（微生物学专业论文）细菌信号ahl降解菌的筛选及其降解酶的研究.pdf

中山大学硕士学位论文 细菌信号a h l 降解菌的筛选及其降解酶的研究 专业：微生物学 硕士研究生：薛小莉 指导教师：周世宁教授 摘要 群体感应( q u o r u ms e n s i n g ，q s ) 是细菌进行细胞问交流并通过调控相关基 因的表达来协调群体行为的机制。酰基高丝氨酸内酯( a c y l h o m o s e r i n el a c t o n e 。 a u l ) 作为革兰氏阴性细菌q s 系统的一类主要的信号分子，参与调控抗生素合 成，生物膜形成及毒力因子的表达等重要生物功能。研究表明，芽胞杆菌属 ( b a c i l l u ss p ) 细菌产生的a h l 内酯酶a i i a 能降解信号分子a h l ，从而干扰病 原菌q s 系统的信号传导而阻断其致病机制。在其他细菌以及真核生物中也存在 不同类型的a h l 降解酶。这些新的a h l 降解酶的发现，将为病原菌的生物防 治提供一个有效途径。本研究的目的是利用实验室分离保存的丰富的微生物资 源，从中筛选能高效降解a h l 的菌株，并对其降解酶的特征进行初步研究。 以根癌农杆菌( a g r o b a c t e r i u mm m e f a c i e n s ) 的q s 模式系统( t r a i r ) 为模 型，用“9 6 孔板液体检测”和“琼脂条检测”法，从实验室保存的菌株中筛选到5 个能高效降解a h l 的菌株b t ，z s 4 2 ，z s 9 1 ，z s i o 和z s l 5 ：其中b t 为苏云金 芽胞杆菌( 口t h u r i n g i e n s i s ) ：z s 4 2 ，z s 9 1 为番茄内生细菌；z s l 0 和z s l 5 为动 物源性细菌。经形态学和1 6 sr d n a 分析，初步鉴定z s 4 2 和z s 9 1 为芽胞杆菌 属细菌，z s i o 和z s l 5 为苍白杆菌属( o c h r o b a c t r u ms p ) 细菌。进一步实验分 析显示，各菌株的a h l 降解活性均为胞内的酶活性。对各菌株的抗病活性进行 分析，发现z s 4 2 对软腐病菌欧文氏菌( e r w i n i ac a r o t o v o r a p v c a v o t o v o r a ) s c g l 的致 病性有较强的抑制作用，b t ，z s 9 1 能在一定程度上抑制软腐病菌害，而z s l 0 和z s l 5 未表现出明显的抗病活性。 中山人学硕卜学位论文 为了进一步研究降解酶的特征，根据已报道的a h l 内酯酶基因a i i a 两端序 列设计引物，从b t ，z s 4 2 ，z s 9 1 基因组d n a 中分别克隆了a i i a 基因。序列分 析表明，所扩增的3 个基因片段大小均为7 5 3 b p ，和g e n b a n k 中已知的a h l 内 酯酶基因a i i a 同源性达9 8 以上。推导得到的氨基酸序列中，均存在g l o b 保守 结构域，与已知a i i a 一致。将a i i a 基因插入到表达载体p e t - 1 7 b ，构建融合表 达载体p e t - a i i a ，并转入大肠杆菌b l 2 1 ( d e 3 ) o ? 表达。经i p t g 诱导后，s d s - - p a g e 检测显示a i i a 在大肠杆菌b l 2 1 ( d e 3 ) 得到高效表达，大小约为2 9 k d ， 与理论值相符。活性检测显示，表达重组蛋白a i i a 的大肠杆菌有较强的a h l 降解活性。 目前仅有一篇关于苍白杆菌属细菌a h l 降解酶的报道，且没有相关的降解 酶基因信息。因此，进行z s l 0 和z s l 5 的a h l 降解酶基因的克隆和研究，将不 仅有助于研究苍白杆菌属细菌与q s 信号降解相关的调控机制，还有助于了解不 同类型的a h l 降解酶的降解机理。目的，己利用p u c l 9 载体构建了z s l 0 的基 因组d n a 文库。 关键词：群体感应系统，a h l 内酯酶，基因组d n a 文库 i i 中山大学硕士学位论文 i s o l a t i o no fb a c t e r i a ls i g n a la c y lh o m o s e r i n el a c t o n e ( a h l ) 一d e g r a d i n gs t r a i n sa n d c h a r a c t e r i z a t i o no f a h l - l a c t o n a s e m a j o r ：m i c r o b i o l o g y c a n d i d a t e ：x i a o l ix u e s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o rs h i n i n gz h o u a b s t r a c t q u o r u ms e n s i n g ( q s ) i sam e c h a n i s mo fm i c r o b i a lc o m m u n i c a t i o nt h a tl i n k sc e l l d e n s i t ya n dg e n ee x p r e s s i o nt oc o o r d i n a t ec e l l u l a ra c t i v i t i e s a c y l h o m o s e r i n el a c t o n e ( a h l ) i sa ni m p o r t a n ts i g n a lm o l e c d eu s e db yg r a m n e g e e t i v eb a c t e r i ai nq u o r u m s e n s i n gs y s t e m ，w h i c hr e g u l a t ear a n g eo fi m p o r t a n tb i o l o g i c a lf u n c t i o n s ，i n c l u d i n g a n t i b i o t i cp r o d u c t i o n ，b i o f i l mf o r m a t i o na n dv i r u l e n c ef a c t o r se x p r e s s i o n t h e a h l l a c t o n a s e sf r o mb a c i l l u ss p e c i e sw e r ed e m o n s t r a t e dt od e g r a d ea h l ，w h i c h i n t e r f e r e dt h eb a c t e r i a lq ss i g n a l i n ga n db l o c k e dt h e i rp a t h o g e n i ci n f e c t i o n s s e v e r a l g r o u p so fa h l d e g r a d i n ge n z y m e sh a v eb e e ni d e n t i f i e d i no t h e rb a c t e r i aa n d e u k a r y o t e s d i s c o v e r yo ft h e s en o v e lq u o r u mq u e n c h i n ge n z y m e sw i l lp r o v i d ea p r o m i s i n gw a yo fp a t h o g e n b i o c o n t r 0 1 t h ea i mo ft h i ss t u d yw a st o 呲t h e a b o u n d i n gm i c r o b i a lr e s o u r c e sp r e s e r v e di no u rl a b ，a n dt os c r e e nb a c t e r i a ls t r a i n s t h a th a v eh i g ha h l d e g r a d i n ga c t i v i t y f u r t h e r m o r e ，t h ea h l d e g r a d i n ge n z y m e s w i l lb ep r i m a r i l yc h a r a c t e r i z e d 1 1 1 中山人学硕。i ：学位论文 q u o r u ms e n s i n gs y s t e mo f a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n sw a s u s e da sa s c r e e n i n gm o d e l t h eb a c t e r i a ls t r a i n st h a th a v eh i g ha h l - d e g r a d i n ga c t i v i t yw e r es c r e e n e db yu s i n ga “9 6 w e l l sl i q u i db i o a s s a y ”a n dt h e na n “a g a rs l i c e sb i o a s s a y ”m e t h o d 5s t r a i n sr b t ， z s 4 2 ，z s 9 1 ，z s l 0a n d z s l s ) w e r e i d e n t i f i e d t o h a v es 仃o n g a h l d e g r a d i n g a c t i v i t y ： s t r a i nb tw a sb t h u r i n g i e n s i sp r e s e r v e di no i l l l a b ；z s 4 2a n dz s 9 1w e r et o m a t o e n d o p h y t e s ；z s l 0 a n dz s l 5w e r ei s o l a t e df r o ma n i m a l a c c o r d i n gt ot h e i r m o r p h o l o g ya n d16 sr d n aa n a l y s i s ，z s 4 2a n dz s 9 1w e r ei d e n t i f i e da sb a c i l l u ss p a n dz s i oa n dz s l 5w e r ei d e n t i f i e da so c h r o b a c t r u ms p f u r t h e re x p e r i m e n t s s u g g e s t e d t h e a h l - d e g r a d i n ga c t i v i t y w e r e c y t o p l a s m i ce n z y m a t i ca c t i v i t y f u r t h e r m o r e ，z s 4 2g r e a t l yi n h i b i t e dv i r u l e n c eo fe r w i n i ac a p o t o v o r ap v c a v o l o v o r a s c g i ，b ta n dz s 9 1 s h o w e dm e d i u mi n h i b i t i n ga c t i v i t y , w h e r e a sz s l 0a n dz s l 5 s h o w e dn od e t e c t a b l ei n h i b i t i n ga c t i v i t y t of u r t h e rc h a r a c t e r i z et h ea h l d e g r a d i n ge n z y m e s ，p r i m e r sw h i c hd e s i g n e dt oc l o n e t h ea h l - l a c t o n a s eg e n ea i mw e r eu s e d a n dp c ra m p l i f i c a t i o n sw e r ep e r f o r m e d w i t ht h eg e n o m i cd n ao fb t ，z s 4 2a n dz s 9 1 s e q u e n c e sa n a l y s i ss h o w e dt h a tt h e c o m p l e t es e q u e n c el e n g t ho f c o r r e s p o n d i n gp c rp r o d u c t sw e r e7 5 3 b p c o m p a r i s o n o f t h er e p o r t e dh o m o l o g u eg e n e si ng e n b a n ks h o w e dh i g hh o m o l o g i e so f o v e r9 8 i nt h en u c l e o t i d es e q u e n c e s t h eg i o bc o n s e r v e dd o m a i nw a sf o u n di nh y p o t h e t i c a m i n oa c i ds e q u e n c e s ，w h i c hw a sc o n s e n s u so nt h er e p o r t e da i i a t h ec l o n e da i i a g e n e sw e r et r a n s p l a n t e dr e s p e c t i v e l yt ot h ee x p r e s s i o nv e c t o rp e t - 1 7 bt oc o n s t r u c t p e t - a i i a a n dt h ef u s i o ne x p r e s s i o nv e c t o r sp e t - a i i aw e r ee x p r e s s e d i ne c o l i b l 2 1 ( d e 3 ) a f t e ri p t gi n d u c e de x p r e s s i o n ，t h es d s p a g es u g g e s t e d t h a ta i i aw a s e f f e c t i v e l ye x p r e s s e di ne c o l i ，a n dt h em o l e c u l a rw e i g h tw a sa b o u t2 9k d ，w h i c h c o n f o r m e dt ot h et h e o r e t i c a lv a l u e e c o l it h a te x p r e s s e dr e c o m b i n ep r o t e i na i i a s h o w e dh i g ha h l d e g r a d i n ga c t i v i t y t h e r ew a so n l yo n er e p o r to na h l d e g r a d i n ga c t i v i t yi no c h r o b a c t r u ms p ，a n dn o r e l e v a n ti n f o r m a t i o no f a h l d e g r a d i n ge n z y m eg e n ew a sa v a i l a b l ea tp r e s e n t t h u s ， s t u d ya n dc h a r a c t e r i z et h e a h l d e g r a d i n ge n z y m eg e n e sf r o mz s l 0 a n dz s l 5w i l l i v 坐查兰堡主兰堡丝苎 n o to n l yf a c i l i t a t et h ei n v e s t i g a t i o no f r e g u l a t i o nm e c h a n i s m st h a tr e l a t e dt ot h eq s s i 掣l a ld e g r a d i n gi no c h r o b a c t r u ms p ，b u ta l s op r o v i d en e w i n f o r m a t i o nf o rr e s e a r c h o nm e c h a n i s m so f d i f f e r e n t a h l - d e g r a d i n ge n z y m e s a tt h i ss t a g e ，z s i og e n o m i c d n a l i b r a r yw a sc o n s t r u c t e db yu s i n gp u c l 9v e c t o r c u r r e n te f f o r t st oc l o n et h en e w a h l _ d e g r a d i n ge n z y m eg e n ea r eu n d e rw a y k e yw o r d s ：q u o r u ms e n s i n g ，a h ll a c t o n a s e ，g e n o m i cd n al i b r a r y v 中山大学硕士学位论文 第1 章绪论 1 1 细菌群体感应( q u o r u ms e n s i n g ，q s ) 系统 近年来，越来越多的研究发现，细菌不仅仅作为单个的细胞存在，而是像多 细胞生物那样能进行细胞与细胞间的交流。细菌通过感知特定信号分子的浓度的 变化来监控自身或其它细菌的数量变化。当环境中的信号分子达到一定的浓度阙 值时，细菌能启动相关基因的表达来适应环境中的变化。这种细菌之间的交流机 制被称为细菌群体感应( q u o r u ms e n s i n g ，q s ) 系统( f u q u ae ta 1 ，1 9 9 4 ) 。 细菌的群体效应首先是在海洋发光细菌费氏弧菌( h b r i of i s c h e r o 中发现 的。在液体培养条件下，费氏弧菌在生长初期( 低细胞密度) 并不产生发光现象。 荧光素酶的产生在细菌进入对数生长期( 高细胞密度) 时呈现相对的短期爆发。 n e a l s o n 将这个过程定义为自诱导( a u t o i n d u c t i o n ) ：基因的诱导表达是由生长环 境中的自诱导物( a u t o i n d u c e r ) 调控的，而自诱导物的产生与细菌的群体数量密 切相关( n e a l s o ne ta 1 ，1 9 7 0 ) 。 q s 系统首先由酶催化合成信号分子，信号分子经扩散或转运系统到达胞外， 当信号分子浓度达到一定阂值时，能被相应的感应系统识别，进而引起受体蛋白 的构象或基团变化，最终激活靶基因的表达。 许多革兰氏阴性( g ) 细菌利用酰基高丝氨酸内酯( a c y l h o m o s e r i n e l a c t o n e ，a h l ) 为q s 系统信号分子。革兰氏阳性( g + ) 细菌q s 系统一般利用寡 肽类( a u t o i n d u c i n gp e p f i d e ，a i p ) 为信号分子。而呋喃酰硼酸二酯( f u r a n o s y l b o r a t ed i e s t e r , a i 2 型信号分子) 则是细菌不同种属间进行交流的“通用语” ( w h i t e h e a de ta 1 ，2 0 0 1 ) ；此外，还存在其他类型的信号分子，如图1 1 所示：青枯 菌( r a l s t o n i as o l a n a c e a r u m ) 利用信号分子3 一羟基棕榈酸甲酯 ( 3 - h y d r o x y l p a l m i t i ca c i e dm e t h y le s t e r , p a m e ) ；黄单胞菌( x a n t h o m o n a sc a m p e s 护i s ) 利用甲基十二碳烯酸( m e t h y ld o d e c e n o i ea c i d ，d i f f u s i b l es i g n a lf _ a c t o r 一类信号分 子) 调节毒力因子的表达( z h a n g & d o n g ，2 0 0 4 ) ；白色假丝酵母( c a n d i d a a l b i c a n s ) 中山人学硕十学位论文 能产生与d s f 结构相似的法呢酸( f a r n e s o i ca c i d ，f a ) 为信号分子来调控形态的转 变和毒力因子的产生( w a n ge ta 1 ，2 0 0 4 ；f u q u ae ta 1 ，2 0 0 5 ；h o g a n ，e ta 1 ，2 0 0 6 ) 。 s i g n a la n ds t r u c t u r er o p r e e e n t o t j v eo r g * n l a mf u n c t l a nl l g u l l l l d 细知n o h l j椭细d 日胁盘，棚日妇咖p l a m n l dl r n m c e r r0 加e 肭衄龃帕如帽甩 v l m l e m ea n da n t i b i o t i c s 小牡人威p s 椭e u a a 鼬m m m 卅a 呦“, o r n o s a u v i r u k l e 咐n c e 删h f u m n o e y l b o 哪e v l ，n bt n n , e y v l l l 1 k l n c e c 卜2 ) m ( o 姑“ (aillii)0 啦* 机k 矗之= = ：1 、v 、 、， 、从， io 一，、，、 v ，- 、l o ” l 上、 、ll 。“ 幽i i 不同类唰的q s 信号分子结构 f i g 1 - l s t r u c t u r e so f r e p r e s e n t a t i v em i c r o b i a lq ss i g n a l s ( z h a n g d o n g 2 0 0 4 ) 1 2 a h l 依赖型q s 系统及相关调控 由于很多植物、动物致病菌都利用a h l 为q s 系统的信号分子，参与很多 重要生物功能的调控。研究a h l 依赖型q s 系统及其调控对防治这些病原菌具 有重要的意义和巨大的经济效益。 中山大学硕士学位论文 如同1 2 所示，a h l 依赖的q s 系统主要由两部分组成：l u x i 类( i ) 蛋白 为a h l 合成酶，负责合成信号分子a h l ；l u x r 类( r ) 蛋白负责感受a h l 的 浓度，并作为a h l 受体或是响应调节蛋白来调控相关基因的转录。在低细胞密 度时，l u x l 只保持低水平的组成型的表达。细菌合成的信号分子a h l 通过扩散 或主动运输到胞外，在环境中不断积累随着细菌数量不断增多，a h l 分子不 断积累。当环境中a h l 浓度达到一定阈值时，a h l 跟r 蛋白结合形成r - a h l 复合体。活化的复合物形成二聚体或多聚体，并作为转录调节因子同时激活目的 基因以及i 蛋白基因的表达。因此，这是一个自诱导的过程，a h l 又称为自诱 导物( a u t o i n d u 0 3 r , a t ) ( w h i t e h e a de la 1 ，2 0 0 1 ；d o n g & z h a n g , 2 0 0 5 ) 。 图1 - 2a h l 依赖的q s 系统 f i g 1 - 2s c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o no f t h e a h l - d e p e n d e n tq ss y s t e m0 ) o n g z h a n g2 0 0 5 ) a h l 是一种小分子化合物，典型特征是含有高丝氨酸内酯环和一个酰胺侧 链。不同的细菌可能合成不同的a h l 信号分子，这些a h l 主要区别在于侧链 的长度，或3 一碳位置的取代基的不同，或侧链中有无一个或多个不饱和键，如图 1 - 3 所示。 中山大学硕十学位论文 t w , w c a c r m t t n a h尊 讯心 r 抽n 洲u n m 图卜3 革兰氏阴性细菌利用的典型的a h l 信号分子 f i g 1 - 3 s t r u c t u r e s o f r e p r e s e n t a t i v e a h ls i g n a l s u s e db y g r a m - n e g a t i v e b a c t e r i a a h l 参与很多重要生物功能的调控，包括根癌农杆菌( a g r o v a c t e r i u m t u m e f a c i e n s ) 的t i 质粒的接合转移( z h a n g e ta 1 ，1 9 9 3 ) ；条件致病菌铜绿假单胞菌 ( p s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a ) 的毒力因子的表达和生物膜的形成等( w a l k e r e t a l ， 2 0 0 4 ) ；植物病原菌胡萝h 欧文氏菌( e r w m i a c a r o t o v o r a ) 毒力因子的表达和抗 生素碳青霉烯( e a r b a p e n e m ) 的合成( w h i t e h e a de ta 1 ，2 0 0 2 ) ；人类条件致病菌沙 雷氏菌( s e r r a t i as p ) 的抗生素灵菌红素( p r o d i g i o s i n ) 的合成都受a h l 的调控 ( s l a t e r e t a l ，2 0 0 3 ) 。 在g 一细菌中，有的细菌含有不止一套q s 系统，但它们能共同参与调节细菌的 某些功能，不同q s 系统之间具有等级调控效应，如铜绿假单胞菌的q s 系统1 ( l a s i l a s r 信号系统) 对q s 系统2 ( r h l i r h l r 信号系统) 具有调控作用( p e s e ie ta 1 。 1 9 9 7 ) 。 1 3 细菌群体感应淬灭及a h l 降解酶 1 3 1 细菌群体感应淬灭 4 。由岳占 h ；n 件，牲 h 南 m ； 一 中山大学硕士学位论文 由于很多病原微生物依赖q s 系统来调控其毒力因子的表达，d o n g & z h a n g 提出了“群体感应淬灭”( q u o r u mq u e n c h i n g ) 的概念：通过干扰和破坏致病菌的 q s 系统使致病菌失去致病性，从而达到生物防治这些病原菌的目的。 有以下几种途径可以干扰细菌的q s 系统： ( 1 ) 通过降解信号分子a h l 以阻止其积累，使其浓度难以达到引发致病因 子表达的浓度，使病原菌失去毒力( h o n w i l l e ta 1 ，2 0 0 7 ；d o n g & z h a n g , 2 0 0 5 ) 。 ( 2 ) 干扰信号分子的生物合成，如抗菌药三氯生( t r i c l o s a a ) 是脂肪酸合成 抑制剂，可以干扰a m ，生物合成必须中间产物a c y l - - a c p 的合成，从而减少a h l 的数量( z h a n g & d o n g ，2 0 0 4 ) 。 ( 3 ) 减少q s 系统信号分子受体r 蛋白的数目，如海藻( d e l i s e a p u l c h r a ) 产生 的a h l 信号分子结构类似物卤化呋哺酮( h a l o g e n a t e df u r a n o n e s ) 能破坏a h l 依赖 型q s 系统( g - i v s k o ve ta 1 ，1 9 9 6 ) 。m a n e f i e l d 等人报道，卤化呋喃酮能抑制胡萝i - 欧 文氏菌( ec a r o t o v o r a ) 毒力因子的表达和抗生素碳青霉烯( c a r b a p c n e m ) 的合 成( m a n e f i e l de ta 1 ，2 0 0 1 ) 。而经呋喃酮共培养一段时间后的费氏弧菌( v f i s c h e r i ) 会加速l u x r 蛋白的降解从而“淬灭”细菌的q s 系统( m a n e f i e l de t a l ，2 0 0 2 ) 。 1 3 2 趾儿降解酶 由于a h l 信号分子的浓度是激活毒力基因的表达的关键，通过降解病原菌的 a h l 使其浓度难以达到引发致病因子表达的浓度阈值，可以阻断其q s 系统而达 到防治病原菌感染的目的。经过大量的研究发现，在原核生物以及真核生物中都 存在着具有a h l 降解活性的酶。目前主要发现两类a h i 降解酶：a h l - 内酯酶 ( a h l 1 a c t o n a s e ) 和a i - i l 一酰化酶( a h l - a c y l a s e ) 。其降解机理如图1 4 所示。 a h l 内酯酶可以将a h l 的内酯键水解，产生酰基高丝氨酸。与a h l 相比， 酰基高丝氨酸只有很低的生物活性( d o n gg ta 1 ，2 0 0 0 ；d o n ge ta 1 ，2 0 0 1 ；p a r ke ta 1 ， 2 0 0 3 ) 。 a h l - 酰化酶可以打断a h l 的酰胺键，产生脂肪酸和高丝氨酸内酯 ( h o m o s e r i n el a c t o n e 。h s l ) 。高丝氨酸内酯无任何生物活性，脂肪酸也可以被细 菌利用而进一步降解( l e a d b e t t e r & g r c e n b e r g ，2 0 0 0 ；l i n e t a l ，2 0 0 3 ；p a r kc ta 1 ， 2 0 0 5 ) 。 中山大学硕1 ：学位论文 椭u x 9 m a i i l h i h d a 嘴瞥 树u 拈 姆 - 抖 制u 矿m 。勺 f 戤m| | s l 图1 - 4a i i l - 内酯酶和a t t l - 酰化酶的降解机制 f i g 1 - 4 t h ec o r r e s p o n d i n gd e g r a d a t i o nm e c h a n i s m so f a h l - l a e t o n a s ea n da h l a e y l a s e ( d o n g z h a n g , 2 0 0 5 ) 1 3 2 1a 肌降解酶一内酯酶 d o n g 等从土壤环境中分离出一株芽胞杆菌( b a c i l l u s s p ) 2 4 0 8 1 ，该菌对a h l 有很强降解活性。克隆并分析该降解酶基因( a l i a ) 发现，其o r f ( o p e nr e a d i n g f r a m e ) 是一段7 5 0n t 的序列，编码一个2 5 0a a 的蛋白a i 认。由于肽链的n 端没 有疏水信号肽，推测a i 认不可能是一个分泌蛋白。而这与实验现象菌株2 4 0 8 1 的 菌液上清以及转入a i i a 基因的大肠杆菌的菌液上清都没有a h l 降解活性是吻合 的。对a i i a 蛋白序列进行比对分析发现，a j 认包含了一个, a 0 4 h x h x d h l 0 9 ”的基 序( m o t i f ) ，这在含锌水解酶中是保守。通过位点突变发现，h 1 0 6 ，d 1 0 8 ，h 1 ， h 1 6 9 对a i i a 的降解活性来说是必需的。将d 1 0 9 或h 1 0 9 用丝氨酸( s ) 代替，将会使 a i i a 酶活性完全丧失。将芽胞杆菌( b a c i l l u ss p ) 2 4 0 8 1 的a h l 内酯酶基因a i m 转入胡萝卜欧文氏菌中表达，可明显减弱其致病性( d o n g e t a l ，2 0 0 0 ) ；更重要 的是，表达a i 认的转基因植物可以降解致病菌的q s 系统的信号分子，明显增强 了对胡萝h 欧文氏菌感染的抗性( d o n ge ta 1 ，2 0 0 1 ) 。在苏云金芽胞杆菌( 丑 t h u r i n g i e n s i s ) 及其相近的属蜡状芽胞杆菌( 且c e r e u s ) 和蕈状芽胞杆菌( 丑 m y c o i d e s ) 都发现了具有a h l 降解活性的酶，而且他们都属于同一个a h l 降解 酶家族( d o n ge ta 1 ，2 0 0 2 ) 。 此外，在其他属的细菌中也发现了类似的a h l 内酯酶。p a r k 等利用富集和 分离技术得到了一株能利用a h l 为唯一碳源和氮源生长的细菌节杆菌 ，t h r o b a c t e rs p ) i b n l l 0 ，并克隆和表达了其a h l 降解酶a h l d 。通过h p l c 和 6 中山大学硕士学位论文 e s i - m s 分析a h l 被该酶降解后的产物，发现a h l d 是a h l 内酯酶，可以将a h l 的高丝氨酸内酯键水解。通过对蛋白序列的分析也证实了a h l d 存在a h l 内酯酶 的保守基序。这是第一次关于革兰氏阳性菌可以分解代谢a h l 并以此为能源生长 的报道。通过基于保守基序的基因组数据库分析，发现在其他细菌中也存在与 a h l d 相似的a h l 内酯酶基因，其中包括古菌t h e r m o p l a s m av o l c a n i u mg s s i 和 s u l f o l o b u ss o l f a t a r i c u sp 2 。通过实验，已经在肺炎克雷伯氏菌( 足p n e u m o n i a e ) 和嗜热脂肪芽胞杆菌( b a c i l l u ss t e a r o t h e r m o p h i l u s ) e p 观察到了a h l 降解酶的活性， 同时克隆了肺炎克雷伯氏菌( 置p n e u m o n i a e ) 的a h l 降解酶基因a h l k ( p a r k e t a l ， 2 0 0 3 ) 。 不同属种的细菌中发现的a h l 内酯酶在氨基酸组成上有比较大的差异。系 统发生分析表明，这些a h i ，内酯酶可以分为两簇( c l u s t e r ) 。其中a i 认簇包括了 所有从芽胞杆菌属( b a c i l l u ss p ) 细菌发现的a ，内酯酶，它们具有大于9 0 的 同源性。而a t t m 簇包括了根癌农杆菌( at u m e f a c i e n s ) ，节杆菌( a r t h r o b a c t e rs p ) 和肺炎克雷伯氏菌( k l e b m e l l a p n e u m o n i a e ) 中的a h l - 内酯酶，它们在蛋白序列 上只有3 0 5 8 的同源性( d o n g c ta 1 ，2 0 0 5 ) 。这些a h l - 内酯酶都被归属为金属一 口内酰胺酶( m e t a u o l 撇) 蛋白超家族。t h o m a s 等通过实验证明了苏云金 芽胞杆菌( 丑t h u r i n g i e n s i s ) 中的a m ，内酯酶是金属水解酶，如图1 5 所示，保守 基序1 0 “r i x i - i x d h l 0 9 h l 田被认为是锌结合的基序m 勰c ta 1 ，2 0 0 5 ；k i l ne ta 1 ， 2 0 0 5 ) 。该酶的三维结构也已有报道( 】l i ue ta 1 ，2 0 0 5 ) 。 h i s l 6 9 i s l o g 图卜5 二价金属离子的结合位点( 含2 个z n + ) f 培i - 5p t o p 0 5 e dd i n u c l e m rm e t a lb i n d i n gs i t ec o n t a i n i n g2e q u i vo f z i n c ( t h o m a se ta 1 2 0 0 5 ) 中山大学硕i ：学位论文 1 3 2 2 a h l 降解酶一酰化酶 l e a d b e t t e r 和g r e e n b e r g 发表了争论贪噬菌( v a r i o v o r a x p a r a d o x u s ) v a i c 能利用a h l 分子为唯一能源和氮源生长的报道。由于在争论贪噬菌( 矿 p a r a d o x u s ) v a i c 分解代谢a h l 后的产物中检测到了高丝氨酸内酯的存在，他们 推测该菌可能产生a h l 酰化酶( a h l a e y l a s e ) ，将信号分子的侧链与内酯环断 开，并进一步分解侧链。然而编码该a h l - 酰化酶的基因却没有被进一步地克隆出 来( l e a d b e t t e r & g r e e n b e r g ，2 0 0 0 ) 。 2 0 0 3 年，l i n 等从劳尔斯通氏菌( r a l s t o n i as p ) x j l 2 b 中克隆出a h l 酰化 酶基因a i i d ，第一次在分子水平上对a h l 酰化酶的性质及其作用机制进行了相 关研究和讨论。预测的a i i d 是一个7 9 4a a 的多肽，与犹他游动放线菌 ( a c t i n o p l a n e su t a h e n s i s ) 的a e u l e a c i naa e y l a s e ( a a c ) 在多肽水平上有4 0 的相似 性，并且与几种头孢菌素( c e p h a l o s p o r i n ) 以及青霉素酰化酶( p e n i c i l l i na c y l a s e s ) 有2 2 2 4 的相似性。用h p l c 和e s i m s 分析a i i d 降解a h l 后的产物为高丝氨酸内 酯和脂肪酸侧链，证实了a i i d 通过切断a h l 的酰胺键使得a h l 失活的机制。通 过定点突变实验得出，保守的甘氨酸丝氨酸对( g l y s e r ) 是保持a i i d 酰化酶的 活性必需的。a h l 酰化酶a i i d 在铜绿假单胞菌( p a e r u g i n o s a ) p a 0 1 中的表达 能将其q s 系统“淬灭”，降低其游动性( s w a r m ) ，使其毒力因子弹性蛋白酶 ( e l a s t a s e ) 和绿脓菌素( p y o c y a n i n ) 的活性和数量都显著降低。a h l 一酰化酶的 生理学意义还不是很清楚，但是由于菌株x j l 2 b 可以利用两种信号分子 3 - 0 c 1 2 h s l 以及c 4 h s l 为生长能源，因此a h l 酰化酶可能在寡营养环境中发挥 着作用。与根癌农杆菌( 4 t u m e f a c i e n s ) 通过a h l - 酯酶来进行自身o s 信号分子 以调节相关功能的过程类似，a i i d 可能在自然环境中的q s 循环中起着调控作用 ( l i ne ta l 。2 0 0 3 ) a h u a n g 等发现铜绿假单胞菌( pa e r u g i n o s a ) p a 0 1 以及一株土壤假单胞菌 p a l a 都可以降解长链的3 o - c 1 2 h s l ，并释放出降解产物高丝氨酸内酯。其降 解酶基因p v d o 与劳尔斯通氏菌( r a l s t o n i as p ) x j l 2 b 的a h l 酰化酶基因a i i d 同源。实验发现，构建的能组成型表达p v d q 的铜绿假单胞菌株不能积累自身 的q s 信号分子3 一o - c 1 2 h s l 。然而，p a 0 1 菌株敲除p v d q 后的突变株仍然能利 用3 0 c 1 2 - h s l 为唯一能源来生长，因此p a 0 1 菌株中必定有另一个酶在降解该 中山大学硕士学位论文 信号分子过程中发挥了作用( s u a n g e ta 1 ，2 0 0 3 ) 。通过比较利用3 一o - c n h s l 以及 利用其他物质进行生长的细菌总蛋白表达的差异，h u a n g 等找到了与p v d q 同源的 另一个酶q t r i p ，它的编码基因是p a l 0 3 2 。基因g 啦，的突变使得铜绿假单胞 菌株