植物。1 9 2 8 年，c h o p sr 首 2 喜树碱对小菜蛾的生物活性及作用机理研究 次报道印楝树中具有杀虫活性物质，b u t t e r w o r t h ( 1 9 6 8 ) 于1 9 6 8 年分得到其中最主要的 活性成分一印楝素( a z a d i r a c h t i n ) 。1 9 8 5 年( 吴文君，1 9 8 4 ) 用x 一衍射法确定了印楝素 的分子结构。目前已从印楝中分离、鉴定数l o 种柠檬类化合物。印楝素对昆虫具有 强烈的拒食、胃毒、触杀以及抑制生长发育的作用。其作用靶标器官主要集中在：脑 ( s u b r a h m a n y a mb ，1 9 8 9 ) 、心侧体( r e m b o l dh ，1 9 8 8 ) 、前胸腺( 赵善欢，1 9 8 4 ) 和脂肪体( r o s e m a r yg ，1 9 8 7 ) 等。现在普遍认为印楝素主要是扰乱昆虫内分泌系统， 影响促前胸腺激素( p t t h ) 的合成与释放，减低前胸腺对p 1 v r h 的感应而造成2 0 一羟基 蜕皮酮的合成、分泌的不足，致使昆虫变态发育受阻( 李晓东，1 9 9 5 ) 。 卫矛科植物的杀虫有效成分为二氢沉香呋哺类化合物。雷公藤和苦皮藤是该科中 重要的杀虫植物。雷公藤( t r i p t e y g i u mw i l f o r d i i ) 的杀虫有效成分主要为w i l f o r d i n e ， w i l f o r g i n e ，w i l f o r t r i n e ，w i l f o r z i n e 及雷公碱，多存在于根皮之中( 张国洲，2 0 0 0 ) 。 雷公藤对多种害虫具有胃毒、拒食、抑制生长发育和忌避产卵等杀虫活性，且药效快， 为其它一般植物性杀虫剂所不及。苦皮藤( c e l a s t r u sa n g u l a t u s ) 对( 张兴，1 9 9 3 ) 小菜 蛾、粘虫、黄守瓜等多种害虫具有较好的防效。 柏科植物砂地柏( s a b i nv u l g a r i s ) 是一种杀虫作用特殊、活性高而稳定的植物。砂 地柏对多种害虫具有胃毒、拒食、熏杀等作用。余向阳等( 余向阳，1 9 9 9 ) 以菜青虫 为标准试虫，采用d , d t 碟添加法进行生物活性跟踪测试，对砂地柏种子中非精油提取 物的杀虫活性成分进行了分离，经溶剂提取、四次柱层析及重结晶，得到一种杀虫活 性成分单体，为白色柱状结品，熔点1 6 0 - - - 1 6 4 ，比旋光度一1 6 0 。( c h c l 3 ) ，代号 为s f 0 2 。通过光潜( u v 、m s 、i r 、n m r ) 分析，并结合其熔点和比旋光度与有关 文献进行对比，鉴定出s f 0 2 为脱氧鬼臼毒素。王继栋等( 王继栋，1 9 9 9 ) 在生物活 性跟踪法指导下，对砂地柏叶的乙醇提取物进行了硅胶柱层析，分离得到对菜青虫具 有高拒食活性的鬼臼毒素。砂地柏精油对多种昆虫具有强烈的熏蒸作用，魏红梅( 魏 红梅，2 0 0 0 ) 以3 龄中期粘虫为标准试虫，采用熏蒸法进行活性跟踪，结合硅胶柱 层析、薄层层析和气相色谱等方法，从砂地柏果实精油中分离得到活性单体物质 p e 0 4 ，通过光谱( i r 、h n m r 、g c m s ) 分析，并结合其沸点和比旋光度等测试， 鉴定为松油烯4 醇，并初步确定其为砂地柏精油中含量最高的主要杀虫成分活性。 杜鹃花科植物黄杜鹃中有3 种活性较高的物质：闹羊花素一i i i ( r i i i ) 、k a l m a n o l 和g r a y a n o t o x i n i l l ，其中以r i i i 为主要杀虫有效成分( 胡美英，1 9 9 2 ) 。闹羊花是高 效土农药，有触杀、胃毒、熏蒸作用。将花磨成粉可防治稻苞虫、稻螟虫、卷叶虫、 叶蝉及蝽蟓等害虫( o z o ek ，1 9 9 4 ) 。 瑞香科植物瑞香狼毒( s t e l l e r ac h a m a e j a s m e ) 根乙醇提取物( 简称s c e e ) 对菜粉蝶 幼虫、亚洲玉米螟幼虫和桃蚜有很强的生物活性。采用活性跟踪方法，从s c e e 中已 分离鉴定出4 种活性成分( 伞形花内酯、瑞香亭、狼毒色原酮和1 3 谷甾醇) ( s w a i nt ， 1 9 7 7 ) 。研究表明( 张国洲，2 0 0 0 ) ，瑞香亭、狼毒色原酮和1 3 谷甾醇能破坏昆虫体 3 喜树碱对小菜蛾的生物活性及作用机理研究 内环境，干扰昆虫正常代谢。 1 1 2 2 杀虫生物碱研究 杀虫生物碱是植物源杀虫剂中的一大类，主要是指具有杀虫活性如触杀、胃毒、 拒食、抑制生长发育、驱避、抗虫、化学不育等作用的生物碱。 ( 1 ) 杀虫生物碱资源的分布 生物碱主要分布于植物界，在动物中发现的生物碱很少( 潘显道，2 0 0 3 ) 。杀虫 生物碱集中地分布在系统发育较高级的植物类群中( 徐汉虹，2 0 0 1 ) 。主要分布于百 部科百部属( s t e m a n a ) 、唇形科水苏属植物( s t a c h y so f f i c i n a l i s ) 、茄科茄属( s a l a n u m ) 、 胡椒科胡椒属( p i p e r ) 、菊科( c o m p o s i t a e ) 、茜草科金鸡纳属( c i n c h o n a ) 、罂粟科罂粟 属( p a p a v e r ) 、小檗属( b e r b e r i s ) 、马钱子科( l o g a n i a c e a e ) 、毛莨科乌头属臼c o n i t u m ) 和翠雀属( d e l p h i n i u m ) 等植物中 ( 2 ) 生物碱杀虫作用的研究 生物碱对昆虫的影响重要有以下几个方面( 徐汉虹，2 0 0 1 ) ： 影响昆虫的神经系统，有明显的触杀作用，如烟碱、假木贼碱对蚜虫、果蝇等 有强烈的触杀活性。 抑制昆虫取食，b l a d e s 和m i t c h e l l 研究发现，喹宁( q u i n i n e ) 、罂粟碱、颠茄碱、 马钱予碱、番茄素、咖啡因、槟榔碱、阿托品可显著降低阿i i 蝇( c a l l i p h o r i d ) 成虫对蔗 糖的摄取。 影响昆虫存活及后代的发育，m i l l e r ( 1 9 8 3 ) 研究了6 种苄基异喹啉 ( b e n r y l i s o q u i n i l i n e ) 对荚固自蛾( h y p h a n t r i ac u r i c a ) 、热带黏虫( s p o d e p t e r aa r i d a m i a ) 和舞毒蛾( l y m a n t r i ad i s p a r ) 的! 物活性，以上三种试虫往事内用人工培养基饲养2 4 h ， 表现取食减少，生长发育缓慢，舞毒蛾从卵至5 龄幼虫的存活率均降低。 影响昆虫产卵，施利英( 2 0 0 2 ) 报道温州蜜枯桔皮提取物对小菜蛾成虫有产卵 拒避作用。 有些生物碱能贮存在昆虫体壁中，影响体壁的正常功能。e g e l h a a f 等( 1 9 9 0 ) 将 生物碱掺入人工饲料中喂饲桑灰灯蛾( c r e a t o n a t a sl r a n s i e n s ) 幼虫，分解其在该虫各虫 态各器官的贮存代谢，发现大量生物碱被贮存在各虫态的体壁中。 抑制线粒体氧化酶，n e a l ( 1 9 8 9 ，1 9 9 3 ) 报道白屈菜碱( c h e l i d s e n i n e ) 是离体微粒 体氧化酶的抑制剂。 1 1 3 植物源杀虫剂作用机理 植物源杀虫剂( b o t a n i c a li n s e c t i c i d e s ) 是一类利用具有杀虫活性的植物某些部位 或提取其有效成分制成的杀虫剂( 张一宾，1 9 9 7 ) 。杀虫生物碱是植物源杀虫剂中的一 大类，主要是指具有杀虫活性如触杀、胃毒、拒食、抑制生长发育、驱避、抗虫、化 学不育等作用的生物碱( 徐汉虹，2 0 0 1 ) 杀虫药剂按照其作用机理主要分为：神经毒 4 喜树碱对小菜蛾的生物活性及作用机理研究 剂，消化毒剂，呼吸毒剂，生长调节剂等。近年来，对杀虫药剂的作用机理的研究主 要包括：形态学观察研究；电生理研究；对昆虫体内各种消化酶，水解酶，保护酶及 其它解毒代谢酶的研究等常规的毒理学研究方法。目前，对有些药剂作用机理的研究 已达到分子水平。 1 1 3 1 影响神经系统 大多数杀虫药剂都具有较强的神经毒性，但它们对神经系统的作用靶标不同。有 机磷类和氨基甲酸酯类杀虫剂主要作用于乙酰胆碱酯酶和乙酰胆碱受体；新烟碱类杀 虫剂作用于烟碱型乙酰胆碱受体( n a c h r ) 的q 亚基；d d t 和拟除虫菊酯类杀虫剂主 要作用于神经细胞钠通道或钙通道，另外拟除虫菊酯类杀虫剂还干扰谷氨酸递质和多 巴胺神经元递质的释放，张宗炳、何转运、宁黔冀等曾报道，昆虫神经系统的n a + 、k + 一a t p 酶是拟除虫菊酯类药剂的靶标之一；环戊二烯类、吡唑类、阿维菌素类等作用 于y 一氨基丁酸( g a b a ) 受体氯离子通道。沙蚕毒素类杀虫剂( n e r e i s t o x i n ，简称n t x ) 作用于神经结的后膜部分( 唐振华，2 0 0 0 ) ，使a c h 不能与a c h r 结合，从而阻断了正 常的突触传递。 近年来，对植物源杀虫剂的作用机理研究取得了较大进展，西北农林科技人学无 公害农药研究服务中心对砂地柏精油的熏蒸作用机理进行了初步的研究( 高聪芬， 1 9 9 6 ) ，发现砂地柏精油熏蒸处理能使试虫血淋巴总量明显下降，呼吸节律趋于平直， 并显著地抑制琥珀酸脱氧酶的活性和激活多功能氧化酶的活性；组织学观察表明砂地 柏精油还对粘虫表皮蜡质层及气门闭肌外膜有破坏作用；结合电生理测定及症状学反 应，提出砂地柏精油主要作用于试虫的中枢神经系统。砂地柏提取物( 付昌斌，1 9 9 6 ) ( 余向阳，1 9 9 9 ) 对羧酸酯酶、蛋白酶及酯酶的活性有不同程度的激活作用，而对主 要解毒酶系( 多功能氧化酶) 的环氧作用具有强烈的抑制作用。博落回碱中的主要有 毒成份血根碱的毒杀作用，主要在于对乙酰胆碱酯酶的抑制( 罗力春，1 9 9 5 ) 。 以松油烯一4 一醇处理粘虫5 龄幼虫后( 马志卿，2 0 0 4 ) ，测定了兴奋期、痉挛期、 麻痹期及复苏期4 个中毒阶段试虫的保护酶活性结果表明，超氧化物歧化酶( s o d ) 被 明显激活，各中毒阶段的酶活力均极显著高于对照，其中兴奋期的酶活力最大，为对照 的3 0 4 倍：处理试虫的过氧化氢酶( c a t ) 在兴奋期和痉挛期与对照的差异不大，而在 麻痹期和复苏期被明显抑制，酶活力分别为对照的7 8 和9 2 ：过氧化物酶( p o d ) 也 被明显抑制，各中毒阶段的酶比活力依次为对照的8 1 ，8 6 0 ，6 5 0 和9 0 0 对苦皮藤素v 引起粘虫兴奋机理的初步研究表明，苦皮藤素v 对昆虫中枢神经系 统兴奋性突触后电位( e p s p ) 和轴突动作电位( a p ) 无显著影响( 杨润亚，2 0 0 0 ) ，而明 显影响昆虫神经肌肉兴奋性接点电位( e j p s ) 和自发电位( s p ) 的发放( 胡兆农，2 0 0 4 ) ， 李孟楼等发现马桑毒素b 对粘虫的作用方式相似于苦皮藤素v 。杜育哲等利用膜片钳 技术发现苦皮藤素对钠通道门控过程的影响与利多卡因等局部麻醉剂非常相似， 其对钠通道的阻滞作用可能是其发挥麻醉作用的重要机制。( 杜育哲，2 0 0 2 ) 5 喜树碱对小菜蛾的生物活性及作用机理研究 此外，在麻疯树中( 李静，2 0 0 5 ) 首次分离到具有杀虫活性的麻疯树萜醇i ，能 显著影响试虫解毒酶系的活性，通过激活胞内p k c 而导致的磷酸化作用，干扰了细 胞正常的信号传递过程。 1 1 3 2 影响消化系统 吴文君比较现有杀虫剂的作用机理，首次提出了“昆虫消化毒剂 的概念及创制 一类作用于昆虫消化系统新型杀虫剂的设想( 吴文君等，1 9 9 7 ) 。并认为消化毒剂对昆 虫主要有两类靶标，一是破坏中肠，可称之为中肠组织破坏剂，一是影响消化酶系， 可称之为消化抑制剂。 吴文君等从苦皮藤中分离出的苦皮藤素i i 、i i i 、i v 能引起粘虫中肠柱状细胞的 微绒毛排列不整齐，大量脱落：基膜内褶空间变大，排列紊乱：线粒体嵴模糊不清楚， 双层膜不完整等。苦皮藤素v 作用于昆虫的消化系统，推测可能在中肠肠壁细胞膜上 存在有苦皮藤素v 的受体，苦皮藤素v 与之结合后细胞膜的三维构象发生改变，细胞 膜对离子的通透性亦随之改变，渗透压平衡被打破，细胞膨胀，最终瓦解，造成肠壁 穿孔，体液流失。 川楝素的毒杀作用被认为是破坏中肠组织，阻断中枢神经而引致麻痹，昏迷，死 亡，由生理研究证明其主要原因是阻遏突触前传导( 赵善欢，1 9 8 7 ) ， 砂地柏非精油提取物对粘虫的作用机理研究( 付昌斌，2 0 0 0 ) 表明，精l 提物对粘 虫的血淋巴的主要理化指标、酯酶、蛋门酶、多功能氧化酶等均有不同程度的影响， 特别是对m f o 的抑制率达9 8 6 ，且使酯酶产生了一些新的酶带：组织学观察表明， 对粘虫幼虫的中肠、后肠及马氏管均有破坏作用，对气门的正常开闭也有影响。脱氧 鬼臼毒素对粘虫的作用机理和非精油提取物的相似。 脱氧鬼臼毒素对昆虫中肠组织和中肠蛋白酶、羧酸酯酶及多功能氧化酶等酶系均 具生物活性，主要为消化毒剂。采用杀虫药剂致毒症状与作用机理之间的关系研究方 法，推断出脱氧鬼臼毒素可能的作用机理是：阻断取食信息的传入或肯激活抑食信息 的输入而表现出拒食活性；破坏了昆虫的消化道，并抑制了中肠淀粉酶而表同出上吐 下泻异常的症状，最后因大量失水而使试虫呈僵直干缩状态；抑制细胞的分裂而使试 虫体壁变薄，易破裂，或发育为畸形蛹或畸形成虫( 马志卿，2 0 0 2 ) 。同时，电生理 测试表明，脱氧鬼臼毒素对萤镰腿节神经一肌肉接头处的m e p s p 发放频率有明显的抑 制作用( 余向阳，1 9 9 7 ) 。脱氧鬼臼毒素1 2 h 拒食中浓是4 8 h 的2 - 3 倍，这说明1 2 h 内试虫取食较多，1 2 h 以后取食能力下降。实验中观察到，1 2 h 中毒的试虫，以后基 本上不取食，4 8 h 后中毒个体增加。有的试虫上吐下泄：有的试虫囚食物不能消化而 于中肠内结块：有的试虫虫体瘫软，腹部呈青绿色半透明状，可观察到内部白色脂肪 体组织，体内充满大量体液而使虫体显的臃肿。经解剖发现，肠道内没有食物残渣， 体壁极薄，呈灰白色半透明状，角质化程度高( 高蓉，2 0 0 1 ) 。这些症状与i n a m o r i 1 0 2 所描述的脱氧鬼臼毒素对5 龄家蚕的作用症状非常相似。结合i n a m o r i 的观点推测 6 喜树碱对小菜蛾的生物活性及作用机理研究 其作用机理，脱氧鬼臼毒素进入虫体后可能分布在体壁、脂肪体、中肠、马氏管中较 多，从而导致试虫体壁变薄、角质化程度增高，使新表皮不能形成，中肠内食物结块， 体内水分代谢失衡，最终导致试虫死亡。 瑞香狼毒中有效成分为1 3 谷淄，伞形花内酯、瑞香亭和狼毒色原酮4 种化合物。 通过对1 3 谷甾醇、瑞香亭和狼毒色原酮3 种活性成分的作用机理研究( 张国洲，2 0 0 0 ) 表明：它们破坏了昆虫中肠的组织结构：抑制了昆虫血淋巴酯酶的大部分主酶带，加强 了少部分主酶带，诱导出了个别新酶带：在一定程度上影响了昆虫中肠脂酶活力、整体 昆虫的粮原、血淋巴总糖含量、血淋巴蛋白质含量等。瑞香狼毒根( 曹挥，2 0 0 3 ) 的 氯仿提取物处理后的成螨体内几种重要酶系活性测定发现，在内吸处理中，其对蛋白 酶、谷胱甘肽一s 一转移酶、酯酶同功酶有不同程度的激活作用：在触杀处理中，对蛋白 酶、谷胱甘肽- s - 转移酶影响不明显，对酯酶同功酶有一定的抑制作用。瑞香狼毒同时 作用于多种靶标酶，不仅对蚜虫等显示出极高的毒杀活性，还将有效延缓昆虫产生抗 药性。 1 1 3 3 影响呼吸系统 昆虫的呼吸作用与其他动物一样，可以区分为外部和内部两个过程，前者属于气 体的运送过程，即通过气门、气管吸进空气中的氧，又排除二氧化碳。后者则是细胞 内醣、脂肪、蛋白质的代谢过程，通过食物的代谢分解获得生存需要的热能。 目前研究的呼吸毒剂主要包括一s i 基酶的抑制剂、线粒体电子传递抑制剂和三羧 酸循环抑制剂。其中研究较为深入的包括：番荔枝( a n n o n as q u a m o s al ) 中的a n n o n o n 和n e o a n n o n ir l 及巴婆( a s m i n at r i l o b a ) 中分离的a s i m i c i n 和鱼藤酮。其中鱼藤 酮使害虫细胞的电子传递链受到抑制，从而降低生物体内的a t p 水平，最终使害虫 得不到能量供应，行动迟缓、麻痹而死亡。鱼藤酮对美洲蜚蠊肌肉线粒体的呼吸作用 有明显的影响。1 0 1 及1 0 m 浓度处理时，发现q 一酮戊二酸、l 一谷氨酸、苹果酸、延 胡索酸、草酰乙酸及柠檬酸等的氧化作用都受到显著的抑制，但是不能抑制琥珀酸及 q 一甘油磷酸酯的氧化作用。并且，丝虫寄生物s e t a r i ad i g i t a t a 线粒体颗粒中的反丁烯 二酸还原酶系统的活性对鱼藤酮敏感，但鱼藤酮( a l d u n a t e ，1 9 9 2 ) 不能抑制寄生物 克鲁氏锥虫( t r y p a n o s o m ac r u z ic h a g a s ) 对氧气的吸收。冈此认为鱼藤酮抑制的部位 是在三羧酸循环的后部，在n a d h 的电子传递系统中而不在琥珀酸传递系统。用纯 鱼藤酮对牛心脏的亚线粒体颗粒的结合部位进行研究，发现鱼藤酮大约是按克分子 l ：l 的比例与n a d h 去氢酶结合，同时还证实这种结合可以与酶分开。说明鱼藤酮 不是对n a d h 去氢酶产生抑制，而是作用部位在n a d h 系统。如s e t a r i ac e r v i 线粒体 中从n a d p h 到n a d h 这一过程的电子传递可被鱼藤酮高度抑制( g o y a l ，1 9 9 0 ) 。 1 1 3 4 致不育作用和抑制生长发育作用 自1 9 5 4 年开始，有人用辐射处理致羊皮螺旋蝇不育获得成功后，利用绝育防治 害虫就开始受到广泛的注意。张宗炳研究发现不育剂t h i o - t e p a 防治家蝇幼虫能造 7 喜树碱对小菜蛾的生物活性及作用机理研究 成形态上不正常的成虫，他提出( 张宗炳，1 9 6 4 ) 不育剂的生理机制主要在于，药物 与d n a 或r n a 起化学作用，或合成了不正常的原料( 核酸先成体) ，破坏了核酸的 结构，影响了蛋白质的合成，进而导致精巢和卵巢不能正常发育完成，从而引起了昆 虫的不育。但同时也有其它的作用机制，如秋水仙素可能对细胞分裂有直接影响而对 蛋白质合成无关，某些不育药剂只对雌虫有效而对雄虫无效，某些则对雌虫和雄虫都 有效。目前已被深入研究的不育剂包括烃化剂类、核酸代谢抑制剂类等，如六磷胺、 灭幼脲。 目前，致昆虫不育的药剂主要有具昆虫保幼激素作用的保幼炔 ( j h 一2 8 6f a r m o p l a n t ) 、烯虫酯( 可保持m e t h o p r e n e ) 、哒嗪酮类似物，以及具蜕皮 激素作用的药剂抑食肼( p d t 一5 8 4 9 ，虫必净) 、虫酰肼( r h 一5 9 9 2 、米螨，t e b u f e n o z i d e ) 和几丁质合成抑制剂等。这些特异性杀虫剂对人、畜无毒性，对害虫高效，是实现农 业害虫综合防治的理想药荆。目前在农业害虫防治中得到了广泛使用。 一系列组织学观察和生物化学测定表明( 陈霈，1 9 9 1 ) ，灭幼脲处理饲料在连续 饲喂粘虫m y t h i m n as e p a r a t a ( w a l k e r ) 雌蛾后，卵巢中d n a 、r n a 的合成及卵巢对血淋 巴中蛋白质的吸取均被促进，卵巢细胞核中d n a 、r n a 及蛋白质的含量均比正常雌 蛾增加，卵巢发育及卵子形成办被促进，产卵量正常。粘虫生殖系统未受灭幼脲的抑 制。胚胎发育阶段细胞核及线粒体中d n a 的含量均因雌蛾取食灭幼脲而降低，粘虫体 壁皮细胞缩小呈扁平形，无细胞核。 目前报道了部分具有抑制生长发育活性的植物，如楝科的印楝、苦楝，等。印楝 素( 谭卫红，2 0 0 4 ) 是一种具多种乍物活性的物质，如拒食、忌避、胃毒等，还具有 较强的生长发育抑制作用。川楝素和印楝素( 杨东升，2 0 0 2 ) 通过对家蝇生长发育和 ，殖能力的抑制，使其种群增长率降低。此外，鬼臼毒素和脱氧鬼臼毒素( 林瓒，2 0 0 5 ) 以小叶碟添加法饲喂粘虫后，两种化合物致使粘虫生长发育各历期均延迟，化蛹率、 羽化率、产卵量等均明显降低；茶枯( c a m e l l i ao l e i f e r a ) 、番石榴( p s i d i u mg u a j a v a ) 、 飞扬草( e u p h o r b i ah i r t a ) 、南洋楹0 l b i z i af a l c a t a r i a ) 、薄荷( m e n t h ah a p l o c a l y x ) 、蓖 麻( r i c i n u s c o m m u n i s ) 、假连翘( d u r a n t ar e p e n s ) 的乙醇提取物( 魏辉，2 0 0 4 ) 对小菜 蛾化蛹有显著的抑制作用( p 1 0 0 0 l x ) 。参考李广宏 等( 1 9 9 5 ) 的方法，收集小菜蛾蛹于产卵笼内，等成虫羽化后供以1 0 的蜂蜜水补充营 养。并在养虫笼中放盆新鲜甘蓝，外套保鲜袋供小菜蛾产卵。 饲养条件：大养虫笼为5 5 c m 5 5 c m x5 5 c m 的钢制笼，顶层、底层为不锈钢板，两 侧罩以1 0 0 亩不锈钢纱网；后面及正面为有机玻璃，正面有一直径为4 c m 的可旋转拨动 的玻璃门，通过这扇门可以向笼内所饲养的昆虫及植株提供蜂蜜和水。 产卵笼规格为1 5 e m 1 5 c m x3 0 c m 的小木笼，顶层、底部为木板，左、右两面为 1 0 0 目尼龙网，前、后两面为可上下移动的玻璃门。 2 2 实验方法与数据处理 2 2 1 喜树碱对小菜蛾的生物活性测定 2 2 1 1 触杀作用 采用微最点滴法进行。以二甲基亚砜将喜树碱配制为5 0 0 m g l 、7 5 0 m g l 、 1 0 0 0 m g l 、1 5 0 0 m g l 、2 0 0 0 m g l 五个浓度，以微量点滴器吸取药剂后点滴于小菜蛾 三龄幼虫的前胸背板处，点滴用量为0 2 1