（植物学专业论文）利用萤光酶研究植物启动子和植物抗逆性.pdf

独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指垂羹氢攀蒌塞雾霎蓊瞄萋蕈鬻，韵缝雾襄塑羹票 蔷爱霎鬟冀琵蓁薰墓蚕鋈羹茄簦鏖；颡鬻篓冀蘩蓁醴| 翥，裁 燮雾翼雾登雾萋冀霾墅雾二羹重雾羹| 蘑醋翼翼蓁篓雾纛萄篱蓁篓雾丝菰巍嚣堑 窝；氇簿冀霉藉雾蓁雾型蕊鬻攀变蠹酝搽饕薹丽鹾鬟鏊雨塞羹雾壅季冀霸耄矍 鲤 6 ) m e s t ig a t i o no fm ee n d o s p e m l - s p e c i f i c s u c r o s es ) ，r l m a s ep r o m o t e r 丘0 mr i c e1 l s i n g 吣i en te 】【p r e s s i o no fr 印o r t e r 答m e s i i lg u a rs e e dt i s s u e 讹以fc 棚胄印( 2 5 ) ：1 0 3 5 -l0 4 2 【2 5 】m e d i i l aj ，r o “g u e z f r a n c om ，p e i l a l os aa ( 2 0 0 5 ) 舡a b i d o p s i sm u t a i l _ t s d e r e g u l a t e di 1 1r c l 2 ae x p r e s s i o nd e v e a ln e ws i 弘a l i n gp a t i l w a y si na b i o t i cs 臼e s s r e s p o i l s e s 胁以f 乃口朋以( 4 2 ) ：5 8 6 - 9 7 。 【26 】m a y e r h o f e rr ，l a l l 鲥电e 、砌t ，c o m l i e rm j ( 1 9 9 5 ) e x p r e s s i o no f r c c o m b i n 跹t 风蕊1 1 a1 u c i 细弱ei i l 订粗s g e i l i cp l 孤t sr e s u l t si nl l i 曲l e v e l so fl i g h te i i l i s s i o n j 饧耐乃以朋以( 7 ) ：1 0 3 1 1 0 3 8 【27 】n i l l gs ，碰e g e r - l i s z k a ya s c h r o d am ( 2 0 0 7 ) ar 印o n e rs y s t 锄f o rt 1 1 e i n碰v i d u a ld e t e c t i o no fh y d r o g e np e r o x i d e 孤ds i i l 9 1 e to x y g c n ：i t sl l s ef o rm e 嬲sa yo fr e a c t i v e o x y g e i ls p e c i e sp r o d u c e di n v i v o 砌p 胁刀f 乃以朋以 ( 5o ) ：4 7 5 4 8 7 山东师范大学硕士学位论文 利用萤光酶研究植物启动子和植物抗逆性 摘要 从北美萤火虫中分离到的萤光酶是一个分子量为6 1 k d a 的单体蛋白并且酶 的活性不需要翻译后加工。因其检测方法上的优势而广泛应用于研究植物基因表 达和细胞生理活动，如启动子活性、转录因子、细胞间信号转导、m r n a 加工、 蛋白折叠和蛋白间的相互作用。这些应用已经涉及生物学的各个领域，如动物学 研究、环境监测和植物分子生物学。萤光酶作为报告基因在转基因植物中的表达 水平和启动子活性密切相关。在植物体内，分子伴侣的作用是，防止蛋白质前体 积累并协助蛋白质跨膜转移，与未折叠蛋白质形成络合物以维持其转移能力，维 持蛋白质的正常折叠状态，促进错误折叠的蛋白质降解，在蛋白质从头折叠及应 激条件下能起到稳定多肽链，防止蛋白质失活的作用。利用分子伴侣在网织红细 胞裂解物体系中可以在迅速恢复热变性的萤火虫萤光酶的活力的特点已经成为 研究分子伴侣的功能模式实验体系。为了进一步研究不同启动子的功能和分子伴 侣在蛋白折叠解聚方面的作用，我们构建了不同的植物表达载体转化拟南芥，并 对转基因拟南芥的萤光酶活力进行检测和分析。本文主要结果如下： 1 构建双架载体转化拟南芥研究植物启动子的活性 萤火虫和海肾萤光酶进化起源、酶结构和底物不同，因此可以在同一溶液中， 利用它们的发光条件和发光底物不同，选择性的检测两种萤光酶活性。双架载体 分别用两个不同启动子驱动萤火虫和海肾萤光酶，通过分别检测两个萤光酶的活 力分析启动子的活性。外源基因在转基因植株中的表达水平会因整合位点的不同 而变化，这称之为位置效应。在同一在载体中使用两个萤光酶报告基因转化拟南 芥的优点在于消除了由于插入位点的不同而产生的位置效应。我们构建 a c t 7 一d u a l l u c p b l l 0 1 和c a m v 3 5 s h s d i7 a i ，l u c p b l l o l 植物表达载体， 通过农杆菌渗透法侵染拟南芥，卡那培养基上筛选出抗性苗后提取基因组d n a 进行p c r 扩增。检测结果表明植物表达载体已经整合到拟南芥基因组中，得到 了转双架载体的拟南芥。双萤光酶报告基因载体为在拟南芥中利用稳定转化研究 不同启动子的活性提供了一个简单可靠的方法。 2 利用萤光酶高温变性的特点研究分子伴侣的功能 本实验室最近分离到一个热敏感突变体，为了研究其热敏感的机制，我们构 山东师范大学硕士学位论文 第一章文献综述 分析植物对于胁迫的反应，研究其反应的生理及分子机制，不仅对揭示植物 耐逆的机理有重要的理论意义，而且对于抗逆作物的培育，具有重要的实践意义。 基因表达调控的机理是当今分子生物学研究的热点和前沿。基因表达的程序、时 间和位置在不同层次上受不同调节因素的控制，这种控制机制不仅决定基因的表 达水平而且还决定基因表达的时空顺序。在这个十分复杂的调控过程中，启动子 的调控在转录环节中占有十分重要的地位，分子伴侣参与的新生肽链的折叠和变 性蛋白的复性对于蛋白质的功能至关重要。因此，研究启动子的功能和植物抗逆 性的原理不仅具有重大的理论意义，而且还对基因工程产业化发展具有重要的现 实意义。 一、萤光酶研究进展 自然界中多种生物都有发光特性，如发光甲虫，海洋生物，发光细菌等，其 中研究最为深入的就是北美萤火虫( 舶d 巧玎珊乃朔凰_ ) 萤光酶( f u 圮) ( e c 1 1 3 1 2 7 ) 。萤光酶发光系统分析技术随着理论研究的深入以及试剂和仪器的商 品化，已经逐步地应用到医学、生物化学、分子生物学、微生物学、环境科学等 多个学科。 1 萤火虫萤光酶的基本特点 1 1 萤火虫萤光酶发光特性 萤火虫萤光酶在m 孑+ 、a ，i p 、0 2 存在和合适p h 时，催化d 萤光素 ( d l u c i 矗抽n ) 氧化脱羧，同时发出黄绿色光，并且在5 6 0 n m 处有一个峰值【1 】， 催化的反应如下： 1 l u c + l l 】西蠡妇地艘( l u c 蛔d 矗矗n 叠+ m 妒p l 2 伍u c h “蛹n 怂研0 2呻傩y l u c 翻坩怂固) 十c o ： 3 ( l 1 o x y k i 触参触研 _ l u c o x y 妇妇l i n 怂斜+ 触 4 a 奠定o 瑚t l c 赶酗掌a l u c + 【v b c j 蠡譬i i l + a 图1 萤火虫萤光酶催化的反应【2 1 。 步骤1 是一个快速的平衡反应：步骤2 是一个氧化脱羧反应，同时伴随激发态的氧化型萤光素 山东师范大学硕士学位论文 的产生；步骤3 是在5 6 2m 处快速产生光子的过程：步骤4 是产物从萤光蛋白活性位点的缓慢 释放过程 f i g 1 t h e6 r e n yl u c i f e r a s er e a c t i o n s t e p1i saf a s te q u i l i b r i u mr e a c t i o n s t e p2i st h eo x i d a t i v e d e c a r b o x y l a t i o n ，i nw h i c ht h eo x y l u c i f 色r i ni se x c i t e d s t e p3i st h ef a s tp h o t o ne m i s s i o na t5 6 2n m s t e p4i st h ev e r ys l o wr e l e a s eo fp r o d u c t 丘o mt h ea c t i v es i t eo fm el u cp r o t e i n 这个反应十分迅速可在几秒内完成，也可以发生在细菌和无细胞体系中。在 萤火虫体内发生在一种特化的光器官的过氧化物酶体中。在没有d 萤光素或浓度 很低的情况下萤光素酶也可以催化l 萤光素发出闪光【3 1 ，光的量子产量依赖于 a t p 的浓度，当a t p 的浓度大于8 m m 时产生闪光，而当a t p 浓度小于1 m m 时产生 的光量子保持稳定 4 】。在萤火虫体内发生在一种特化的器官的过氧化物酶体中。 1 2 萤火虫萤光酶结构及其生化特性 北美萤火虫含5 5 0 个氨基酸，分子量约6 2 k d 的单肽，萤火虫萤光素酶有一个 独特的立体结构，由一个大的n 末端序列( 1 4 3 6 个残基) 与小的c 末端序列 ( 4 4 0 5 5 0 个残基) 构成，两者之间通过一小段的肽链连接，大部分发光相关的 关键氨基酸位于n 端，c 端结构域的l y s 5 2 9 对于底物定位起关键作用，纯化的n 端结构域仍能结合底物萤光素和a t p ，并且保持野生型o 0 3 的发光活性【5 1 。 图2 萤火虫萤光酶的结构6 】 大的n 末端序列( 1 _ 4 3 6 个残基) 与小的c 末端序列( 4 4 0 5 5 0 个残基) 之间通过一段小的铰 链连接 f i g 2 i u b b o nd i a 铲锄o ft h ef i r e n yl u c i f e r a s es t m c t u r e t h e1 a r g en t e m l i n a ld o m a i n 锄i n o a c i d s1 4 3 6i sc o n n e c t e dt ot h es m a l l e rc t e i n l i n a ld o m a i na m i n oa c i d s4 4 0 5 5 0s h o 、v ni ny e l l o w t h r o u g has h o nh i n g ep e p t i d e 萤火虫萤光酶的活性不需要翻译后加工，一旦翻译就立即产生报告活性。酶 6 山东师范大学硕士学位论文 对温度【7 】和p h 变化反应极其敏感，p h 为6 时产生红光而p h 为8 时产生黄绿光【引。 c o a 能显著提高萤光酶的活性，并促进光的产生，可能是由于c o a 能促进萤光酶 从产物氧化型萤光素中释放出来而使酶重新作用。另外牛血清白蛋白、氨基乙醇 等也可促进光的产生【9 】。 1 3 萤火虫萤光酶编码基因 d ew e l t 等在1 9 8 5 年首次克隆到北美萤火虫基因的，内源基因含有几个内含 子，他们把克隆到的萤光素酶c d n a 序列在大肠杆菌中表达，并得到有活性的 萤光蛋白【1 0 】。p g l 2 载体中的萤火虫萤光酶的编码区约为1 7 k b ，内部含有髓积i 和劢口i 酶切位点。 1 4 作为报告基因的改造 通常使用的作为报告基因的萤光素酶编码序列是经过人工改造的，这是因为 在正常情况下，在萤火虫光器官中萤光酶定位于过氧化物酶体中。当在外源宿主 中表达时，天然酶结构上的保守定位信号，即c 末端的三肽序列一s e r l y s l e u ，会 导致它在过氧化物酶体和乙醛酸循环体中积累【1 1 】。定位于过氧化物酶体中会在 两个方面影响细胞的生理功能：1 大量的外源蛋白在其中积累会影响过氧化物酶 体的正常功能2 许多其他的过氧化物酶体蛋白可能利用相同的定位信号。可以 通过随机诱变来改变c 末端序列，这个序列的突变可以避免萤光素酶输送到过 氧化物酶体中。除了要改变c 末端定位信号，还有几个方面要改变： 1 ) 限制性内切酶位点野生萤光酶编码区含有几个限制性内切酶位点，可以利用 密码子的简并性改变这些碱基序列但不改变氨基酸序列；2 ) 调节序列；3 ) 密码 子使用通常情况下不同生物体内密码子的使用可能影响t r n a 的异形体的可用 性；4 ) 糖基化位点过氧化物酶体或胞质溶胶中表达的内源萤光酶并不需要任何 转录后修饰，但是可能需要基因融合产生杂合蛋白定位到内质网或高尔基体中， 在这些细胞器里，n 链接的糖基化发生在a 跚x ( s 耐n r ) 序列，但是这对于萤 光酶的活性有什么影响目前尚不清楚，可以改变这些糖基化可能作用的位点，但 是并没有改变它们的化学活性，可能是这些位点不靠近蛋白表面，使糖基化不容 易发生【1 1 】。经过改造之后的萤光酶活力比野生型提高数十至上百倍。 2 海肾萤光酶的特点 海肾( r p ，l f 如地，l 和删西) 萤光酶( r l u c ) ( e c1 1 3 1 2 5 ) ，一个分子量为 7 山东师范大学硕士学位论文 3 6 k d 单亚基蛋白，纯化自天然来源的r p f 如形，l 扣硎西，该酶含有3 的碳水化 合物，同萤火虫萤光酶一样，不需翻译后修饰，翻译后即可作为遗传报告基因【1 2 】。 在海肾体内，处于激发态的萤光酶萤光素复合体将能量传递给绿色荧光蛋白 g f p 产生绿光。而体外反应没有g f p ，海肾萤光酶可利用0 2 催化腔肠动物萤光 素( c o e l e n t e r a z i n e )产生4 8 0 1 1 l i l 的蓝绿色萤光【1 3 】。 c o e l e 啊纳a z j n e r e 嘲h l 舢c 稚e 豫s e c o e i e m e 馆m i d e 图3 海肾萤光酶催化的反应 f i g 3t h er 绷以肠l u c i f h a s e 他a c t i o n l o r e n z 等分离到长度为1 2 k b 的编码海肾萤光酶的c d n a 序列，并在大肠杆 菌中原核表达【1 3 】。同萤火虫萤光酶一样，海。肾萤光酶在检测方法上也具有快速、 灵敏和安全的优点，同样，经过人工改造的海肾萤光酶，更加稳定，发光效率更 高。 3 双萤光酶报告基因介绍 萤火虫和海肾萤光酶进化起源、酶结构和底物不同，因此可以在同一溶液中， 利用它们的发光条件和发光底物不同，选择性的检测两种萤光酶活性。双萤光酶 报告基因体系是p r o m e g a 公司开发，最初应用于哺乳动物培养细胞。双萤光酶报 告基因体系中，一般将海肾萤光酶作为内标信号，萤火虫萤光酶作为测试信号， 将含有两种萤光酶报告基因表达载体等量混合，然后共同转染细胞，在同一提取 液中检测两种萤光酶的活性，对数据进行归一化分析。 双萤光酶报告基因测试体系优点是，结果不受培养细胞的数目、细胞的活力， 细胞转染和裂解效率的影响 1 2 】，从而提高实验的准确性。m a t s u o 等证明双萤光 酶报告基因体系也适用于植物细膨1 4 】。 外源基因在转基因植株中的表达水平会因整合位点的不同而变化，这称之为 位置效应。h e l l e n s 等在同一载体中使用c 心3 5 s 启动子和实验启动子驱动两种 甜脚 o ) 气 山东师范人学硕士学位论文 萤光酶，减少了因插入位点变化而导致的两种萤光酶表达水平的差异，有效的控 制了位置效应，用于瞬时表达载体以研究植物功能基因组学、启动子活性和r n a 剪切【1 5 1 。 二、萤光酶与植物启动子 启动子通常是指基因上游的一段特定d n a 序列，是黜悄聚合酶及其转录因 子的结合位点，决定基因转录的起始，并决定者一基因的表达强度【l6 1 。其中所 含有的顺式作用元件与相应的反式作用因子通过复杂的相互作用实现基因的转 录调控。启动子按其作用方式和功能可分为三类：组成型启动子、诱导型启动子、 组织特异型启动子。在组成型启动子调控下，不同组织器官和发育阶段的基因表 达没有明显差异，如花椰菜花叶病毒c a m v 3 5 s 启动子【1 7 】；诱导型启动子可根据 需要在植物特定的发育阶段、组织器官或生长环境下，快速诱导基因转录，例如 热诱导表达基因启动子( 如h s p 启动子) 等：组织或器官特异性启动子调控下的 基因转录一般只发生在某些特定器官或组织中，例如根特异启动子。 1 拟南芥a c t 7 基因及a c t 7 启动子 肌动蛋白是真核细胞骨架的重要组成部分。在植物细胞中，肌动蛋白在胞质 流动、细胞器定位和顶端生长等过程中起重要作用。拟南芥是研究a c t i n 基因的模 式生物。拟南芥有八个a c t i n 基因，这八个基因可以分为两类，营养生长相关的a c t i n 基因和生殖生长相关a c t i n 基斟18 1 ，根据表达和系统发育特点a c t 7 基因属于后者， 同其它管家基因一样，它的表达没有组织特异性，并且表达水平基本不受外界影 响，一般用作基因表达的内参。 2 l e h s p 2 3 8 最动子 本实验室最近克隆到的番茄1 9 1 5 b p 的三p 办印刀，8 启动子具有强热诱导活性， 对全长启动子转基因烟草株系各个组织器官进行g u s 染色分析，结果表明：2 6 条件下生长的转化株没有检测到g u s 染色，而热激处理后，刚萌发的幼苗( 7d 左右) 表现出极弱的g u s 组织化学染色，在萌发2 5 d 左右的幼苗根、茎、叶中 均检测到明显的g u s 组织化学染色，而在成熟植株各个组织中检测到更强烈的 g u s 组织化学染色。在不同发育时期的花中，2 6 条件下没有检测到g u s 染色， 热激处理后，子房、柱头、花瓣和花萼均表现出高水平的热诱导g u s 活性。 9 山东师范大学硕士学位论文 对不同长度启动子转化株系在多种胁迫条件下的g u s 荧光活性进行了测定 发现，在3 9 热激处理条件下，5 6 5 b p 的三p 印2 3 8 启动子介导的g u s 热诱导： 5 6 5b p 的启动子介导的g u s 低温诱导表达是最强的，三幽印2 3 8 启动子中5 6 5 b p 以内的序列是该启动子的低温诱导所需要的，同时还受低温和a b a 外源诱导。 5 缺失分析表明，三p 办印2 3 占启动子中5 6 5 b p 以内的序列足以响应低温、外源a b a 及重金属胁迫应型四】。 3 萤光酶在研究植物启动子方面的应用 报告基因广泛应用于研究真核基因表达和细胞生理，其中包括受体活性、转 录因子、转录因子、细胞内信号转导、瑚r n a 加工和蛋白折叠【2 0 】。 报告基因常用于研究顺式调节序列如启动子、5 和3 u 限、内含子等的作用， 一般将报告基因置于目的片段的下游，用于研究这些序列如何调节基因表达。常 用的报告基因有g u s ，c a t ，咒等，在实验中，因用途、成本、灵敏度及安全 性的要求选用不同的报告基因。 萤光酶检测灵敏，线性范围广且不使用有毒的化学物质，因而广泛应用于多 种生物，目前在动物、植物、酵母和病毒中均有应用，并且还可和其他报告基因 如g u s 等共同用于双报告基因载体转化实验中。 萤火虫萤光酶作为报告基因常用于研究启动子的活性。早在1 9 8 6 年，o w 等就将萤火虫萤光酶基因c d n a 置于c 心压v 3 5 s 启动子下游连入土壤农杆菌t i 质粒中，用电击法将其转染胡萝卜原生质体细胞和烟草植株。当加入萤光素后在 两者中都观察到了萤光，在转基因植株的大部分器官都有萤光产生，但是不同器 官之间存在差异【2 1 1 。 敲除和突变是研究启动子功能区域的常用方法，d o j c i i l o v i c 通过此方法，利 用萤火虫萤光酶报告基因，发现了拟南芥a o x l a 基因启动子在m t e t c 和t c a 循环中接受外界化学抑制剂诱导的关键调控区域【2 2 1 。此外，萤火虫萤光酶还可 用于抗病基因启动子的研究，如m p 硒基因在植物抗病应答响应中的作用【2 3 1 。 由于萤光酶半衰期短，不易在细胞中积累，利用萤光酶报告基因结合高度灵敏的 生物活体成像技术不仅可以观察某个启动子启动基因表达的时间、位置及关闭表 达的时间，还可以利用光学影像，从空间上确定启动子启动基因表达产物的位置， 观察植物生长过程中启动子的活力的时空变化或对外界刺激的反应。r 踟u s s e l l l o 山东师范大学硕士学位论文 等在2 0 0 6 年利用萤光酶报告基因载体研究水稻胚乳特异性r s u s 3 启动子时，将启 动子和萤火虫萤光素酶基因转入瓜儿豆中，他们发现r s u s 3 启动子驱动的萤光酶 在瓜儿豆胚乳中的表达水平很高而在子叶中几乎检测不到表达f 2 4 】。m e d i n a 等发 现拟南芥冷诱导型基因i 地1 2 a 启动子同时还受a b a 、脱水和n a c l 的诱导【2 5 1 。萤 光酶报告基因系统还可以用于研究5 u r r 及内含子等的作用。l u e l l r s e n 等用萤火 虫萤光酶同时结合g u s 研究启动子，5 和3 u t r 和内含子及其长度对基因表达的 影响【1 1 。 对重组海肾萤光酶转化紫花苜蓿、烟草、番茄和马铃薯的萤光强度分析结果 表明，海肾萤光酶作为报告基因，其萤光强度超过作为报告基因的萤火虫和细菌 萤光酶的萤光强度【2 6 1 。莱茵衣藻( 劬肠叼以d m d n 船陀f 咒办口砌f ) 是研究活性氧的 模式生物，以海肾萤光酶基因作为报告基因，s h a o 等发现缺少h s p 7 0 a 基因上 游h s e 的启动子仍可被过氧化氢诱导，但是不能被单线态氧诱导，单线态氧和 过氧化氢的激活所需要的启动子元件并不相同，这个报告基因系统适合各种环境 条件下包括非生物逆境胁迫下过氧化氢和单线态氧的检测【2 7 1 。 萤光酶是植物细胞的最佳报告基因。酶的定量方法简单，经济并且不需要放 射性和有毒的化学物质。因为植物中很少或几乎没有内源萤光，所以几乎没有背 景信号。 三、萤火虫萤光酶在研究植物抗逆性方面的应甩 在细胞中帮助新生肽折叠的生物大分子主要是蛋白质，它分为两大类：一类 是分子伴侣，一类是催化与折叠直接有关的化学反应的酶。分子伴侣( m o l e c u l a r c h a p e n e s ) 是指与新生肽链的折叠、寡聚蛋白质的组装和蛋白质的跨膜运输有 关的一类特殊蛋白质分子【2 引。 1 植物热激蛋白 在高于正常生长温度5 以上的温度即热激条件下，生物体大部分正常蛋白 质的合成和m r n a 的转录被抑制，同时迅速合成一些新的蛋白质称之为热激蛋 白( h e a ts h o c kp r o t e i i l s ，h s p s ) 【2 9 1 ，这种现象称之为热激反应【3 0 1 ，研究表明h s p s 普遍存在于从细菌到高等真核生物的整个生物界，而且它们几乎在所有的活细胞 中起着重要的作用【3 l 】。近十几年的研究证明，h s p s 在离体和活体条件下都能作 为分子伴侣行使功能f 3 2 1 。许多研究都表明，高温下产生的h s p 可以提高植物的 山东师范大学硕士学位论文 过对对照、耐热细胞和表达植物分子伴侣h s p 9 0 ，h s p 7 0 或h s p 2 0 的细胞在热激 和恢复条件过程中检测萤光酶的活力。结果显示h s p l 7 6 蛋白保持萤光酶活力和 耐热细胞在同一水平，并提加速了萤光酶的复性，但是在热激条件下并没有表现 出保护作用，植物体内其它h s p 和与其相关的生理变化对提高植物热耐受性也起 一定作用。f o 玎e i t e r 等发现在加热条件下，h s p 9 0 可以结合部分未折叠蛋白如二 氢叶酸还原酶和萤火虫萤光酶，阻止他们不可逆聚集，但是h s p 9 0 并不单独调节 蛋白的折叠，而必须加入网织红细胞裂解物【5 0 1 ，但是其具体的机制尚不清楚。 山东师范大学硕士学位论文 一、实验材料 第二章材料与方法 1 植物材料 拟南芥( 心a b i d o p s i sm a l i a l l ac v c o l u m b i a ) 和拟南芥突变体播种于土：蛭石： 珍珠岩( 3 ：1 ：1 ) 的混合土中，自来水每三天浇一次，温度为1 8 2 2 ，1 6 1 1 r 光 照，81 1 r 黑暗。 2 菌种及质粒 大肠杆菌( e s c h 嘶c l l i ac o l i ) d h 5 a ；农杆菌( a g r o b a c t e r i 吼t u m e f a c i e i l s ) g v 3 1 0 1 菌株为本实验室保存。质粒：p r t l 0 1 ：p c a m b 认3 3 0 l ；p b l u e s c r i p tk s ， p b i l 0 1 均为本实验室保存。 3 酶及化学试剂 t - v r e c t e r 一 限制酶及连接酶 卡那霉素( k a l l ) 一p r o m a g a 公司产品 t 2 k 出a 公司产品 s i 胂a 公司产品 氨苄青霉素( 加n p ) 一s i g m a 公司产品 x g a l 一一 p t g p c r 反应试剂 酶 s i 舯a 公司产品 s i 鲫a 公司产品 t a k a r a 公司产品 本实验室自制 其它化学试剂均为国产或进口分析纯； m s 培养基：参照m l 】r a a s l l i g e 和s k 0 0 9 的方法。 l b 培养基：参照分子克隆实验指南第二版附录。 常用生化及分子生物学试剂：参照分子克隆实验指南第二版附录。 4 主要仪器设备 1 4 山东师范大学硕士学位论文 二、实验方法 1 质粒的提取 用灭菌的牙签挑取白色单菌落接种于盛3 m ll b 液体培养基的试管中，3 7 振荡培养过夜。 1 ) 将3m l 茵液倒入e p 管中，8 ，0 0 0 印m 离心1 m i n ，去掉上清液，加入2 0 0 “l s o l u t i o ni ( 5 0 勰o l l 葡萄糖，2 5 h l i i l o l 1t r i s h c l ，l o m m o l le d t a ，p h 8 o ) ，涡 旋混匀，静置5 i i l i n ； 2 ) 加入2 0 0 蚌ls o l 妇0 ni l ( o 2 m o 执n a o h ，1 s d s ) ，轻轻混匀，静置5 m i n ； 3 ) 加入2 0 0 p ls o l u t i o ni i i ( 5 i n 0 1 1k a c 6 0i i 儿，p h 4 8 ) ，轻轻颠倒混匀， 静置5 m i n ； 4 ) 1 2 ，0 0 0 印m 离心1 0 m m ，将上清液转移至新管中，加入6 0 0 p l6 m 盐酸胍， 充分混匀； 5 ) 加入2 0 p l 硅胶，充分混匀，1 2 ，0 0 0 印m 离心2 曲，弃上清； 6 ) 每管中加入1 “7 0 乙醇，充分洗涤沉淀，1 2 ，o o o 印m 离心3 m i n ：重复 一次； 7 ) 3 7 吹干沉淀；加入5 0 山灭菌d d h 2 0 ，6 54 c 水浴洗脱结合在硅胶上的质 粒d n a ： 8 ) 电泳检测质粒，在1 0 “1 反应体系中加入2 肛l 质粒，1 p 1 1 0 x l o a d i n gb u 仃e r ， 7 m 无菌水，1 琼脂糖电泳( 5v c m ) 检测。 2 p c r 、酶切及连接 2 1p c r 反应体系： d d h 2 0 一一一lo 3 肛l 1 6 1o m 9 2 u 妇衙 2 “l d n t p s ( 10 p m ) 。一一1 6 p l p r i m e r l ( 1o p m ) p r i m e r 2 ( 10 p m ) - 一 2 “l 2 “l 酶( 5 u “1 ) 一o 1 “l 模板一2 p l 山东师范大学硕士学位论文 p c r 反应条件： s t e p l ， 9 4 3 m i i l s 拄i p 2 ，9 4 一6 0 s e c 、 s t 印3 ，5 4 一一5 0 s e c 3 0 c y c l e s s t e p 4 ，7 2 一2 m i l lj s t e p 5 ， f i m le x t e n s i o n7 2 1 0 r 血 完毕后1 琼脂糖凝胶电泳( 5v 尼m ) 检测。 p c r 产物回收：使用b i o f l u ) 【试剂盒 1 ) 将p c r 产物与其体积4 到5 倍的c p 缓冲液充分混匀； 2 ) 将上述混合液转移至一个回收纯化柱上，室温1 0 ，o o o 印m 离心1 m m ，弃 去留出液； 3 ) 加入7 0 0 m 洗涤缓冲液，室温1 2 ，o o o r p m 离心l l l l i n ，弃去流出液； 4 ) 重复步骤3 一次； 5 ) 室温1 2 ，0 0 0 离心空柱1 m i n ； 6 ) 加入15 3 0 p l 灭菌蒸馏水或洗脱液，静置l l n i n ，室温1 2 ，0 0 0 r p m 离心1 i i 血； 可以洗脱9 0 以上的d n a ，用于下游操作如连接或酶切。 2 2 酶切检测 在2 0 山反应体系中，加入无菌水7 “l ，b u 舵r2 山，限制性内切酶1 p l ，质粒 或p c r 产物1 0 i l l ，合适的反应温度酶切3 l l r ，1 琼脂糖凝胶电泳检测。 2 3 连接 。1 0 p l 连接体系，外源插入片段与载体d n a 片段分子摩尔比为3 ：1 ，1 m 的 1 0 “g a s eb 味r 及1 山的t 4d n al i g a s e ，1 6 连接过夜。 3 u g e n e 试剂盒从琼脂糖凝胶上回收插入片段 1 ) 紫外灯下，切取含所需d n a 条带的凝胶块并测其质量； 2 ) 按照1 ：4 6 ( 质量克数体积毫升) 加入n j 缓冲液；5 5 6 5 温育7m i n ， 中间不时混匀，使凝胶充分溶解于缓冲液； 3 ) 转移以上含有目的片段的缓冲液至一回收柱中，室温放置2 m i n ； 4 ) 室温1 0 ，0 0 0 印m 离心1m i n ，弃去流出液； 5 ) 加入7 0 0 m 洗涤缓冲液，室温1 2 ，0 0 0 印m 离心l m i n ，弃去流出液，重复 1 7 山东师范大学硕士学位论文 4 ) 菌体用1 0 m l 预冷的无菌的0 1 5 m 的n l c l 溶液重悬； 5 ) 5 ，o o o 印m 离心5 m i n ，弃上清； 6 ) 沉淀用l m l 预冷的无菌的2 0 l l ：蝴c a c l 2 溶液重悬； 7 ) 在2 0 0 p i 感受态细胞中加入1 鹇重组质粒，冰浴3 0 m i n ； 8 ) 液氮中冷冻l m i i l ； 9 ) 3 7 水浴，融化细胞2 3 i n i n ； 1 0 ) 加1 m ll b ，2 8 轻轻振荡4 1 1 f ； 1 1 ) 5 ，0 0 0 印m ，离心1 l i n ，用o 1 i n ll b 悬浮沉淀，将细胞悬液涂布于含 5 0 弘g m 1 卡那霉素，4 0 p 幽n 1 利福平的l b 平板上，2 8 培养2 3 天； 1 2 ) 筛出的克隆接种于液体培养基中培养，提质粒，用特异引物进行p c r 扩增鉴定。 7 植物基因组d n a 的大量提取 1 ) 植物材料暗处理2 4 1 1 r 去淀粉； 2 ) 取2 9 新鲜叶片洗净晾干去除叶脉，液氮冷冻磨碎，加入8 m l6 5 预热的 c t a b 抽提液，轻轻震荡混匀，6 5 温浴3 0 6 0 m i l l ( 中间轻转离心管混匀) ； 3 ) 冷却至室温后，加入等体积苯酚氯仿异戊醇( 2 5 ：2 4 ：1 ) ，混匀。室温放 l0 1 1 血( 中间颠倒混匀几次) ，l o ，0 0 0 印m 离心l o m i n ，回收上相； 4 ) 加入l 1 0 体积的6 5 的c t a b n a c l 溶液，混匀。用等体积氯仿异戊醇 再次抽提，离心回收上相； 5 ) 上相中加入等体积的c t a b 沉淀液，混匀，室温放置沉淀d n a ，必要时 6 5 温育3 蛐； 6 ) 4 ，2 ，7 0 0 印m 离心5 m i l l ； 7 ) 适量高盐t e 回溶( 可6 5 温浴1 0 3 0 m i n 促溶) 。加入l 1 0 0 体积r n a s e a ( 1 0 m 咖l ) ，混匀后3 7 保温3 0 i i l i n ； 8 ) 加等体积的异丙醇沉淀d n a ，离心或钩出絮状沉淀，7 0 乙醇洗涤两次， 室温干燥3 0 m i n ，用适量t e 溶解，2 0 保存备用。 8 c a m v 3 5 s f l u c - 3 3 0 1 和h s - f l u c 3 3 0 1 载体的构建 设计引物删l u c ( f 瓜) ，以质粒p g l 2 为模板，扩增出f l u c 编码区， p c r 产物回收后用助刀i 和砌脚hi 双酶切后，与用同样酶切的p r t l o l 和 1 9 山东师范大学硕士学位论文 p r t l 0 1 h s 载体连接，鉴定连接正确的重组载体，提质粒用a fi 单酶切，与用 n fi 酶切并脱磷酸化的p c a m b l a 3 3 0 1 载体连接，鉴定正确的重组载体，命名 为c 心重v 3 5 s f l u c 3 3 0 l 和h s f l u c 3 3 0 1 转化农杆菌g v 3 1 0 1 。 9 双架载体的构建 9 1d u a l l u c p b l l 0 1 载体的构建 a 区：以质粒p i 也t k 为模板设计引物p t k ( f r ) ，扩增出i u u c 编码区， p c r 产物回收后用助刀i 和b 口垅hi 双酶切后，与用同样酶切的p u c l 9 载体连 接，提质粒，鉴定正确的重组载体；以植物表达载体p r o k 2 为模板，设计引物 t k n o s ( f 瓜) ，扩增出t k n o s t e 壬0 v i 片段，p c r 产物回收后用 刀i 和艮d ri 酶切，与经过同样酶切过的连入i 江，u c 的p u c l 9 载体连接，鉴定正确的重组子， 提质粒，用d ri 和肋柳hi 双酶切切下r l u c t k n o s t e r m 片段，测序结 果正确，命名为a 区： b 区：以质粒p g l 2 为模板设计引物p g l ( f 1 瓜1 ) ，扩增出f u j c 编码区，p c r 产物适当稀释后以回收后用p g l ( f 2 r 2 ) 引物进行二次扩增，p c r 产物回收后 用勋，i 和风fi 双酶切后，与用同样酶切的p u c l 9 载体连接，提质粒，鉴定正 确的重组载体；以植物表达载体p r o k 2 为模板，设计引物p g l n o s ( f r ) ，扩增 出p g l - n o s t e r m 片段，p c r 产物回收后用a fi 和觑砝酶切，与经过同 样酶切过的连入f w c 的p u c l 9 载体连接，鉴定正确的重组子，提质粒，用胁以 和勋，i 双酶切切下f l u c p g l n o s t e r m 片段，测序结果正确，命名为b 区： 以d ri 和舶扰hi 双酶切p b l l 0 1 质粒，将a 区连入，鉴定正确之后， 胁玎d 和，。i 双酶切，连入b 区，鉴定，命名为d u a l u 庀一p b l l 0 1 。 9 2a c t 7 - d u a l l u c p b l l 0 1 载体的构建过程 以p b l l 0 1 质粒为模板，设计引物g u s ( f 瓜) 扩增出g u ss p a c e ，p c r 产 物回收后用点c d ri 酶切，与经点0 d ri 酶切并脱磷酸化的p b l u e s c r i p tk s 连接， 鉴定出连接正确的重组质粒。以野生型拟南芥基因组d n a 为模板，设计引物 a c t 7 1 ( f 瓜) 和a c t 7 2 ( f 瓜) ，p c r 扩增后分别经风fi ，勋ci 和胁珂dm ，勋di 后，与经过同样酶切的连入g u ss p a c e 的p b l u e s 嘶p tk s 连接，鉴定，经b 以所hi 和ci 酶切，得到含有两个启动子序列的片段，连入d u a l 。l u c p b l l 0 1 载体， 山东师范大学硕士学位论文 鉴定，得到a c t 7 - d u 舢l - l u c - p b i l 0 1 双萤光酶载体，转化农杆菌g v 3 1 0 1 。 9 3c 蝴v 3 5 s ，i i s d u a l l u c p b l l 0 1 载体的构建 以p r t l 0 1 质粒为模板，设计引物3 5 s ( f 瓜) ，扩增出c a 3 5 s 启动子序 列p c r 产物回收后用砌d ，勋di 双酶切，与经过同样酶切的连入g u ss p a c e 的p b l u e s c 邱tk s 连接，鉴定正确的重组子，提质粒。以本实验室克隆的三幽印2 3 8 启动子为模板，设计引物h s ( f 瓜) 扩增出h s p r o m o t o r ，p c r 产物回收用n fi ， 勋ci 酶切后连入改造的p b l u e s c r i p t k s 质粒中，鉴定，经b 口m hi 和勋ci 酶切， 得到含有两个启动子序列的片段，连入d u a l l u c p b l l 0 1 载体，鉴定正确的重 组子并提取质粒，命名为c 蝴v 3 5 s h s d 1 7 a i ，l ，u c p b l l o l 双萤光酶载体，转 化农杆菌g v 3 1 0 1 。 l o 渗透法转化拟南芥 l o 1 拟南芥的生长 野生型拟南芥和鉴定纯合的拟南芥突变体种子播种于盛满培养土的直径为 7 厘米的培养杯中，萌发2 3 天后移至4 光照培养箱中放置一周( 进行春化) ， 再放到2 1 的组织培养室中生长。植株长出顶生花序时，去除其顶生花序，以 刺激腋生花序的生长，注意避免伤及腋生花序。待腋生花序长出，其下部的花出 现授粉现象时进行转化。转化前，将已授粉花及荚果除掉。 1 0 2 菌液的准备 牙签挑取鉴定好的农杆菌单克隆放于5m l 含有l o 咖g l 利福平和5 0 m g l 卡那霉素的l b 液体培养基中，2 8 ，1 8 0 印m 震荡培养至o d 6 0 0 为1 2 1 6 之 间时取出使用。 1 0 3 渗透转化 制备好已转化了植物表达载体质粒的农杆菌菌液5 0 i n j ，室温5 ，0 0 0 印m 离心 5 m i i l ，弃上清液，沉淀悬浮于相应体积的渗透培养基( 5 蔗糖，2 0 0 “1 ls i l 、v e t l 7 7 ) 中，重悬后的菌液o d 6 0 0 约为o 8 。将农杆菌悬浮液倒在小烧杯中，将 长有拟南芥的培养杯倒扣其上，保证莲座叶以上部分浸没于液体中，浸泡1 5 分 钟。取出植株，横放在塑料盘中，用保鲜膜封好以保持湿度，放在恒温室培养。 第二天打开，竖直培养，仍用保鲜膜保持湿度3 4 天。根据情况可再浸染一次。 培养三至四周，待种子成熟后，收取种子，干燥器中存放2 周。 2 l 山东师范大学硕士学位论文 要注意农杆菌对植株的影响( 是否引起大量的花败育) ，来调整菌液浓度及 浸染次数。 1 1 拟南芥转化子的筛选 1 1 1k a n 抗性转化子的筛选 种子消毒：7 0 乙醇消毒1 m i n 后，1 n a c l o 溶液涡旋消毒1 5 m i i l ，无菌水 漂洗5 6 次。将消毒后的种子均匀分散到固体筛选培养基( m s 盐，3 蔗糖， o 7 琼脂，p h5 7 ，k 觚5 0 m g l ，为了抑制农杆菌的生长必须加入终浓度为 1 0 0 m g l 的c e f ) 表面。 拟南芥培养：拟南芥平皿4 春化2 3 天后，放入恒温组织培养室日光灯光 照培养。大约两周后，即可区分转化株与未转化株，转化株移栽到土中继续培养 以收取t 1 代种子。 1 1 2b a s t a 抗性转化子的筛选 转基因的t o 代拟南芥种子播种于培养土中，待幼苗长出2 3 片真叶时( 播 种后2 0 天左右) ，开始喷施2 ( v ) b a s t a 溶液，每5 天喷施一次，喷洒三次 后，非转化苗在喷洒b a s t a 溶液后开始黄化，并停止生长，一周左右枯死，抗性 苗在喷洒b a s t a 溶液后保持绿色。t l 代就可用于萤光酶的检测分析。 1 2 转基因植株外源基因的p c r 检测 1 2 1 植物基因组d n a 的小量提取 1 ) 取植物叶片o 1 9 放入1 5 m l 离心管中，置于超低温冰箱( 8 0 ) 保存备 用； 2 ) 将离心管浸入液氮中，用研磨杵研磨； 3 ) 每个离心管中加入预热的4 0 0 “l 提取缓冲液( 2 0 0 n l mt r i s h c l ，2 5 0 i n m n a c l ，2 5 1 1 1 me d l a ，o 5 s d s ) ，轻轻混匀： 4 ) 将样品于6 5 水浴保持1 5 3 0m i n ； 5 ) 冷至室温，加入等体积氯仿异戊醇(