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蛋白酶专一性酶切位点的影响因素分析摘要：生物活性肽(bioactive peptides)是具有特殊生理功能的肽。酶法水解蛋白质广泛用于制备生物活性肽，但酶解法存在目标肽得率低、副产物过多的缺点。蛋白酶和蛋白质的选择是关键步骤，局部构象、三维结构、实验条件以及其它偶然因素也会影响蛋白水解酶的酶切效果。本文综述了温度、pH值、温度和pH值共同作用、金属离子对酶切位点的影响，旨在为研究酶切规律、制备高得率活性肽提供理论基础。关键词：生物活性肽；蛋白酶；水解条件；酶切位点Influencing Factors Analysis of Protease Specific Cleavage SitesAbstract: Bioactive peptides are fragments with specific amino acid sequences that exert a positive physiological influence on the body. Many reported Bioactive peptides are produced by enzymatic hydrolysis,but there are disadvantages of by-product and low yield.The choice of protease and protein source is a key step,and many factors such as local conformation,tertiary structure, experimental conditions and causal interference can influence the protease hydyolysis.This article presents the influencing fators,temperature,pH values,temperature combined pH values and metal ions included,to provide theoretical basis for enzymatic law analysis and higher yield bioactive peptides production.Key words:bioactive peptides;protease;hydrolysis conditions;protease cleavage sites1. 前言生物活性肽(bioactive peptides)是具有特殊生理功能的肽，是氨基酸以不同组成和排列方式构成的不同肽类的总称（氨基酸数目一般小于100）。生物活性肽有的是天然存在的，如谷胱甘肽、催产素、加压素、舒缓激肽、部分抗菌肽等，有的生物活性肽是以非活性的状态存在于某些蛋白质中，当用特定的蛋白酶水解后被释放出来，才成为有特定生理活性的肽。同种蛋白质经不同的蛋白酶酶解后，可以产生具有不同氨基酸序列、不同生理功能的生物活性肽，如大豆蛋白、卵清白蛋白、牛乳蛋白、酪蛋白经不同的蛋白酶酶解可以产生具有降血压、抗氧化、防病、祛病、增强人体免疫力、促消化吸收等不同生理作用的肽1。由于生物活性肽在药物、保健品等领域具有广阔的应用前景，因此对生物活性肽的研究与开发具有重要意义。2. 生物活性肽的制备为了研究生物活性肽的结构与功能，开发相关药物或保健品等，需大量制备生物活性肽。目前，获得生物活性肽的主要途径有以下3种：直接分离提取；化学合成或重组DNA技术；体外水解蛋白质1。天然生物活性肽分布很广泛，目前已经从动物、植物、微生物及部分海洋生物中直接分离出多种生物活性肽。天然生物活性肽通常具有高效、低毒、无污染等特点2。化学合成法有固相与液相两种方式，其基本原理几乎一样。化学合成法发展较早，也比较成熟。重组DNA法一旦建立好系统，就可以大量地重复性生产所要的活性肽。然而，这些制备方法存在一定的局限性。生物活性肽在生物体内的含量一般是微量的，如谷胱甘肽、催产素等，而且目前从天然生物体中分离纯化获得活性肽的工艺还不是很完善。化学法合成仍有许多缺点，包括消旋化现象；侧链官能团需要保护；整体效率低；使用大量的有毒溶剂，且成本高昂。因此化学合成法多半用在实验室，或是高价肽的生产上。重组DNA技术在基因的表达与产品回收上仍有问题，同时该法生产的活性肽种类也有限制，不能生产酰胺肽，也不适合制备短链肽3。酶法水解由于反应较温和、对蛋白质营养价值破坏小、使用的试剂毒性较低、反应具有空间立体性、产物没有消旋化现象、反应位点具有方向性、无异味等优越性，在现阶段被广泛用于制备生物活性肽。生物活性肽具有促进矿物质吸收、抑制细菌、抗高血压、抗氧化、抗疲劳、神经调节、免疫调节等生理活性，而这些功能是原蛋白质或其组成氨基酸不具备的，且许多活性肽的组成氨基酸不一定是必需氨基酸，选择合适蛋白酶水解把其有生物活性肽链片段释放出来，从而制备出具有各种各样生理功能的生物活性肽。这就为更充分的利用蛋白质资源，特别是为那些原本认为生物效价不高的蛋白质资源提供了新的机遇4。迄今，获得生物活性肽的大量研究主要集中在蛋白质水解酶和蛋白质的筛选以及酶解条件的优化上，通过改善水解工艺，进一步提高生物活性肽得率。随着生物信息学的发展及生物活性肽研究的不断深入，越来越多的蛋白质一级结构及活性肽的氨基酸序列得到阐明，免疫学的发展使得蛋白酶的酶切位点也越来越明确，这为从原料蛋白质中寻找已知氨基酸组成序列的生物活性肽提供了基础。研究表明，具有特定生物活性的肽具有相似的结构特征，而其活性与肽的理化性质相关。因此，根据活性肽的氨基酸组成结构信息和不同蛋白酶的水解位点特异性可以利用计算机使用特定酶模拟定向的释放活性肽，如黎观红等（2003）利用Access数据库软件建立了一个生物活性肽数据库，利用自编程序可用来寻找蛋白质中潜在的生物活性肽从该蛋白质中释放出来的适宜的酶。陈征松等（2007）建立了活性肽搜寻与蛋白模拟水解数据库，实现了蛋白质用单酶或者复酶的模拟水解。Vanessa Vermeirssen等（2004）建立蛋白质数据库并进行了实验，取得初步成果。但酶法制备活性肽过程中一个具有挑战性的问题是，在蛋白质酶切过程中，会出现漏切位点和非专一性酶切位点，最终无法保证绝对把蛋白质酶切为常规的肽段，造成许多不必要的产物生成。这是利用蛋白酶催化合成活性肽最明显的副作用。对于常用的酶解来说，局部构象、三维结构、实验条件、酶切位点附近的其它氨基酸以及其它偶然因素都会影响蛋白水解酶的酶切效果5。因此，研究蛋白质的酶切位点的影响因素，分析蛋白质的酶切规律，对制备高纯度、高产率的目标活性肽以及进一步研究其活性与结构的关系，具有重要意义。3. 蛋白酶和蛋白质的选择蛋白酶的选择是酶法制备活性肽的关键步骤。在酶的筛选过程中，应以原料蛋白的组成和酶的专一性为参考，也可根据目标活性肽的结构特点进行选择或通过酶工程来生产特定酶6。根据水解方式不同可将目前常用蛋白酶分为以下2类7：（1）内切酶：作用于蛋白质分子内部肽键。包括动物蛋白酶，如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶等；植物蛋白酶，如木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶等；以及微生物来源蛋白酶，如丹麦Novo公司生产的碱性蛋白酶Alcalase、复合蛋白酶Protamex、中性蛋白酶Neutrase等。（2）外切酶：作用于蛋白质或多肽分子氨基或羧基末端的肽键，生成游离氨基酸，其中作用于氨基末端的称为氨肽酶，作用于羧基末端的称为羧肽酶。外切酶的一个重要特性就是能够把处于肽链末端的疏水性氨基酸水解出来，降低多肽的苦味。常见的一些蛋白酶及其作用位点见表1。表1常见蛋白酶的作用位点种类来源最适pH作用位点胃蛋白酶胃黏膜23Phe-，Leu-胰蛋白酶胰脏79Arg-，Lys-胰凝乳蛋白酶胰脏3.7Tyr-，Trp-，Phe-，Leu-木瓜蛋白酶木瓜果实57Arg-，Lys-，Phe-X菠萝蛋白酶菠萝果实57.5Lys-，Ala-，Tyr-，Gly-碱性蛋白酶Carlsber 枯草杆菌6.58.5Ala-，Leu-，Val-，Tyr-，Phe-，Try-许多动物蛋白和植物蛋白都可作为的来源。部分活性肽来自乳蛋白、酪蛋白、乳清、鸡蛋和肌肉蛋白质等动物蛋白质。此外，海洋生物如鱼、鲑鱼、牡蛎、大型藻类、鱿鱼、海胆、虾、雪螃蟹、海马也可作为活性肽的蛋白质源。植物蛋白质常用的包括大豆、豆类（扁豆、鹰嘴豆、豌豆和豆类）、燕麦、小麦、火麻仁、油菜和亚麻籽。目前，选择用于制备活性肽的蛋白质应该基于2个标准8：（1）使用未充分利用能够进一步增值且蛋白质含量丰富的食品工业副产物；（2）含有特定氨基酸序列或特定药理氨基酸残基的蛋白质。蛋白质的合理选择，对提高目标肽的产率至关重要。4. 酶切位点的影响因素分析4.1. 温度对酶切位点的影响4.1.1. 对专一性酶切位点的影响一般情况下，蛋白酶在最适温度时酶切速率最大，偏离最适温度时活性降低。温度变化影响蛋白质的空间结构，从而影响了其对蛋白酶的亲和力。例如温度升高时，蛋白质底物中更多的酶切位点暴露出来，酶切更容易进行。研究发现，随着温度升高，蛋白质中更多的专一性酶切位点被水解，水解范围更广泛。Seronei Chelulei Cheison等（2011）使用MALDI-TOF-MS（基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱）分析了温度变化（25、37.5、和50）结合不同的碱性pH值（7.8、8.65、9.5）对胰蛋白酶水解-乳球蛋白模式的影响9。一般情况下，胰蛋白酶为肽链内切酶，水解赖氨酸或精氨酸的羧基与其它氨基酸（脯氨酸除外）形成的肽键。结果发现，随着温度升高，更多的赖氨酸残基和精氨酸残基被水解。在pH7.8和50的条件下水解10分钟之后，所有可能的专一性酶切位点都被水解。因为脯氨酸能影响蛋白酶水解肽键，所以Lys47-Pro48未被水解。在25，只有-乳球蛋白的末端区域被酶解，然而，随着温度升高，-乳球蛋白中心区域也开始被水解。Blanca Hernandez-Ledesma（2006）将牛的-乳球蛋白A（-Lg A）在非变性和变性加热条件下用嗜热菌蛋白酶水解，用HPLC-MS/MS确定水解过程中释放的肽段10。一般情况下，嗜热菌蛋白酶水解疏水性或芳香族氨基酸的氨基端肽键，例如亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和缬氨酸。在37反应5分钟后，总共确定了水解产物中的25个肽段，这些肽段一直到更高的保温温度时才进一步水解。此外，在60和80之间的范围内发现了新的酶切位点，这些酶切位点位于-乳球蛋白的最深埋区域。在60和80之间的范围内水解30分钟后所得产物中发现了三个新的肽段：LDA、LKPTPEGD、LQKW，相关的位点为Leu122-Val123、Glu127-Val128、Ala132-Leu133。但它们在37和5030分钟水解物并没有发现。其中的LQKW据报道是一种高效ACE抑制剂。温度变化引起了-乳球蛋白构象的变化，使得这些肽键更容易被嗜热菌蛋白酶水解。提高酶解温度到60以上，可在更短保温时间内释放出肽段LQKW。4.1.2. 对非专一性酶切位点的影响随着温度升高，更多的酶切位点暴露出来，在加强专一性酶切的同时，也较易出现非专一性酶切现象。Seronei Chelulei Cheison等（2011）使用MALDI-TOF-MS（基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱）分析了温度变化（25，37.5，和50）结合不同的碱性pH值（7.8，8.65，9.5）对胰蛋白酶水解-乳球蛋白模式的影响9。结果发现，水解环境也影响非特异性裂解，在较高温度（50）下更容易出现胰凝乳酶式的酶切。胰凝乳蛋白酶，和胰蛋白酶一样是消化道的丝氨酸蛋白酶。它催化的羧基端侧的肽键水解的酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，其中都含有一个与疏水腔相匹配的芳环。此外，它也能水解亮氨酸的羧基端。此外，二次水解胰凝乳蛋白酶能水解蛋氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、组氨酸、甘氨酸和丙氨酸的羧基端。新出现的酶切位点为Leu10-Asp11、Gly17-Thr18、Ser21-Leu22、Ser30-Leu31、Tyr42-Val43、Thr49-Pro50、Val118-Cys119、 Leu133-Glu134、Tyr20-Ser21。相关的肽段为f(43-49)、f(21-30)、f(18-28)、f(11-21)和f(119-133)。只有一个肽（f（18-28）在25和37.5能酶切生成，而大部分片段只能在50下才能生成。胰蛋白酶出现胰凝乳蛋白酶式的酶切，可能是由于胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的本质特性催化三联体（His57、Asp102和Ser195）是相同的。此外，胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶约40的氨基酸序列是相同的。因此，在40以上时，催化中心发生了构象变化，允许更多的氨基酸结合，而这催化中心一般情况下是很紧密的。4.2. pH对酶切位点的影响酶蛋白分子上带有很多酸性、碱性氨基酸残基，pH值的变化直接影响到这些残基侧链基团的解离状态。pH值对酶解反应的影响主要有三个方面：（1）引起酶蛋白的空间结构变化；（2）改变酶蛋白中活性部位的解离状态；（3）改变蛋白质底物的空间结构和解离状态。4.2.1. 对专一性酶切位点的影响研究发现，在最适pH值专一性酶切位点水解速率最大，偏离最适pH值时出现了非专一性酶切位点。部分专一性酶切位点对蛋白酶解呈抵抗性。Julian R. Reid等（1997）研究了pH值（2.66.6）对凝乳酶水解-酪蛋白及其巨肽的影响11。凝乳酶能专一地切割-酪蛋白的Phe105-Met106之间的肽键。结果发现，在pH 4.6下-酪蛋白肽键Phe105-Met106的水解速率最大。Seronei Chelulei Cheison等（2011）使用MALDI-TOF-MS（基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱）分析了温度变化（25、37.5和50）结合不同的碱性pH值（7.8、8.65、9.5）对胰蛋白酶水解-乳球蛋白模式的影响9。结果发现，Lys60, Lys75和Lys77在pH7.8下的水解时间在15s之后，在pH8.65和pH9.5下则15s内能被水解。而且，Lys91-Val92和Lys138-Ala139在pH8.65下能抵制胰蛋白酶酶解，而Lys70-Ile71是在 pH 9.5。Lys101-tyr102在50、较高的pH值8.65和9.5下能抵抗酶解，而在pH值7.8下却不能。Seronei Chelulei Cheison等认为，碱性pH可能通过以下方式改变-乳球蛋白和/或胰蛋白酶的结构，从而影响键酶切。首先，结合较高温度（50）和较高pH值（8.65、9.5）引起-乳球蛋白结构改变进而导致变性。在pH 9.5，羧基端的酪氨酸残基也有影响，在该pH下开始去质子化，因此，对胰蛋白酶的亲和力可能会受到影响。这些结果证实了水解条件变化对酶解模式的影响。在这些条件下未能水解一些肽键，可用以保护某些肽段，使酶解朝着某一特定目标产物进行。4.2.2. 对非专一性酶切位点的影响研究发现，在蛋白酶最适pH值和偏离最适pH值下均检测到了蛋白酶的非专一性酶切，在后者条件下发生的范围更广泛。Seronei Chelulei Cheison等（2011）使用MALDI-TOF-MS（基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱）分析了温度变化（25、37.5和50）结合不同的碱性pH值（7.8、8.65、9.5）对胰蛋白酶水解-乳球蛋白模式的影响9。结果发现胰蛋白酶的酶切位点由羧基端变为氨基端的现象。在pH7.8下检测到了精氨酸残基氨基端的裂解，在pH7.8、8.65、9.5下均检测到了精氨酸残基氨基端的裂解。Julian R. Reid等（1997）研究了pH值（2.66.6）对凝乳酶水解-酪蛋白及其巨肽的影响11。结果发现，在pH6.6下，检测到了低浓度的肽段Phe18-Leu32、Ser33-Tyr42和Trp76-Phe105，在pH5.6及以下则发现了其互补肽段Tyr43-Gln75。这些是-酪蛋白每个pH值主要的TCA可溶二次水解产物，其相关的肽键为Phe17-Phe18、Leu32-Ser33、Tyr42-Tyr43和Gln75-Trp76。4.3. 温度和pH值对酶切位点的共同影响研究发现，某些酶切位点只在特定的温度和pH值裂解。肽键裂解的时间也有所差异，从而释放出相应的肽段。这表明，可通过对酶解条件的控制而获得某些拥有特定序列的肽或者保护某些重要的肽段。Seronei Chelulei Cheison等（2011）使用MALDI-TOF-MS（基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱）分析了温度变化（25、37.5和50）结合不同的碱性pH值（7.8、8.65、9.5）对胰蛋白酶水解-乳球蛋白模式的影响9。结果发现，在每个水解条件下的前15s，Lys8、Lys100、Arg124、Lys141和Arg148的羧基端酶切位点都被水解了。可通过-乳球蛋白的结构解释，因为在反应起点，所有这些肽键位于暴露的氨基端和羧基端，容易被酶水解。在所有条件下的-乳球蛋白水解结果显示，肽键Lys8-Gly9、Lys141-Ala142和Arg148-Leu149是初始酶切位点。在最优条件37.5和pH7.8下，八个肽键在最初的15s内被水解 ，而最多肽键的断裂出现在50和pH7.8时，一共有10个。因为此条件下，-乳球蛋白的降解速率很高。此外，可能是因为较高的温度引起蛋白结构变化，pH值7.8是胰蛋白酶的最适pH值，蛋白质更易被水解。这也符合为何-乳球蛋白的中心区域（Lys60、Lys75和Lys77）在此条件下也被水解了。Seronei Chelulei Cheison等将胰蛋白酶在最适温度和pH（37.5，pH7.8）的酶解结果和25和pH7.8的进行比较，最适条件下的部分酶切位点在25和pH7.8下水解时间延长或不水解。例如Lys60-Trp61和Lys70-Ile71，在在25和pH7.8下10分钟内并未水解，而Lys75-Thr76，Lys77-Ile78，Lys83-Ile84，Lys91-Val92，Lys101-Tyr102，Lys135-Phe136，Lys138-Ala139的裂解时间比最优条件（37.5，pH值7.8）长。这表明，可通过控制胰蛋白酶水解-乳球蛋白的条件来获得某些特定的肽。结果还发现，在所有水解条件下，Arg124-Thr125和Arg148-Leu149的酶切割时间没有差异，Arg40-Val41也几乎相同。因此，精氨酸残基的裂解受水解条件的影响更小一些。4.4. 金属离子对酶切位点的影响部分金属离子能作为蛋白酶的激活剂，金属蛋白酶更是本身活性中心就含有金属离子（如锌、钴、镍等），且依靠金属离子催化肽键水解。另外，金属离子也能和蛋白质底物结合引起蛋白质结构变化，从而对酶切位点造成影响。Jean-Francois Lapointe等（2003）研究了钙离子对嗜热菌蛋白酶水解-酪蛋白胰蛋白酶水解肽的影响12。结果发现，嗜热菌蛋白酶水解-CN 1-25肽过程中，钙离子的存在改变了一些肽段的释放速度，特别是那些由Ser22-Ile23和Glu11-Ile12肽键裂解所得的肽。这些肽键都位于磷酸丝氨酰基附近。钙离子和磷酸丝氨酸残基的结合可能会引起肽结构的变化，反过来影响了这些特异性酶切肽键与酶之间的亲和力。Jean-Francois Lapointe等认为磷酸丝氨酰基和钙离子的相互作用能使负磷酸基团之间的静电斥力，从而提高分子的灵活性。因此，加入钙离子能加速肽段-CN 6-22和-CN 12-22的释放，这两个肽段含有-CN 1-25原始序列中4个磷酸丝氨酸残基的完整酰基。5. 结论通过酶解蛋白制备活性肽有许多的优点，但酶法存在一个问题，在酶解过程中，局部构象、三维结构、实验条件、酶切位点附近的其它氨基酸以及其它偶然因素都会影响蛋白水解酶的酶切效果，从而产生很多不必要的副产物。研究蛋白酶酶切位点的影响因素，分析其酶切规律，提高目标肽的得率，具有重要意义。当温度、pH值、金属离子等水解条件变化时，蛋白酶酶切位点会发生不同程度的变化。（1）在最适温度和最适pH下，专一性酶切速率加快，不易出现非专一性酶切位点；（2）当偏离最适温度和最适pH时，容易出现非专一性酶切位点。部分专一性酶切位点对蛋白酶酶切呈抵抗性。（3）金属离子会影响某些肽段的释放速率。这表明，控制酶解条件可以作为制备高得率目标肽的一种方法，更多的研究应该集中在酶切规律总结以及具体操作方法上。参考文献:1张少斌,张力,梁玉金,等.生物活性肽制备方法的研究进展J.黑龙江畜牧兽医,2011,39(6):39-41.2魏宗友,潘晓花,季昀.生物活性肽的制备、功能及在动物生产中的应用研究进展J.中国饲料,2010,23:22-26.3尹树花,郭丽梅,刘宏魏.酶解植物蛋白制备小分子肽的研究进展J.江西饲料,2010,11(4):11-14.4李建杰,叶磊,荣瑞芬.生物活性肽的酶法制备及分离鉴定研究进展J.食品研究与开发,2012,33(2):195-199.5刘辉,张纪阳,孙汉昌,等. 基于马尔科夫链的胰蛋白酶肽段蛋白酶切位点概率预测J.生物物理学报,2011,27(6):528-536.6 朱少娟,施用晖,乐国伟.超声波对胰蛋白酶水解酪蛋白的影响J.食品与生物技术学报,2005,24(2):50-547郭红英.麦胚蛋白酶解物的制备及其抗氧化功能研究D.江苏大学,20098 Udenigwe C C,Aluko R E. 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