生物技术概论蛋白质工程.ppt

第三章 蛋白质工程 Protein Engineering,主讲教师 林娜 硕士,主要讲授内容： 1 概述 2 蛋白质的结构基础 3 蛋白质工程的研究方法 4 蛋白质工程技术的应用 5 蛋白质组学,本章要求： 了解蛋白质的基础结构 理解蛋白质的研究方法 了解蛋白质的运用 了解蛋白质组学,在自然界中，构成生命最基础的物质有： 蛋白质 最重要 核酸 最根本 多糖 脂类,各种生命功能、生命现象、生命活动都和蛋白质有关,1 概述 1.1 蛋白质,蛋白质很重要具体表现在：,1）蛋白质执行着酶的功能 2）通过激素调节代谢作用 3）产生相应的抗体 4）构建各种生物膜,1.2 蛋白质工程,蛋白质工程就是在蛋白质的结构与功能为基础，利用基因工程的手段，按照人类自身的需要，定向地改造天然的蛋白质，甚至创造新的、自然界本不存在的、具有优良特性的蛋白质分子。 蛋白质工程自诞生之日起，就与基因工程密不可分。,2.1 蛋白质的一级结构（primary structure) 2.1.1 定义 指氨基酸按一定的顺序通过肽键相连而成的多肽链，也是蛋白质最基本的结构。 2.1.2 Anfinsen原理 每一种蛋白质分子都有自己特有的氨基酸的组成和排列顺序即一级结构，由这种氨基酸排列顺序决定它的特定的空间结构，也就是蛋白质的一级结构决定了蛋白质的二级三级等高级结构,2 蛋白质的结构基础,2.1.3 等电点,蛋白质颗粒的电荷，既取决于其分子组成中碱性和酸性氨基酸的含量，又受所处溶液的pH影响。 当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质游离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子（净电荷为O)，此时溶液的pH值称为蛋白质的等电点pI)。,2.1 蛋白质的一级结构,2.2 蛋白质二级结构（secondary structure）,2.2.1 定义 二级结构是指多肽链借助于氢键沿一维方向排列成具有周期性的结构的构象，是多肽链局部的空间结构（构象） 2.2.2 主要形式 -螺旋、-折叠、-转角等,四种不同的螺旋,在平行（A）和反平行（B）折叠片中 氢键的排列,反向折叠,RNase的一些二级结构,2.3 三级结构（tertiary structure）,三级结构主要针对球状蛋白质 是指整条多肽链由二级结构元件构建成的总三维结构,胰岛素的三级结构,2.4 四级结构（quaternary structure）,四级结构是指在亚基和亚基之间通过疏水作用等次级键结合成为有序排列的特定的空间结构。 四级结构的蛋白质中每个球状蛋白质称为亚基,血红蛋白的四级结构,2.5 蛋白质分子间的相互作用,亚基间的聚合可以被解离，可以重新聚合 四级结构的蛋白质分子亚基间可以杂交 多肽与蛋白质分子间可以聚合,2.6 蛋白质空间结构分析 蛋白质工程的核心内容之一就是收集大量的蛋白质分子结构的信息，以便建立结构与功能之间关系的数据库，为蛋白质结构与功能之间关系的理论研究奠定基础。 蛋白质数据库，HPDB数据库 蛋白质空间结构预测，如 Homology 等软件分析,常用蛋白序列和结构数据库,PDB蛋白质三维结构 SWISS-PROT蛋白质序列数据库 PIR蛋白质序列数据库 OWL非冗余蛋白质序列 EMBL核酸序列数据库 TrEMBLEMBL的翻译数据库 GenBANK核酸序列数据库 PROSITE蛋白质功能位点 SWISS-MODEL从序列模建结构 SWISS-3DIMAGE三维结构图示 DSSP蛋白质二级结构参数 FSSP已知空间结构的蛋白质家族 SCOP蛋白质分类数据库 CATH蛋白质分类数据库 Pfam蛋白质家族和结构域,2.7蛋白质结构与功能的关系,2.7.1 结构决定功能 必须基团、非必须基团 2.7.2 如何利用结构执行特定的功能的呢？ 正逐步被揭示,3 蛋白质工程的研究方法 3.1蛋白质工程的研究策略,反向生物学技术 根据对天然蛋白质结构与功能分析建立起来的数据库里的数据，可以预测一定氨基酸序列肽链空间结构和生物功能； 反之也可以根据特定的生物功能，设计蛋白质的氨基酸序列和空间结构。,序列功能预测流程图,蛋白质结构预测流程图,3.2 蛋白质全新设计,3.2.1 设计目标的选择 3.2.2 蛋白质设计技术与方法 序列最简化法 3.2.3 改变现有蛋白质的结构 3.2.3.1 基本步骤 3.2.3.2 人工定点突变 M13载体法 PCR法,4 蛋白质工程技术的应用,4.1 胰蛋白酶 4.2 金属硫蛋白 4.3 人白细胞介素-2 4.4 组织纤溶酶原激活因子 4.5 枯草杆菌蛋白酶,金属硫蛋白 （Metallothionein) ，简称MT,含有丰富的巯基，能螯合大量的金属离子 MT分子呈椭圆形，分子量为6500道尔顿，两个结构域拼接在一起，每个分子含7-12个金属原子，具有特殊的光吸收，构象较坚固，具有较强的耐热性。,4.2 金属硫蛋白,金属硫蛋白的六大功能,1)清除体内自由基、防止机体衰老：MT是体内清除自由基能力最强的一种，其清除羟自由基的能力约为SOD的10,000倍 2)解除重金属的毒性：MT的巯基基团（-SH）能强烈螯合有毒金属汞、银、铅、镉、砷、铬、镍等 3)参与体内微量元素的代谢：在体内，MT可根据体内微量元素的状况对锌、铜、锰、铁、钼、硒、钴、碘的吸收、储存、运输和释放等进行精细调节，使机体达到最佳生理状态。,4.2 金属硫蛋白,4)增强机体对各种不良状态的适应能力：当机体处于各种不良状态时，体内MT含量增加，从而提高锌、铜、锰、铁、钼、硒、钴、碘等微量元素的浓度，机体适应能力随之增强。 5)锌元素的贮存库：每100毫克锌金属硫蛋白含6.9毫克锌，肝、肾中的锌元素主要是以金属硫蛋白的形式贮存。 6)防止细胞癌变：MT可消除自由基、重金属（砷、汞、镉、铬、镍）、烷化剂、电离辐射以及紫外线对DNA、RNA、酶、蛋白质以及细胞膜的损伤，从而可以防止它们的致癌、致突变作用,4.2 金属硫蛋白,从1978年到2019年共举行了四次国际专题研讨会，我国将MT列入863重大攻关计划，2019年列入国家级火炬计划。 结果表明：MT在抗电离辐射、紫外线照射、解除金属毒素、治疗消化道溃疡、心肌梗塞、各种炎症、各种癌症、美容护肤、减轻吸烟及环境污染对人体的危害及抗过敏等方面均有显著疗效。,结构域的拼接,5 蛋白质组学（Proteomics） 2019年的Science杂志已把蛋白质组学列 为六大研究热点之一，其“热度”仅次于干细胞研究,5.1 人类蛋白质组计划概述,2019年，国际人类蛋白质组组织宣告成立。 一项是由中国科学家牵头执行的“人类肝脏蛋白质组计划”； 另一项是以美国科学家牵头执行的“人类血浆蛋白质组计划”，由此拉开了人类蛋白质组计划的帷幕。,5.2 蛋白质组学研究的研究意义和背景,随着人类基因组计划的实施和推进，生命科学研究已进入了后基因组时代。在这个时代，生命科学的主要研究对象是功能基因组学，包括结构基因组研究和蛋白质组研究等。 2019年，澳大利亚建立了世界上第一个蛋白质组研究中心：Australia Proteome Analysis Facility ( APAF ),5.3 蛋白质组学的研究内容包括：,5.3.1 蛋白质鉴定：可以利用一维电泳和二维电泳并结合Western等技术，利用蛋白质芯片和抗体芯片及免疫共沉淀等技术对蛋白质进行鉴定研究。 5.3.2 翻译后修饰：很多mRNA表达产生的蛋白质要经历翻译后修饰如磷 酸化，糖基化，酶原激活等。翻译后修饰是蛋白质调节功能的重要方式。 5.3.3 蛋白质功能确定：如分析酶活性和确定酶底物，细胞因子的生物分析，配基-受体结合分析，基因表达产物-蛋白质的功能分析。另外对蛋白质表达出来后在细胞内的定位研究也在一定程度上有助于蛋白质功能的了解。荧光蛋白表达系统就是研究蛋白质在细胞内定位的一个很好的工具。 5.3.4 分子医学的发展。如寻找药物的靶分子。很多药物本身就是蛋白质，而很多药物的靶分子也是蛋白质。药物也可以干预蛋白质-蛋白质相互作用。,5.4 蛋白质组学研究技术,5.4.1 蛋白质组研究中的样品制备 5.4.2 蛋白质组研究中的样品分离和分析 双向凝胶电泳质谱技术、二维色谱 (2D-LC)、二维毛细管电泳 (2D-CE)、液相色谱毛细管电泳 (LC-CE),5.5 蛋白质组学发展趋势,在基础研究方面，蛋白质组研究技术被应用到各种生命科学领域 在应用研究方面，蛋白质组学将成为寻找疾病分子标记和药物靶标最有效的方法之一 在技术发展方面，蛋白质组学的研究方法将出现多种技术并存，各有优势和局限的特点,5.6 蛋白质组学在临床研究中的应用,临床蛋白质组学是将蛋白质组学技术应用于临床医学研究，它主要围绕疾病的预防、早期诊断和治疗等方面