（有机化学专业论文）磷试剂辅助下氨基酸成肽反应及其电喷雾质谱研究.pdf

摘要 摘要 氨基酸缩合成肽反应是生命起源过程中的一类重要反应，而磷元素在生命起 源和生命活动过程中占据着不可缺少的地位，因此进行磷化学与化学生物学的交 叉领域方面的研究对于揭示生命起源和生命活动中的化学机制，从磷化学的特定 角度阐明生命现象的本质有着重要的理论意义和学术价值。 本文深入研究了磷试剂辅助下氨基酸成肽反应的条件及其形成机理。具体包 括有机磷试剂辅助下氨基酸的成肽反应，无机磷试剂辅助下氨基酸的成肽、成环 肽以及成氨基酸氢磷烷的反应。并借助于电喷雾质谱、液相色谱一质谱联用等现 代分析手段，对产物进行了结构鉴定分析，总结了磷酰化多肽、环肽以及氨基酸 氢磷烷三类化合物的电喷雾质谱裂解规律。 本文研究了有机磷试剂辅助下硅烷保护的氨基酸在有机溶剂中的自组装成 肽反应，合成了具有较高生物活性的化合物一丝组二肽。并利用高效液相色谱一 电喷雾离子阱多级质谱联用技术对成肽产物进行了分离和鉴定。研究发现：在 丝组二肽的合成过程中，将生成几乎等量的副产物一组组二肽。分析阐述了组组 二肽的形成机理，首次提出不同的氨基酸五配位磷化合物之间存在着竞争反应的 机理，即丝氨酸五配位磷化合物可转化生成组氨酸五配位磷化合物，再进行亲核 反应而最后生成两种二肽产物。 本文研究了无机磷试剂辅助下非极性侧链氨基酸的自组装成肽反应。在三氯 氧磷或三氯化磷辅助下，氨基酸可以通过自组装反应形成多肽，且随着反应时间 的延长，所形成的肽链的长度也随之增加。升高反应温度、微波辅助、增强溶剂 极性等均对成肽反应有促进作用。三氯氧磷和三氯化磷辅助相比，氨基酸与三氯 氧磷的成肽反应速度e l - - - - - 氯化磷明显较快。研究发现：不但一氮基酸可以自组装 成肽，而且首次发现b 丙氨酸、n 一氨基异丁酸以及4 一氨基甲基环己酸等带有端基 氨基和端基羧基的化合物也可以在此条件下成肽，但p 一氨基酸的自组装成肽反应 速度比甜氨基酸的成肽速度慢。 郑州大掌博j 而鲁文 本文根据磷谱跟踪等实验结果，对自组装成肽反应机理进行了推测，认为三 氯氧磷辅助下氨基酸自组装成肽过程不只经历一种途经。静氨基酸的自组装成肽 过程可能经历了两种机理：一种是氨基酸羧酸磷酸混酐机理，另一分子的氨基 酸的氨基进攻羧酸磷酸混酐的羰基碳形成酰胺键，并脱去一分子羟基二氯氧磷； 二是氨基酸五配位磷过渡态机理，该过渡态具有磷酸一羧酸混酐键结构，使氨基 酸的羧基被活化，受到氨慕酸氨基的亲核进攻而形成肽键。q 氨基酸的自组装成 肽过程应主要经过途经二进行，其反应速度较怏。而对于b 一丙氨酸以及4 一氨基 甲基环己酸等带有端基氨基和端基羧基的化合物，可以依照氨基酸羧酸磷酸混 酐机理形成肽键，由于这些化合物形成的六元环五配位磷过渡态不稳定，因此不 可能经历氯基酸五配位磷过渡态成肽。 本文在研究无机磷试剂辅助下氨基酸成肽过程中，首次发现了环肽的生成且 分离鉴定了环肽的结构，通过改变反应条件提高了环肽的收率。并且对环肽的分 离进行了初步地探索，得到了较纯的环肽库，从中分离得到了环二肽和环六肽。 环肽库的建立增加了肽库的多样性，有可能为药物筛选提供新的选择性。另外， 在丙氮酸的反应体系中，分离得到了一类具有全新结构的衍生物，最终确认其结 构为含有桥环结构单元的环肽脱水衍生物。该研究表明无机磷试剂有望发展成为 一类新的、有效的环肽缩合试剂。同时利用电喷雾质谱对环肽的多级质谱裂解规 律进行了研究，对利用电喷雾质谱鉴定环肽序列提供了新的依据。 以氨基酸为起始原料与三氯化磷反应合成了一系列具有对称结构的双分子 氨基酸氢磷烷，利用核磁共振技术对氨基酸五配位氢磷烷的构型变化进行了研 究。发现在常温下，在定溶剂中氨基酸氢磷烷的不同构型之间存在着构型相互 转化的现象。同时利用离子阱多级质谱的功能对氨基酸氢磷烷的正、负离子质谱 裂解特征进行了详细地研究。 关键词：氨基酸，三氯氧磷，三氯化磷，成肽反应，环肽，反应机理，电喷 雾质谱，液相色谱一质谱联用，双分子氨基酸氢磷烷。 a b s t r a c t p e p t i d ef o r m a t i o ni s o n eo ft h em o s ti m p o r t a n tr e a c t i o n si np r e b i o t i ce v o l u t i o n m o r e o v e r , p h o s p h o r u sp l a y s a j li m p o r t a n tr o l ei np r e b i o t i ce v o l u t i o na n di np r o c e s so f t h el i f e t h e r e f o r e ，t h e i n v e s t i g a t i o no fp e p t i d ef o r m a t i o na s s i s t i n gb yp h o s p h o r u s r e a g e n t sw i l lb eh e l p f u lf o rt h e i rm e c h a n i s mo p e n i n g a n dm a ye l u c i d a t et h ee s s e n c eo f t h el i f ef r o mas p e c i a la n g l e i nt h ep r e s e n td i s s e r t a t i o n ，u s i n ge l e c t r o s p r a yi o n s p r a y m a s ss p e c t r o m e t r y ( e s i - m s ) a n dh i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y - m a s s s p e c t r o m e t r y ( h p l c m s ) ，w es t u d i e dt h em e c h a n i s mo fp e p t i d ef o r m a t i o nd i r e c t e d b yo r g a n i ca n di n o r g a n i cp h o s p h o r u sr e a g e n t s m o r e o v e r , t h em a s ss p e c t r o m e t r y c h a r a c t e r i s t i c so ft h er e l a t e dc o m p o u n d sw e r es t u d i e di nd e t a i l f o rt h es t r u c t u r a l e l u c i d a t i o n ，s o m en o v e lr e a r r a n g e m e n t sw e r eo b s e r v e da n dt h e r em e c h a n i s m sw e r e p r e s u m e d w i t ht h ea s s i s t a n c eo fh p l c e s i - m s m s ，t h es e l f - a s s e m b l yp r o d u c t so fs e r i n e a n dh i s t i d i n ep e n t a - c o o r d i n a t e d p h o s p h o r u sc o m p o u n d s w e r e s e p a r a t e da n d i d e n t i f i e d t h ee x p e c t a t i v ep r o d u c tw a ss e r y l - h i s t i d i n ed i p e p t i d e ，h o w e v e r , i tw a sf o u n dt h a t t h e r ew a sa l m o s t e q u i m o l a r a m o u n to fh i s t i d y l - h i s t i d i n e d i p e p t i d e a sw e l la s s e r y l - h i s t i d i n ed i p e p t i d e t h em e c h a n i s mw a ss p e c u l a t e dt h a tt h e r ew a sc o m p e t i n g r e a c t i o nb e t w e e np e n t a - c o o r d i n a t e dp h o s p h o r y ls e r i n ea n dh i s t i d i n ei nt h er e a c t i o n p r o c e s s a s ar e s u l t t w ot y p e so f d i p e p t i d ew e r ep r o d u c e d s e l f - a s s e m b l yp e p t i d ef o r m a t i o n d i r e c t e db yi n o r g a n i cp h o s p h o r u sr e a g e n t sf r o m a m i n oa c i d sw a s i n v e s t i g a t e d i nd e t a i l a m i n oa c i d s c o u l da s s e m b l ei n t o o l i g o p e p t i d e s a st h er e a c t i o nt i m ew a sp r o l o n g e d ，t h el e n g t ho f t h ep e p t i d e sw a s i n c r e a s e d i n c r e a s i n gt h er e a c t i o nt e m p e r a t u r e ，a s s i s t i n gb y m i c r o w a v e ，e n h a n c i n gt h e d o l a r i t yo fs o l v e n tw o u l da c c e l e r a t et h er e a c t i o nv e l o c i t yo fp e p t i d ef o r m a t i o n t h e r a t eo f p e p t i d ef o r m a t i o nm e d i a t e db yp h o s p h o r u so x y c h l o r i d ew a sa p p a r e n t l yf a s t e r 郑州1 大掌l 士论文 t h a na s s i s t e db yp h o s p h o r r i st r i c h l o r i d e n l er e s u l ts h o w e dt h a tn o to n l ye - a m i n o a c i d sc o u l da s s e m b l et oo l i g o p e p t i d eb u tp a l a n i n e ，2 - a m i n o 一2 一m e t h y l p r o p i o n i ca c i d a n d 4 - a m i n o m e t h y l c y c l o h e x a n ee a r b o x y l i ca c i d ，w h i c hi n c l u d e d a na m i n oa n d c a r b o x y lg r o u ps i m u l t a n e o u s l y , c o u l da l s op r o d u c ep e p t i d e h o w e v e r , t h er e a c t i o n r a t eo f0 【一a m i n oa c i d sw a sf a s t e rt h a nb a m i n oa c i d s a c c o r d i n g t oa b o v er e s u l ta n dt h et r a c k i n ge x p e r i m e n t so f 孔p n m r ，t h er e a c t i o n m e c h a n i s m so f s e l f - a s s e m b l yp e p t i d ef o r m a t i o nb yp h o s p h o r u so x y c h l o r i d ea c t i v a t i o n w a si n v e s t i g a t e d i tw a sp r o p o s e dt h a tt h e r e m i g h tb et w op a t h w a y s f o rp e p t i d e f o r m a t i o no fa - a m i n oa c i d s o n e p a t h w a y i s t h r o u g h t h et r a n s i t i o ns t a t eo f p h o s p h o r i c c a r b o x y l i ca n h y d r i d e t h ea m i n og r o u po fa na m i n oa c i d a t t a c k st h e c a r b o n y lg r o u po ft h et r a n s i t i o ns t a t e o fp h o s p h o r i c c a r b o x y l i ca n h y d r i d et of o r m p e p t i d e a n dl o s to n eh y d r o x y l p h o s p h o r u so x y c h l o r i d e m o l e c u l e t h eo t h e rp a t h w a yi s t h r o u g h t h et r a n s i t i o ns t a t eo f p e n t a c o o r d i n a t e dp h o s p h o r u sc o m p o u n d ，t h ec a r b o n y l g r o u po f t h e p e n t a - c o o r d i n a t e dp h o s p h o r u s t r a n s i t i o ns t a t ew a sa c t i v a t e da n dt h e nw a s a t t a c k e d b y a na m i n oa c i dt of o r mt h e p e p t i d e b o n d w e p r o p o s e d t h a tt h e s e l f - a s s e m b l yp e p t i d ef o r m a t i o no fa a m i n oa c i d sw a sm a i n l yt h r o u g ht h e s e c o n d p a t h w a y , h o w e v e r , 1 3 - a m i n oa c i d sa n d4 - a m i n o m e t h y l c y c l o h e x a n ee a r b o x y l i ca c i d c o u l dn o tf o r mt h ep e n t a c o o r d i n a t e dp h o s p h o r u st r a n s i t i o ns t a t e ，s ot h e ya s s e m b l e d i n t op e p t i d e so n l yb yt h ef i r s tp a t h w a y i nt h e p r o c e s s o f s t u d y i n g t h e p e p t i d e f o r m a t i o n a s s i s t i n gb yi n o r g a n i c p h o s p h o r u sa g e n t s ，w ef i r s t l yf o u n d t h ef o r m a t i o no f c y c l i cp e p t i d e sa n d i d e n t i f i e dt h e s t r u c t u r eo ft h e m t h r o u g ho p t i m i z i n gt h ec o n d i t i o no ft h er e a c t i o n ，t h ey i e l d so f c y c l i cp e p t i d e w e r ei n c r e a s e d t h es e p a r a t i o no f c y c l i cp e p t i d e sw a s a l s oi n v e s t i g a t e d i n d e t a i l c y c l i cd i p e p t i d ea n dc y c l i ch e x a p e p t i d e w e r ep u r i f i e df r o mt h e c y c l i c p e p t i d el i b r a r y t h ec o n s t r u c t i o no f c y c l i cp e p t i d el i b r a r yw o u l d e n h a n c ed i v e r s i t yo f p e p t i d el i b r a r i e sa n d i n c r e a s et h e p o s s i b i l i t yo fd i s c o v e r i n g n e w d r u g s i m u l t a n e o u s l y , t h en e wd e h y d r a t i o nd e r i v a t i v e so fc y c l i cp e p t i d eo fa l a n i n ew a ss e p a r a t e da n d i d e n t i f i e dt oi n c l u d et h e b r i d g er i n gu n i t t h es t u d i e ss h o w e dt h a tt h ei n o r g a n i c p h o s p h o r u sa g e n t sm i g h t b ean e wa n de f f i c i e n tc o n d e n s a t i o n a g e n t s t a r t i n g f r o ma m i n oa c i d sa n dp h o s p h o r u st r i c h l o r i d e ，s y m m e t r ya m i n oa c i d h y d r i d o p h o r a n e sw e r es y n t h e s i z e d 3 1 p - n m rw a su s e dt os t u d yt h ec o n f i g u r a t i o n c h a n g e so fh y d r i d o p h o m n e s i tw a sf o u n dt h a th y d r i d o p h o r a n ec o n f i g u r a t i o n sc o u l d b ec o n v e r t e dt oe a c ho t h e ra tr o o m t e m p e r a t u r ei ns o m es o l v e n t s i m u l t a n e o u s l y , t h e m s m s f r a g m e n t a t i o nc h a r a c t e r i z a t i o n s o fh y d r i d o p h o r a n e sw e r e i n v e s t i g a t e d i n d e t a i la n dt h e i rc o l l i s i o n p a t h w a y sw e r es u m m a r i z e d k e y w o r d s ：a m i n oa c i d ，p h o s p h o r u so x y c h l o r i d e ，p h o s p h o r u st r i c h l o r i d e ，p e p t i d e f o r m a t i o n ，c y c l i cp e p t i d e ，r e a c t i o nm e c h a n i s m ，e s i m s ，h p l c m s ，d i m o l e c u l a r a m i n oa c i d sh y d r i d o p h o r a n e 第一章绪论 第一章绪论 二十一世纪将是生命科学的世纪，生命科学涉及到每个人的健康和生活问 题；同时，生命科学中又有许多高尖端科学技术问题等待科学家去解决，生命的 起源与进化就是当代最难解决的科学难题之- - 1 3 1 。生命起源是研究地球或外星 球由非生命物质演变为原始生命的过程，以及如何用人为方法模拟原始条件出现 这一自然的过程。生命现象的本质是现代生物学讨论的焦点问题，在分子水平上 深入了解生命过程的本质已成为当前的重大科学前沿问题，而解决生物分子间相 互作用的基本规律，归根结底要从化学本质出发 4 , 5 1 。 1 1 磷与生命起源问题 地球起源于4 5 亿年前，那么地球上的生命是从何时开始，又是如何产生的 呢? 关于这个问题，曾经有过“外源说”和“内源说”的争论。前者认为地球上 的生命来自于宇宙空间中的“生命孢子”，后者认为是在地球的环境中自发产生 的。考虑到宇宙空间的恶劣环境，而且“生命孢子”也需要有一个起源，现在的 研究者们基本都采纳后一种观点。普遍的看法是生命起源经历了有机小分子起 源、生物大分子起源和细胞起源等几个阶段。 1 1 1 生命起源中的核酸学说和蛋白学说 蛋白质和核酸分别是生命中最重要的功能分子和信息载体，而氨基酸和核苷 分别是它们的最小结构单元，在生命起源的初期，这些单个的核苷和氨基酸是如 何形成一种具有遗传功能的对应关系引起了人们的广泛兴趣。蛋白质表达了生物 体的结构与功能，而核酸是遗传信息的载体，通过它携带的信息指导蛋白质的合 成。因此，对于现代的生命体来说，二者是“鸡”与“蛋”的关系。因此，在生 命起源问题上，也就有了“先有鸡还是先有蛋”的问题。 由于氨基酸在原始条件下比较容易生成嘲，生物体内绝大部分反应也都是由 郑州大学博士论文 蛋白质催化的，因此较早的时候人们倾向于生命起源于蛋白质的观点。f o x 用热 聚合的方法制得了“类蛋白”( p r o t e i n o i d ) ，而且生成的类蛋白物质具有某些催化 活性，在水中可以形成类似细胞的微球体17 1 。但是，蛋白起源说有一个很大的难 题就是无法解释蛋白质如何进行自我复制。c e c h 于上世纪八十年代发现了具有 催化功能的r n a 分子【8 】，此后又陆续发现了很多其它的这类分子，由此g i l b e r t 提出了“r n a 世界”( t h er n aw o r l d ) 的理论，认为生命起源于核酸，原始的核 酸不仅具有携带遗传信息的功能，而且能够催化必需的化学反应【9 】。 不论是核酸派还是蛋白派。基本出发点都是先形成某些具有功能( 催化作用1 的大分子，它们之间再以某种方式组合起来形成“有生命”的系统。磷是生物体 内重要的组成元素之一。遗传物质核酸的骨架就是由磷酸二酯键构成的，构成细 胞膜骨架的就是磷脂分子。现代生物体内的许多代谢活动都需要含磷化合物的参 与。例如能量代谢过程中最重要的中间产物被称为“能量货币”的a t p ( 三磷酸 腺苷) ，细胞信号传导的“第二信使”c a m p ( 3 ，5 环腺苷酸) 等。 而许多实验事实证明，磷在前生物条件下对生命分子，如氨基酸、碱基、核 苷、核苷酸、肽、寡聚核苷酸、核酸等的合成起着十分重要的作用。哈佛大学的 w e s t h e i m e r 教授从有机化学的角度阐述了犬自然为什么为生命选择了磷酸酯【l 0 1 ， 诺贝尔奖获得者t o d d 教授提出了“哪里有生命，哪里就有磷”、“只有在有磷 的星球上，才能存在生命”的著名学术论断 i u ，认为磷元素是生命存在的必要条 件。甚至于考察太空中生命迹象也用磷来作为判断标准【幢 。所有这些无疑都大大 激发了人们去探索在生命从简单分子到复杂体系这一漫长的进化过程中，磷是怎 样与组成生命的基本物质相互作用而逐步进化到现在这样精巧复杂的高等生命 的。所以，对予磷元素在生命起源过程中所起的作用还需要进行更全面深入的研 究。 1 1 2 “蛋白核酸共同起源”模型 a 一氨基酸和声、y 、6 等其它氨基酸平时看不出有什么不同，但是研究发现 第一辛绪论 当它们的氨基按上磷酰基团，形成- 磷酰一d 。氨基酸后，在水中及在有机溶剂中 能够自组装成肽【”_ ”，而- 磷酰印、y 一等氨基酸则不能自组装成肽。这是因为 _ 磷酰廿- 氨基酸的过渡态是一个五元环的五配位磷酸与羧酸的混酐，其中磷中 心被羧基激活，因此可以发生磷上酯交换反应；尤其与核苷的核糖上的c i s 2 ， 3 - d i o l 能发生两个酯交换反应，而把核苷转化为核苷酸【1 6 1 。除此之外，侧链有羟 基的- 磷酰丝氨酸、苏氨酸还能发生分子内磷酰基转移，生成d - 磷酰氨基斟1 7 。 另外。分子间的磷酰基转移反应也是可能的，例如n - ( o ，0 一二异丙基1 磷酰天冬 氨酸可以磷酰化胰蛋白酶【l8 1 。基于多年的研究，赵玉芬教授提出了“磷是生命化 学过程的调控中心”假说，认为磷是生命物质核酸、蛋白的主控因子。磷的化学 规律控制着糖( 核糖，核酸) 以及氨基酸( 蛋白质) 的化学规律，从而控制着生命的 化学进化，并提出了如图1 1 的模型： 一氨基酸+ 磷酸一 一n 氨基酸+ n 磷酸卜一 酸 核酸 蛋白 图1 - 1 核酸与蛋白共同起源的模型 基于多年的研究，赵玉芬教授提出了以磷酰化氨基酸为基础的“蛋白一核酸 共同起源”假说“6 , 2 0 , 2 1 1 。认为肽和核酸共同起源于磷酰化氨基酸，即原始地球上 的高能磷化合物与氨基酸反应的产物。由于原始地球火山活动频繁，焦磷酸盐、 焦磷酸酯类化合物很可能在地表积累，这些化合物中的p - o p 键含有的能量，通 过与氨基酸形成p - n 键这一中间过程，最终转移到肽键和核苷酸的磷酸二酯键 3 蕃 郑州大掌博士论文 中。因此。n 一磷酰氨基酸可以作为一种反应模型，以此来研究生命起源过程中的 很多未解之谜，例如手性起源，遗传密码起源等等。这一观点已经在国际上引起 了广泛地关注【2 2 1 。 1 2 生命起源中成肽过程的研究 生命起源是现代科学三个前沿问题( 天体演化、生命起源、基本粒子理论) 之 一。在生命起源中的化学进化过程中，由生物小分子组装成生物大分子是生命起 源漫长历程中的一个重要环节。组成生命的基本物质一蛋白质和核酸是生命体中 最重要的生物大分子。蛋白质是生命体系中最主要的功能分子，而氨基酸则是蛋 白质的基本结构单元。在生命起源初期，这些单个的氨基酸是如何组装成肽、进 而形成蛋白质的，一直是人们探求的关键问题。 研究者们进行了大量地探索，研究如何从氨基酸单体缩合形成肽和蛋白，其 中能量的来源主要是热能和化学能。此外还有一些假说，认为先是非氨基酸的小 分子聚合成为链状多聚物，再由其他反应形成侧链。基于1 9 5 0 年u r e y s 的观点 1 2 3 ，s t a n l e ym i l l e r 的实验结果显示，包含甲烷、氢气、氨、水和其它一些简 单的小分子的气体在原始地球的条件下受到放电和热能的作用可以生成氨基酸， 并由此奠定了“生命起源化学”的基础。后来m i l l e r 的实验结果被不同的研究组 在不同的实验条件下( 不同的大气组成，不同的能量源等) 重复出来，著且可以生 成更多的前生命小分子，如糖、核苷碱基等2 5 , 2 6 1 。因此，对原始条件下成肽的研 究依然集中在氨基酸缩合聚合反应上。从氨基酸缩合成肽的反应是可逆的，正反 应需要脱去一分子水，在水溶液中是一个热力学上不利的反应，a g 为8 - 1 7 k j m o l ，因此需要有能量的来源。在生物体内合成时的能量来源是a t p ，那么， 在生命起源的过程中，形成肽键的能量从何而来? 具有催化功能的肽或蛋白如何 演化形成? 这些都是需要进行大量的实验研究。迄今为止，关于原始条件下肽键 的形成人们进行了大量的研究，提出了氨基酸“缩合反应”主要归为三大类2 7 】： 涉及融化过程的氨基酸缩合；涉及矿物催化的非均相氨基酸缩合以及由不同缩合 试剂诱导的均相氨基酸缩合。 4 第一章绪论 1 , 2 1 涉及融化过程的氨基酸缩合 克服在水溶液中脱水反应障碍的一个通用方法应该是让溶剂不断地挥发，然 后继续加热使残余物变为熔融状态。此类条件在原始条件下也是可能存在的。例 如岸边或礁湖，由于涨潮落潮的循环和阳光、地热的作用，水份不断蒸发，各种 物质包括氨基酸和无机盐类都在局部富集。这样，反应物氨基酸的浓度增大，而 水的活度下降，从而有利于成肽反应的发生。f o x 将氨基酸的混合物在1 6 0 2 0 0 的无水、氮气保护条件下加热，得到了聚氨基酸，其中有许多性质类似于现代 的蛋白质，被称为“类蛋白” 2 8 , 2 0 】。在此温度下氨基酸融化但不会分解。若是在 浓磷酸的存在下，可以使温度大幅度降低，但是在前生命条件下，如此浓的磷酸 存在的可能性几乎是没有的。而且此类“类蛋白”中仅仅含有少量的肽键，其结 构和蛋白的结构是相差较大的。 1 2 2 矿物催化氮基酸缩合 在前生命条件下，第二类氨基酸脱水成肽反应涉及到地球表面矿物质的催化 1 3 4 1 ，尤其是地球上较早出现的粘土作为催化剂1 3 5 , 3 6 1 。从理论的角度许多实验已 经证明了在此条件下形成肽的可能性 3 0 , 3 7 , 3 8 】，矿物表面能吸附氨基酸、核苷酸等 小分子，催化它们聚合形成肽、寡聚核苷酸。r o d e 等的研究表明，三十面体的 蒙脱石( s m e c t i t e ) 是催化活性最好的矿物之，具有催化活性的基团是表面的 a i o h 和s i o h 。他们在成肽反应体系中加入粘土类矿物，得到了更长的肽和更 高的产率，并且产物的水解也减少了。例如以丙氨酸为起始物时，锂蒙脱石 ( h e c t o r i t e ) 作为矿物催化剂时得到o 1 的寡聚产物，而高岭土( m o n t m o r i l l o n i t e ) 作 为矿物催化剂时没有寡聚产物产生。在具有催化活性基团的a 1 o h 和s i - o h 的 表面，丙氨酸则分别以o 9 和3 8 的转化率生成了丙丙二肽和环丙丙二肽 3 5 , 3 6 ， 矿物表面活性位点的形成和矿物表面氨基酸活化的机理见图l 一2 口。 郑州大学博士论文 a , c h 3 咚，哒n h 。 b d 二一 x i ，o 戈 7 1 h e a t i n g - h 2 0 o h 3 ，c h n h 2 导。彤 7 八l 图1 - 2 矿物表面活性位点的形成( a ) 和矿物表面氨基酸活化的机理( b ) 虽然在早期的工作中形成的寡肽通常仅依靠红外光谱检测【4 们，鉴定结果不是 十分确定，但是近期的工作已经清晰地证明，在成肽反应中由少数几种较简单氨 基酸( 最主要的是甘氨酸) 的反应是成功的，虽然反应的产率很低，但它对前生物 条件下肽的形成还是有一定意义的【4 1 , 4 2 。和其它的氨基酸缩合反应相比，在氨基 酸成肽的过程中尽管矿物粘土催化所起的作用相对较小，但是此类催化剂在后续 的进化过程如肽链延长= 以及抑制肽类化合物水解中也许起到了更重要的作用。 1 2 3 缩合试剂诱导氨基酸缩舍 早期的研究者提出了一些可能用于生命起源的缩合试剂，包括氰氨、= 氰氨、 氰基胍、二氨基马来腈、咪唑等。以氰氨为例，它可以由紫外光照射n h 4 c n 水 溶液或v 射线照射k c n 水溶液生成，在星际空间也已观测到它的存在。它在酸 性条件下可以与氨基酸的羧基反应使之活化，继而发生成肽反应( 图1 - 3 ) 4 3 o h 2 n c - - n ! 二一- h 2 n c 三h l h h 2 n - c = n h h 2 内= c = n h +曰 n n h 2 h 。i ：j 一早m 岂一。+ h 2 n - 3 = n h h s “r 。 c 、n l qrh12r r 1 。 瞄一乒。一心呲肾点c 脯o 删一“- c r “o 州一旷o 叫，o 冀 图1 - 3 氰氮催化氨基酸的成肽反应机理 一影小 心 啃们 岁 o 川 o h 戈们 第一章绪论 刘日河等人发现氧化- 酰化反应( o x i d a t i v ea c e t y l a t i o n ) 能以很高的产率生成 肽键。硫代乙酸本身用作酰化试剂产率极低( o 5 ) ，但是当加入弱氧化剂如 - 1 2 ， f e ( c n ) 6 ”或f e 2 + 0 2 ( 即在氧气存在的条件下加入f e 2 + ) 时，它迅速被氧 化为二聚硫代乙酸( 通过二硫键连接) ，这是一个很好的酰化试剂，常温下它能迅 速地定量酰化氨基。这样的反应物和反应条件在前生命时期是完全可能存在的 ( 图1 4 ) 4 4 1 。 o r c s h 【。】 0 卜岂一s 乇 r 一n h 2 + ( r _ 垦一s 乇二盐一卜0 8 一h n 唰+ r 0 3 一s s h r 一n h 。 + r 一富- - s s h 堡，r g h n r + h s s h 图l - 4 氧化酰化反应导致成肽的过程 w a c h t e 砷a u s e r 等人的研究发现共沉催化剂( n i ，f e ) s 和c o ( 压力约为1k b a r ) 以及h 2 s ( 或c h 3 s h ) 共同作为催化剂及缩合剂，在1 0 0 ( 2 、p h = 7 t 0 水溶液的厌 氧性条件下，氨基酸可以被活化从而缩合成肽。某些氨基酸在不同的条件下生成 不同构型二肽的总收率为o t 2 5 。并且实验还发现，在此条件下氨基酸的缩合 以及二肽的水解为一平衡反应，同样条件下二肽也会发生明显的水解。同时也提 出了氨基酸在( n i ，f e ) s 和c o 以及h 2 s ( 或c h s s h ) 共同催化下合理的缩合机理( 图 l 一5 、 4 5 1 。 但是以目前的观点，在早期的地球上( n i ，f e ) s 、c o 以及h 2 s ( 或c h 3 s h ) 共 同存在可能是局域性的，不具有普遍性，况且如此高浓度的c o 存在的可能性更 是令人怀疑的【4 引。另外未有报导显示在这样的条件下可以形成氨基酸，因此就提 出了一个新的问题：在肽的形成之前氨基酸是如何进化而来的。 a a矗a s 一、 r 、o c 卜t c - o h 。 h n 、- - s h 1 i 8l ij r 、c r c 妒 h n 、c s n 妒 8 h | + a al + a a r 、o i r l c h c n c h c o o h h h 、c o h o 。 a 卜 ， a a a a c 0 2 r 、o l l r l c h c n c h c o o h h n h c = o h l b h c o o h 圈1 - 5 ( n lf e ) s 和c o 以及h 2 s ( 或c h 3 s h ) 催化氨基酸成肽反应机理 ( a a ：氨基酸：a a - a a ：二肽；? ：未知中间体) c o m m e y r a s 等发现氮氧化物也可能成为o 【- 氨基酸成肽的缩合剂- 他提出的 成肽途径是：甲醛、氰化氢和氨反应生成氨基甲酰心氨基酸，它与氮氧化物反应 生成氨基酸- 羧基混酐，混酐可以在弱碱性水溶液中聚合成肽( 图1 - 6 ) 【4 7 】。 h 2 0 p h 7 - 8 n 怍卜o h 、n 2 + h 扣 o t i 、 o ” 一书m r h 宅七h 卜r r 图1 - 6 氮氧化物与n 氨基甲酰氨基酸反应成肽的过程 电 一 p 令旷一 。 一 ；+ l 氘 丫。f 旷一 爿 令。 弋西w 专舀。 第一章绪论 近年的研究表明，在海底热泉附近形成的温度梯度也可能有利于有机物的形 成。处于数百个大气压下的海水，温度从热泉喷口处的4 0 0 c 迅速降到周围环境 中的0 c 左右，在这样的温度梯度下，氨基酸可以缩合成肽。k m a t s u n o 等人模 拟海底热泉的条件下获得了有趣的结果：甘氨酸在1 0 0 m m 的较低浓度下，自发 生成了小肽。在加入二价离子如c u ”以后，获得了六肽。在这个实验中，由氨基 酸生成肽的热力学平衡在高温高压下可能更偏向于成肽一边，而在高温反应器中 生成的肽进入低温容器中时由于迅速冷却而来不及发生水解反应 4 。l u i s i 等人 的研究表明，脂质体的磷脂膜也可以促使氨基酸和肽的进一步缩合，并且磷脂膜 对疏水性的氨基酸和肽往往有较好的选择性 4 9 】。 在前生命条件下氨基酸缩合成肽的研究中，一个全新的完全不同于以往研究 的新论点为无机盐诱导成肽( s a l t i n d u c e dp e p t i d ef o r m a t i o n ，s p f ) 。即在高浓度的 无机盐溶液( 最常见的是氯化钠) 中，金属离子周围的水分子数目不足以达到饱 和，那么这些“不饱和”的阳离子就有可能作为脱水试剂使用，因此能使成肽反 应的平衡向脱水方向移动。基于这样的想法，利用氯化钠作为脱水试剂在氨基酸 缩合成肽的研究中开展了大量的工作5 。另外的一些理论研究工作显示二价的 阳离子可以通过和反应物的络合降低活化能，使反应进行得更快，包括碱土金属 离子和过渡金属离子。研究显示在甘氨酸和丙氨酸的缩合成肽反应中，以铜离子 为催化剂可以获得较好的结果【2 7 , 5 2 5 4 1 。这类新的反应称为无机盐诱导成肽，并且 这是迄今为止在水溶液中最简单的成肽方法。但是由于分析方法的限制，尤其是 由于标准品的缺乏，在这类实验中检测到的肽链较短，目前七肽是反应几天后鉴 定出的最长的肽。 具体的反应过程可能是经过如下机理：氨基酸( 以甘氨酸为例) 与二价铜离子 形成螯合物，另一分子氨基酸以羰基氧成为铜离子的另一个配体，在中心铜离子 和另一配体水分子的共同作用下，经过质子转移和亲核反应生成甘甘二肽( 图 1 7 1a 妙h x o 甜7 hh 型l 。斟支“扣。、h 些一么釜争砷3 h ，0 、h i k - g l y - g 1 7 h 、n ，h h 、p 丫p 瞄勺；j j 穗2 + 吾钆“ hh h ，o 、。 图1 7 铜离子催化无机盐诱导成肽反应的机理 1 2 ，4 含磷化合物诱导氨基酸缩合 除了以上所述的各类氮基酸成肽的缩合试剂，含磷化合物( 主要是多聚磷酸 盐类) 是生命起源中氨基酸进化成肽的另外一类重要缩合试剂。1 9 9 6 年，荷兰的 a ws c h w a r t z 在第1 1 届国际生命起源会议上说，由于地球表面上磷的唯一来源 是磷灰石，溶解度太低，不足以构成生命所需的磷。他们在默奇逊陨石中鉴定出 烷基膦酸的存在，提出外源空间磷的来源，提供了早期基因物质来源的可能。 1 9 9 7 年e m a c i a 在有关原始生命条件下磷的来源及作用综述中提到：磷在前生 命起源条件下在地球上是存在的，并推断其可能是由彗星把磷引入了地球 5 们。 1 9 8 3 年王文清用c h 4 、n 2 、n h 3 、h 2 0 、p h 3 组成的混合气体进行了氨基酸的前 生物合成 5 7 , 5 8 1 ，并与不含p h 3 的c h 4 、n z 、n h 3 、h 2 0 气体放电作了对照。对于 含p h 3 的体系放电后产生了1 9 种氨基酸，而不含p h 3 的体系却只生成了6 种 氨基酸。这一实验结果表明：磷可能在生命起源中早期的有机物合成阶段对氨基 酸的形成起重要作用，p h 3 可能是化学进化过程中气相和水相中的催化剂，因此 人们对在氨基酸缩合成肽的过程中含磷化合物所起的作用进行了广泛地研究。 f o x 5 9 j 将把磷酸加热所产生的聚磷酸用于氨基酸的缩聚合反应，发现在6 s 可以发生氨基酸的缩聚合。这里磷酸具有脱水和催化的作用。但在同样条件下， 1 0 第一章绪论 浓硫酸却不具有这种性质。由此可见，磷对于肽的合成具有重要意义。 f