多倍体诱发及细胞学鉴定 山东大学.doc

山东大学实验报告 2014年 4 月11日科目 遗传学实验 题目 多倍体诱发及细胞学鉴定 多倍体诱发及细胞学鉴定摘要 多倍体是指由受精卵发育而来并且体细胞中含有三个或三个以上染色体组的个体。多倍体育种在目前的植物育种领域相对较广。本实验对大蒜根尖组织人工进行秋水仙素处理，使其成为多倍体，再经固定、解离、染色和压片制作成大蒜根尖分生组织临时装片。通过在显微镜下观察染色体的形态和数目，从细胞学上鉴定诱导是否成功，从而掌握人工诱导多倍体植物的方法和利用染色体分析鉴定多倍体细胞。1. 引言1916 年Winker1在研究Salanum nigum嫁接时从愈伤组织得到了四倍体植物，首先引入了多倍体这一概念。多倍体育种是指利用人工诱变或自然变异等，通过细胞染色体组加倍获得多倍体育种材料，用以选育符合人们需要的优良品种。自然界中大约有3035的被子植物，其中70的禾本科植物属于多倍体，它们在植物进化中起了重要的作用。多倍体具有以下特性：巨大性：随着染色体加倍，细胞核和细胞变大，组织器官也变大；可孕性低：部分多倍体（例如三倍体）是高度不孕的，会表现为无籽且种子皱缩的现象；适应性强：植物多倍化不仅能使植物基因活性及酶的差异性增强，而且还增强植株的生态适应性、对逆境的抗耐性；有机合成速率增加：多倍体有多套基因，新陈代谢旺盛，酶活性加倍，利于提高有机物的合成速率；克服远缘杂交的不结实性等。多倍体能够通过合子染色体数加倍、植株分生组织内细胞的染色体加倍和生殖细胞的染色体加倍来形成。自然界中，多倍体的产生多是适应恶劣环境条件的结果。其产生的原因是由于温度骤变，细胞分裂时染色体不分离或染色体分离而细胞没有分裂，导致体细胞染色体加倍。在人工诱导的过程中，多倍体形成大多数是由分生组织细胞内的染色体加倍后所产生的结果。人工诱导多倍体的方法主要有：（1）物理方法：温度剧变、机械损伤、各种射线处理等；（2）化学方法：各种植物碱、麻醉剂、植物生长激素处理等。其中，最常用、最有效的多倍体育种方法是用秋水仙素或低温诱导来处理萌发的种子或幼苗。秋水仙素能抑制细胞有丝分裂时形成纺锤体并抑制细胞板的形成，但不影响染色体的复制，使细胞不能形成两个子细胞，而染色数目加倍。本次实验用秋水仙素处理常见的大蒜根尖材料使其成为多倍体，经过固定、解离、染色和压片等步骤制作临时装片，并在显微镜下观察染色体数目和形态。2. 材料和方法2.1 实验材料 材料：大蒜显微镜，刀片，镊子，解剖针，载玻片，盖玻片；0.15%秋水仙素溶液，卡诺氏固定液，蒸馏水，70%乙醇，1MHCl，染液：改良苯酚品红。2.2 实验方法2.2.1 获取实验材料取大蒜的发根至0.5-1cm，然后转入盛有0.15%秋水仙素水溶液的培养皿中继续培养24小时，待观察到根部有膨大时取出固定。固定时间最适宜选在下午5-6点，染色体凝缩至最短。与在水中培养的材料做对照。（一般植物的生长周期17-18小时）2.2.2 固定将植物根尖材料至于卡诺固定液中固定24小时，移至70%乙醇中保存或备用。2.2.3 解离植物的分生组织需要经过处理以便除去细胞之间的果胶层并使细胞壁软化，经解离的组织才能顺利压片。解离常用方法有：（1）酸解法：固定好的材料用清水洗涤一遍，用1mol/L HCl在60水浴恒温处理5-10min。然后水洗三次。一定要掌握好酸解过程的温度和时间。若解离不够，则压片不易分散；若解离太过，则下一步处理材料时会因材料过软而易丢失。（2）酶解法：用10-20g/L的果胶酶或与10-50g/L的纤维素酶混合使用。2.2.4 染色 在解剖镜下切取一小段根尖分生组织区，用改良苯酚品红溶液染色15Min。2.2.5 压片将染色后的材料盖上盖玻片，用一个双面刀片插到盖玻片和载玻片之间的一个小角，盖上两层吸水纸，用左手食指紧压盖玻片防止其滑动，用右手用解剖针针柄轻敲盖玻片，使材料均匀分散。再将刀片撤出，用针柄重新敲盖玻片，使细胞更好地分散压平。在显微镜下粗略观察，若染色体基本展开，则用拇指垂直按压装片；若细胞均未展开或展开不完全，则在玻片下滴几滴清水后重新敲片直至其分散开来。2.2.6 镜检镜检时先用低倍镜进行观察，找到分散较好的染色体再转用高倍镜观察。3. 结果3.1 实验结果图 图1 低倍镜下的染色体（10X10）图2大蒜根尖分生区四倍体细胞染色体图（32条，10X40）图3 大蒜根尖分生区二倍体细胞分裂后期染色体图（10X40）3.2 实验结果分析根据图1，总体来看实验结果一般，部分细胞已分散开来，细胞质着色较浅，背景清晰无过多杂质。由于敲片力度的不均匀导致有些细胞中染色体断裂而有些细胞中染色体仍旧成一团。观察图2中的染色体，可以较清楚的数出有32条染色体，是分裂前期的四倍体细胞。但仔细看发现染色体略微有些不处于同一平面，不过不大影响观察计数。图3中是另一张装片的染色体，由于染色过浅且染色体有重叠，观察具体计数比较费劲。根据染色体的形态和排列方式看，细胞可能处在分裂后期，大致估计是16条染色体的二倍体。4. 讨论4.1注意事项及改进之处：（1） 压片时不应在材料上方直接敲击材料，而是在材料的边缘通过敲击盖玻片的震动使材料细胞均匀分散。敲击过程需要耐心，否则容易出现染色体断裂或是细胞分散不均匀的情况。（2） 多倍体植物具有巨大性，所以制片时应该选择较粗的根尖，其中多倍体细胞相对较多。（3） 酸解过程中要掌握好时间和温度，若解离不够，则压片不易分散。若解离太过，在下一步处理材料时由于材料过软而易丢失。（4） 染色的时间需要掌控好，注意不要让染液干了，如果染液偏干，应补加染液。4.2 扩展知识根据查找文献知2，植物多倍体诱导过程中出现嵌合体的现象是经常的，即一部分细胞或器官为二倍体，而另一部分则为多倍体。在诱导过程中，二倍体向多倍体转化，如果处理时间短、浓度低，在解除处理后二倍体细胞多于多倍体细胞，在竞争中具优势，则产生回复突变，细胞或器官经继续分裂生长后均回复为二倍体，诱变没有效果。随着处理时间延长，二倍体细胞数目越来越少，多倍体细胞数目越来越多，当多倍体细胞数量明显多于二倍体细胞时，去掉诱导剂的抑制作用，多倍体细胞在与二倍体细胞的竞争中处于优势时，则形成多倍体生物个体。当然，当诱变剂浓度过高或处理时间过长时，虽然被诱导的生物体细胞均变为多倍体或高倍体，但细胞活力近于丧失，难于恢复分裂能力而死亡。参考文献1 Winkler H. Ueber die experimentelle Erzeugung yon Pflanzen mit abweichenden Chromosomenza