天冬氨酸族氨基酸发酵机制.ppt

第八章 天冬氨酸族氨基酸发酵机制,第八章 天冬氨酸族氨基酸发酵机制,重点：天冬氨酸族氨基酸生物合成途径及代谢调节机制；天冬氨酸族氨基酸生物合成的代谢调节机制；酵母和霉菌的赖氨酸生物合成途径和调节机制；赖氨酸生产菌的育种途径； 难点：天冬氨酸族氨基酸生物合成的代谢调节机制；,氨基酸本身的合成在不同生物体中，有较大的差异，然而许多氨基酸的合成途径在不同生物体中也有共同之处。 按照起始物可将氨基酸的合成分成几个家族： 谷氨酸族（-酮戊二酸族） 包括：谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、赖氨酸和脯氨酸； 丙酮酸族 包括：丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸；,天冬氨酸族（草酰乙酸族） 包括：天冬氨酸、天冬酰胺、苏氨酸和异亮氨酸； 磷酸甘油酸族 包括：甘氨酸、丝氨酸和半胱氨酸； 芳香族 包括：苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸； 另外，组氨酸的合成为单独的一条途径。,第一节 生物合成途径（天冬氨酸族）及代谢调控机制 一、生物合成途径 天冬氨酸族氨基酸合成可以以草酰乙酸或天冬氨酸为原料，合成苏氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸和赖氨酸。,葡萄糖 丙酮酸 草酰乙酸 天冬氨酸 天冬氨酸-半醛 赖氨酸 高丝氨酸 蛋氨酸 苏氨酸 异亮氨酸,EMP,CO2 固定、氧化,氨基化反应,天冬氨酸激酶,天冬氨酸-半醛脱氢酶,二氢吡啶二羧酸（DDP）合成酶,高丝氨酸脱氢酶,琥珀酰高丝氨酸合成酶,高丝氨酸激酶,苏氨酸脱氨酶,二、天冬氨酸族生物合成的代谢调节机制 在细菌中，虽然天冬氨酸族氨基酸生物合成途径是相同的，但是其代谢调节机制是多种多样的。 1.大肠杆菌K12 天冬氨酸激酶（ AK） AK:受苏氨酸、异亮氨酸的多价抑制和阻遏 天冬氨酸激酶 AK：受蛋氨酸专一性抑制和阻遏 AK：受赖氨酸专一性抑制和阻遏,天冬氨酸-半醛脱氢酶 专一性的受赖氨酸不完全的抑制 二氢吡啶二羧酸（DDP）合成酶（赖氨酸分支的第一个酶） DDP合成酶受赖氨酸反馈抑制。 二氨基庚二酸（DAP）脱羧酶受赖氨酸阻遏,高丝氨酸脱氢酶（HD）（通向苏氨酸、蛋氨酸分支的第一个酶） HD HD：受苏氨酸反馈抑制 HD：受蛋氨酸阻遏 苏氨酸脱氨酶（异亮氨酸合成途径的酶） 受异亮氨酸的反馈抑制和阻遏,2.黄色短杆菌 其赖氨酸生物合成调节机制比大肠杆菌简单，其天冬氨酸激酶只有一种，该酶具有两个变构部位，可以与终产物结合，当只有一种终产物（赖氨酸或苏氨酸）与酶结合，酶活性不受影响。当两种终产物（赖氨酸和苏氨酸）同时过量时，与酶的两个变构部位结合，该酶活性受到抑制，这种终产物的反馈抑制称为协同反馈抑制。P74图6-3,3.乳糖发酵短杆菌赖氨酸合成调节 P75，图6-5 1）存在代谢优先向苏氨酸和蛋氨酸方向进行。 2）与黄色短杆菌区别： AK受赖氨酸+苏氨酸的反馈抑制 存在代谢互锁，DDP合成酶的合成受亮氨酸阻遏。DDP还原酶受半胱氨酸和丙氨酸抑制。,三、酵母和霉菌的赖氨酸生物合成途径和调节机制 所谓同型TCA循环途径进行，但生物合成酶与TCA循环酶完全两样。,第二节 赖氨酸生产菌的育种途径,出发菌株的选择：要求代谢比较简单的细菌（如黄色短杆菌、谷氨酸棒杆菌、乳酸发酵短杆菌等） 1.优先合成的转换：渗漏缺陷型的选育。 降低高丝氨酸脱氢酶活性，使代谢流转向优先合成赖氨酸。 高丝氨酸脱氢酶渗漏缺陷型。,2.切断支路代谢：营养缺陷型的选育。 黄色短杆菌、谷氨酸棒杆菌，对天冬氨酸激酶的反馈抑制是赖氨酸+苏氨酸的协同作用，通过诱变使高丝氨酸脱氢酶缺失，切断通向苏氨酸、蛋氨酸的代谢流，控制高丝氨酸（或苏氨酸+蛋氨酸）量，降低苏氨酸浓度，解除协同反馈作用，过量积累赖氨酸。,3.抗结构类似物突变株的选育（代谢调节突变）。 优点：突变株遗传性地解除了终产物对自身合成途径的酶的调节控制，不受培养基中所要求物质浓度的影响，生产较稳定。 通过诱变使天冬氨酸激酶编码的结构基因发生突变，对赖氨酸及结构类似物不敏感，即使有过量苏氨酸存在，该酶也不与赖氨酸或结构类似物结合，但酶活性中心不变。,4.解除代谢互锁 选育亮氨酸缺陷型菌株，或者以抗AEC的赖氨酸的生产菌为出发菌株，经诱变得到抗AEC兼抗亮氨酸缺陷型菌株。 选育抗亮氨酸结构类似物的突变株，从遗传上解除亮氨酸对DDP合成酶的阻遏。 选育对苯醌或喹啉衍生物敏感菌株，这是一种寻找亮氨酸渗漏缺陷型菌株的有效方法。,5.增加前体物的生物合成和阻塞产物的生成： 方法： 选育丙氨酸缺陷型； 选育抗天冬氨酸结构类似物突变株； 选育适宜的CO2固定酶/TCA循环酶活性比突变株； 1.通过TCA循环 葡萄糖丙酮酸草酰乙酸天冬氨酸 赖氨酸 2.通过磷酸烯醇式丙酮酸羧化反应 葡萄糖磷酸烯醇式丙酮酸草酰乙酸天冬氨酸 丙酮酸 赖氨酸,6.改变细胞膜的透过性 7.选育温度敏感突变株 天冬氨酸系分枝代谢途径中，末端产物种类多，调节机制复杂，为高效率生产赖氨酸，可以采取顺次解除各种调节机制的诱变育种，获得多重标记的突变株。,8.应用细胞工程和遗传工程育种 9.防止高产菌株回复突变 选育遗传性稳定的菌株 定向赋加生产菌多个遗传标记 菌种培养和保藏时，培养基要丰富，尤其有足够的要求营养物 培养时添加抗生素，抑制恢复突变株的生长，达到分纯的目的。,第三节 苏氨酸、蛋氨酸、高丝氨酸和天冬氨酸的育种途径,一、苏氨酸的育种途径,苏氨酸高产菌株应具备的生化特征,DDP合成酶活力极弱或欠缺 琥珀酰高丝氨酸合成酶酶活力极弱或欠缺 苏氨酸脱氨酶酶活力极弱或欠缺 CO2固定能力强 天冬氨酸合成能力强 天冬氨酸激酶活力强，对苏氨酸和赖氨酸的协同反馈抑制不敏感 高丝氨酸脱氢酶活力强，不受苏氨酸反馈调节。,二、高丝氨酸菌种的选育途径,DDP合成酶活力极弱或欠缺 琥珀酰高丝氨酸合成酶酶活力极弱或欠缺 高丝氨酸激酶欠缺 CO2固定能力强 天冬氨酸合成能力强 天冬氨酸激酶活力强，对苏氨酸和赖氨酸的协同反馈抑制不敏感 高丝氨酸脱氢酶活力强，不受苏氨酸和蛋氨酸反馈调节。,高产高丝氨酸菌株应具备的生化特征,三、蛋氨酸育种途径,高产蛋氨酸应具备的生化特性,DDP合成酶活力极弱或欠缺 S-腺苷蛋氨酸酶活力极弱或欠缺 高丝氨酸激酶欠缺 CO2固定能力强 天冬氨酸合成能力强 天冬氨酸激酶活力强，对苏氨酸和赖氨酸的协同反馈抑制不敏感 高丝氨酸脱氢酶活力强，苏氨酸和异亮氨酸