医学生物技术论文.doc

贵阳医学院基础医学院2006届基础医学（生物技术方向）专业本科学位论文 论文题目：maf-1基因的时空差异表达研究学 生：伍 凤 年 级：2006级 专 业：医学生物技术 指导教师：吴建伟教授 付萍讲师 实习单位：生物技术实训中心 2011年 3 月 3 日目 录摘 要 第3页1. 前 言 第4页2. 材料与方法 第6页3. 结 果 第11页4. 讨 论 第15页参考文献 第17页致 谢 第19页maf-1基因的时空差异表达研究学生：伍凤 导师：付萍讲师【摘要】 家蝇体内丰富的抗细菌肽、抗真菌肽等是其免疫防御机制中不可或缺的部分。家蝇抗真菌肽-1（musca domestica antifungal peptide-1,maf-1）是从家蝇幼虫血淋巴中所提取的，并采用固相萃取结合反相高效液相色谱(rp-hplc)的方法分离到的一种新发现的抗真菌肽。为了进一步研究该基因在家蝇幼虫各个部位以及各个龄期的表达是否存在着差异，我们采用了real time-pcr技术研究了该基因在不同的发育时期(卵、1龄幼虫、2龄幼虫、3龄幼虫、蛹、成虫以及雌雄)和幼虫不同的部位(脂肪体、肠道、体壁、唾液腺)的表达量，结果显示maf-1基因在所选的不同时期个部位都有所表达。其中幼虫期间的表达量比较高，而不同部位中，唾液腺、脂肪体表达量较高。而且，在整个家蝇的生长发育阶段，maf-1基因的表达量是呈现下降趋势的。进一步肯定了抗菌肽在家蝇的免疫防御体系和生长发育期间，尤其是幼虫期间发挥着重要作用。为其下一步更深入探索其免疫机制的研究，丰富对昆虫天然免疫的认识及新一代抗真菌生物制剂的研制奠定了理论基础。【关键词】家蝇 抗菌肽maf-1 real time-pcr 时空表达abstract inside the house antimycobacterial peptides, rich of antifungal peptide immune defenses such is the indispensable part. domestica antifungal musca domestica peptide - 1 (musca domestica antifungal peptide-1, maf - 1) domestica larva in from blood lymph extracting, and by solid-phase extraction combined with reversed phase high performance liquid chromatography (hplc) method of rp - a new separation to discovery of antifungal peptides. in order to further study the gene domestica larva each place and all periods of expression whether there is any difference between, we use the real time-pcr technology research the genes in the different developmental stages (eggs, larvae, 2 age 1 year, 3rd instar larvae grubs and pupa, adult and male and female) and different parts (fat body, the intestinal tract, the body wall, salivary gland) expression and results showed that in re-ligion maf - 1 genes in different periods of a site have expressed. the expression of larvae quantity taller during, and different parts of salivary glands, fat body, express high. and, in the whole growth stage, the domestica maf - 1 gene expression of the quantity is the downward trend. further affirmed domestica antibacterial peptides in the immune defense system and growth plays an important role. for its next more in-depth study of exploring the immune mechanism of insects, rich natural immune awareness and a new generation of antifungal biological preparation research laid a theoretical foundation. keywards：musca domestica antifungal peptide af-1 rt-pcr temporal and spatial expression 前言 昆虫是世界上最大的生物种群。为适应各种不同的生态环境，它们形成了独特的免疫系统，即缺乏b、t淋巴系统，不能产生免疫球蛋白和补体。昆虫特别是蝇类能够有效的抵御病原微生物的入侵, 而本身不受感染. 天然免疫是它们对抗各种微生物入侵的一线防御系统, 这和哺乳动物有一定的相似性, 这说明了它们之间有一定的进化关系1,2.近年来研究发现昆虫体内许多活性物质，具有高等动物免疫分子类似的功能，如抗菌肽便是典型的代表。白1974年boman等首次从惜古比天蚕蛹诱导分离纯化出第一种天然抗菌肽天蚕素(cecropin)以来，昆虫抗菌肽逐渐成为生命科学领域研究的热点。目前研究表明, 以cecropins, attacins, drosomicins 等抗菌肽产物为基础的天然免疫是昆虫抵御病原体和寄生虫的重要防线.近年来, 人们也开始在蝇类中探索免疫系统的起源和进化, 为研究昆虫天然免疫和人类的天然免疫的相关性提供证据.。家蝇(musca domestica)属昆虫纲、双翅目、环裂亚目、家蝇科，是我国大部分地区最常见、数量最多的一种媒介昆虫。在自然界中，家蝇是传播疾病的重要媒介害虫，它能给人、畜传染多种疾病，但自身并不染病，即使在高密度人工饲养的条件下也不会发生大规模传染病而死亡。家蝇对恶劣环境具有极强的适应能力和独特的免疫防御机制(王继恒等，2000)，预示家蝇体内含有丰富的抗菌物质。目前，家蝇的高效抗病能力的研究受到了广泛的关注(崔晓江，刘枝俏，1995；okada，natori，1984；孙刚等，1995；赖凡等，1999)。家蝇体内外具有多种抗菌物质是其在杂菌横生的环境中得以生存的重要物质基础，对家蝇抗菌活性物质的进一步研究具有十分重要的理论意义和应用价值。有关学者已在地中海实蝇ceratitiscapitata、4果蝇drosophilam elanogaster5和厩赦蝇stonxoxyspo regrinn6中分离到具有不同生物活性的抗菌肤。在棕尾别麻蝇sarcophagaperegrina和伏蝇phormia terranova。体内分离到了sarcotoxini 7.8.9和diptericin等 具有抗菌活性的蛋白。而在家蝇血淋巴中既分离到了分子量较小的生物活性肤/蛋白，又分离到分子量较大的凝集素溶菌酶等多种抗菌肤。这些抗菌肤抗细菌、真菌、寄生虫，更引人注目的是它们还能杀伤多种肿瘤癌细胞和病毒，而对正常的体细胞无毒副作用。抗革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，如金黄色葡萄球菌、白葡萄球菌、绿脓假单胞菌、大肠杆菌等。还抗植物细菌性病害如水稻白叶枯病菌，大白菜软腐病菌和引起人类疾病的痢疾杆菌、肺炎杆菌。对一些真菌如白念珠菌和白僵菌也有很好的生物活性，也对令人畏惧的肿瘤癌细胞有活性。邱晓燕等分离到分子量为4 kda和9.6 kda的抗菌肤，较低浓度下能有效抑制人胃癌细胞mgc80-3和bgc-823、人乳腺癌细胞mcf-7以及人肺癌细胞spc-a-1的体外增殖。11还抑制病毒侵染和繁殖，陈艳等用蝇蛆组织匀浆液处理流感病毒表现出非常好的防效。12这些抗菌肤活性浓度在ug/ml级，其抑菌效果与传统抗生素相当甚至超过之。有报道表明苍蝇抗菌肤的抗菌活性超过了青霉素13，与目前广泛使用的抗生素及农用杀菌剂不产生交互抗性，不诱导病原菌产生抗性突变，因此有望开发成为新一代优秀抗癌、抗病毒或抗病菌药物。m 家蝇抗真菌肽-1（musca domestica antifungal peptide-1,maf-1）是从家蝇幼虫血淋巴中所提取的，并采用固相萃取结合反相高效液相色谱(rp-hplc)的方法分离到的一种新发现的酸性抗真菌肽。在家蝇防御体系中发挥着重要作用。那么，究竟此抗真菌肽是如何发挥免疫作用，乃至此抗真菌肽在整个免疫系统中是如何表达。换言之，是否此抗真菌肽在家蝇从卵到成虫的各个龄期都有所表达。是否存在雌雄的表达差异。是否于幼虫的各个部位都有所表达，即是否存在着组织分布的特异性。这一系列的问题，都有待着我们进行深入的研究。于是，本文采用了real time-pcr技术对该基因在不同的发育时期(卵、1龄幼虫、2龄幼虫、3龄幼虫、蛹、成虫以及雌雄)和幼虫不同的部位(脂肪体、肠道、体壁、唾液腺)的表达情况进行研究分析。材料与方法1.材料1.1 实验蝇株来源 实验室虫室常规养殖。温度（25）相对湿度（80%）光照（12h/d）1.2 maf-1序列来源 前期从家蝇幼虫分离到的maf-1蛋白的n端序列，通过race技术获得了maf-1的部分cdna序列，已登录到genbank，获得登录号，登录号hm178948。1.3 主要生物信息学分析网站，软件和引物设计软件 家生物技术信息中心网站（national center for biotechnology information,ncbi）；瑞士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统网站（expert protein analysis system,expasy）； dnaman软件；primer premier 5.0; oligo 6.01.4 主要试剂、试剂盒逆转录试剂盒（abi公司）；primescript rt reagent kit with gdna eraser；sybr premix ex taqtm ；限制性内切酶（以上均为大连宝生物公司）；trizol试剂；质粒提取试剂盒；无rnasc的dnase ；taq dna聚合酶；pcr引物；dna marker；1.5 主要溶液01depc水：lmldepc加入1l三蒸水中，振荡过夜后15psi高压灭菌。hepes saline 0.15mol/l nacl,10mmol/l hepes,调节ph=7.0 。20umol/l腺苷hs液 1.336mg 腺苷溶于250ul hs5xtbe电泳缓冲液 tiis碱54g、硼酸27.5g、0.5mol/l edta(ph8.0)加三蒸水至900ml,充分溶解，定容1000ml.使用时，稀释10倍至0.5 x tbe1.6 主要实验仪器 abi 7300 real-timepcr system pcr扩增仪（德国 eppengorf公司）；超净工作台（苏州净化设备有限公司）；显微解剖镜（尼康）；稳压稳流电泳仪（美国ge公司）；紫外分光光度计（美国ge公司）；5415型冷冻离心机（德国eppengorf公司）；pb203-e型电子精密天平（上海梅特勒托利多仪器公司）；微量加量器（10ul 20ul 100ul 1000ul德国 eppengorf公司） 2. 方法2.1 总rna的提取 1）于显微镜下，解剖家蝇三龄幼虫，提取其体壁、肠道、脂肪体、唾液腺，另取家蝇不同的发育时期(卵、1龄幼虫、2龄幼虫、3龄幼虫、蛹、成虫以及雌雄)组织约30ug，分装于ep管中。采用trizol试剂提取总rna。 2)提取物浸于1000ul trizol 中；震荡混匀，避光，反复冻融3次；3)加400ul trizol,室温放置5分钟，加入100ul氯仿，漩涡震摇15s，静置5min，4，12000rpm离心15min。4)仔细吸取上层水相，移至另一新的离心管仲，加等体积异丙醇，上下颠倒混匀。5)室温放置10min，然后于4，12000rpm离心20min沉淀rna，弃去上清。6)加入lml 75乙醇，轻轻震摇，充分洗涤rna沉淀，4，12000rpm离心7500g，5分钟，弃上清，除去乙醇。7)室温干燥rna，重溶rna于100ul rnase-free水中，65水浴10min以助溶。2.2 琼脂糖凝胶电泳鉴定总rna的完整性 对消化后的rna样品用琼脂糖凝胶进行电泳，检测rna分子的完整性。 l)用0.5 x tbe 100ml溶解1g琼脂糖。配置1%琼脂糖凝胶，微波炉加热至完全融化后，室温冷却至60度左右，加入 5ul eb，混匀，倒入插好梳齿的制胶槽中冷却制胶。2)将制好的胶块浸没于装有0.5 x tbe 电泳缓冲液的电泳槽中。3)取1ul rna样品，加入1ul 10 x loading buffer 混匀后上样。4)100v电压下电泳。5)电泳结束后，紫外灯下观察，鉴定rna分子的完整性。 2.3 总rna定量 用98ul milli-q水将 2ul rna 原液稀释50倍后，利用紫外分光光度计分别测定其在 260nm 和 280nm 波长处的吸光度（od260 和 od 280）通过下述公式计算rna的浓度。同时，计算od260 和od280 的比值（od260/od280），当两者的比值在1.82.2时，说明提取的rna纯度高，无蛋白质和dna的残余。 2.4 总rna去除dna基因组 1)在微量离心管中分别加入下列成分试剂使用量5 x gdna raser buffer2ulgdna eraser1ultotal rna1ugrnase free dh2oup to 10ul 2)42反应2分钟2.5 逆转录合成cdna1) 向pcr小管中分别加入下列成分试剂使用量5 x primescript buffer 2(for real time)4ul primescript rt enzyme mix 11ulrt primer mix 1ul2.4的反应液10ulrnase free dh20up to 20ul2) 37 15 min3) 85 5 sec4) -20 保存。2.6 设计引物利用primer premier 5.0 和 oligo 6.0 软件设计引物。引物由takara公司合成。maf-1 forward: 5-tgctgtcttcagtgccatcc-3 reverse: 5-ccctcaatccagaccttcat-3 gapdh forward: 5-catcatctccgctccatc-3 reverse: 5-aagccataccagtgagtttacc-32.7 实时荧光定量rt-pcr分析maf-1基因的时空表达差异样品为家蝇卵、1龄幼虫、2龄幼虫、3龄幼虫、蛹、成虫（雌、雄)和家蝇幼虫脂肪体、肠道、体壁、唾液腺所提取的总rna所反转录的模板cdna。荧光定量pcr反应体系如下试剂使用量终浓度sybr premix ex taptm(2x)25ul1xpcr forward primer (10um)2ul0.4umpcr reverse primer (10um)2ul0.4umrox reference dye(50x)01ul1x模板（cdna）溶液10uldh2o10ultotal50ul使用abi 7300荧光定量pcr仪：95 30秒。95 5 秒、60 34秒：40 cycles.每个模板设立3个复孔，进行数据分析，独立重复3次。 3.0 结果 3.1 maf-1 总rna的提取分别对家蝇的卵、1龄幼虫、2龄幼虫、3龄幼虫、蛹、成虫（雌、雄)和脂肪体、肠道、体壁、唾液腺的总rna进行提取的11个样品的rna琼脂糖凝胶电泳图（图3.1）结果显示可见清晰的28s和18s两条带，表明rna完整性较好，无降解。经分光光度计检测，其od260 od280比值均在2.0左右，介于1.82.2之间，说明rna的纯度较高。3.2 熔解曲线分析在pcr扩增后进行熔解曲线分析，结果见下图。从熔解曲线看出， 目标基因和参照基因的pcr扩增产物分别在84和88达到峰值， 无非特异产物和引物二聚体， 整个实验过程没有污染，目标基因和参照基因表达稳定。maf-1基因熔解曲线图：gapdh基因熔解曲线图：3.3 maf-1基因在各个时期和不同部位的表达差异3.2.1 maf-1基因在家蝇不同时期的表达差异，以卵为参照组，结果如下表。 样品 gapdh基因ct值均数标准差 样品基因ct值均数标准差 ct ct 2-ct 卵17.1290.49424.4750.190 7.346 0 11龄幼虫 18.0060.57918.0491.9290.043-7.303157.915 2龄幼虫18.2570.907 19.0070.831 0.750 -6.596 96.737 3龄幼虫18.7420.76124.2750.7655.533-1.8133.514蛹18.6590.65727.4370.2858.7781.4320.371雄蝇17.4830.72325.8510.7428.3681.0220.492雌蝇 18.3750.94128.3101.8569.9352.5890.166将相对表达值转化为以lo为底的对数，在excel中作图，得到maf-1基因在家蝇从卵到成虫的各个生长发育阶段中的表达对比。如下图3.2.2 maf-1基因在家蝇幼虫各个部位的表达差异，以体壁为参照组，结果如下表。 样品 gapdh基因ct值均数标准差 样品基因ct值均数标准差 ct ct 2-ct 体壁19.3580.465 24.2140.877 4.896 0 1 唾液腺19.6220.473 20.9330.991 1.311 -3.585 12.001 脂肪体19.6900.30121.1980.2011.508 -3.388 10.469 肠道 21.1330.562 25.8731.5214.740-0.1561.114将相对表达值转化为以lo为底的对数，在excel中作图，得到maf-1基因在家蝇幼虫各个部位的表达对比。如下图4.0结论与讨论基因表达是调控生命活动的重要机制, 不同发育阶段、不同生理状态下基因的表达决定了整个生命过程, 包括发育和分化、内环境稳定、对逆环境的反应等, 因此比较不同发育阶段的基因表达可为分析生命活动过程提供重要信息。实时荧光定量rt-pcr技术常常用于对基因mrna的表达水平进行分析，结果非常可靠，具有可比性和重复性。本文通过半定量rt-pcr技术，研究了家蝇抗真菌肽-1（musca domestica antifungal peptide-1,maf-1）在家蝇不同生长发育阶段（卵、1龄幼虫、2龄幼虫、3龄幼虫、蛹、成虫以及雌雄)和幼虫不同的部位(脂肪体、肠道、体壁、唾液腺)的表达情况，结果显示maf-1基因在所选的不同时期各部位都有所表达。其中幼虫期间的表达量比较高，而不同部位中，唾液腺、脂肪体表达量较高。而且，在整个家蝇的生长发育阶段，maf-1基因的表达量是呈现下降的趋势的。这一系列结果其原因可能是：抗菌肽基因在家蝇卵期缺乏转录活性其表达的可能为母源性转录产物。所检测到的可能是母体的遗留，故呈低水平表达整个家蝇幼虫期抗菌肽基因表达呈下降趋势，在1龄幼虫期达到最大转录活性可能是随着幼虫的不断发育其免疫防御机制逐渐完善同时也表明抗菌肽在家蝇幼虫发育中具有重要的作用；完全变态的昆虫在蛹期对外界具有较强抵抗力。而家蝇蛹期抗菌肽基因表达呈低水平。蛹期的发育前期龄幼虫期与蛹期的发育后期成虫期表达均明显趋高，说明家蝇蛹期抗菌肽转录途径较复杂同时也说明在家蝇免疫体系中抗菌肽可能不是惟一的防御免疫分子，同时也表明抗菌肽在家蝇幼虫发育中具有重要的作用;家蝇成虫期抗菌肽表达量降低。大概因为此期家蝇免疫系统发育成熟所致，另一方面也是家蝇成虫期活动范围增大，受外界刺激的几率大大增加机体自身免疫系统适应进化的结果。这也是昆虫适应防御微生物入侵的主要方式。唾液腺、脂肪体的高表达量可能与抗菌肽合成分泌有关。本文采用实时定量pcr 的方法, 研究抗菌肽maf-1为基因在家蝇不同发育期及家蝇幼虫不同部位的表达情况。所呈现的研究数据进一步肯定了抗菌肽在家蝇的免疫防御体系和尤其是幼虫期间的生长发育中发挥着重要作用。参考文献1. graczykt .k .，knightr .，gilmanr .h .，granfieldm .r .mic ro bes i nfec.,2001,3:231一235.2. sukontason k.，bunchoom .，khantawab .，sukantason k ，pia ng jai s .，choochotew .j .v ectore col.，2000,25:114-11 7 .3. moerirac .k .，capurrom .de l .，calvoe .，silvaj r.p .i ，james a .a .et a l.insectb 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