实验四鞭毛染色法及活.ppt

模块二 实验四 鞭毛染色法及活细菌的运动性观察,一 实验目的,学习细菌的鞭毛染色法及细菌运动性观察方法,二 实验原理,细菌的鞭毛极细，直径一般为0.010.02m，只有用电子显微镜才能观察到。但是，如采用特殊的染色法，则在普通光学显微镜下也能看到它。鞭毛染色的方法很多，但其基本原理相同，即在染色前先用媒染剂处理、让它沉积在鞭毛上，使鞭毛直径加粗，然后再进行染色。常用的媒染剂由丹宁酸和氯化高铁或钾明矾等配制而成。,细菌是否具有鞭毛是细菌分类鉴定的重要特征之一。采用鞭毛染色法虽能观察到鞭毛的形态、着生位置和数目，但此法既费时又麻烦。如果只需查清供试菌是否有鞭毛，可采用悬滴法或水封片法（即压滴法）直接在光学显微镜下检查活细菌是否具有运动能力，以此来判断细菌是否有鞭毛。此法较快速、简便。 悬滴法就是将菌液滴加在洁净的盖玻片中央，在其周边涂上凡士林，然后将它倒盖在有凹槽的载玻片中央，即可放置在普通光学显微镜下观察。水封片法是将菌液滴在普通的载玻片上，然后盖上盖玻片，置显微镜下观察。 大多数球菌不生鞭毛，杆菌中有的有鞭毛有的无鞭毛，弧菌和螺菌几乎都有鞭毛。有鞭毛的细菌在幼龄时具有较强的运动性，衰老的细胞鞭毛易脱落，故观察时宜选用幼龄菌体。,鞭 毛,三 实验器材,1 菌种：培养12-16小时的变形杆菌或大肠杆菌斜面。 2 染色液与试剂：鞭毛染色液A液与B液，蒸馏水，香柏油，显微镜擦拭液。 3 器材：载玻片、擦镜纸、吸水纸、记号笔、试管夹、镊子、接种环，显微镜。,运动性观察,1 菌种：培养 12-16h的变形杆菌和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）。 2 试剂：香柏油、显微镜擦拭液、凡士林等。 3 器材：凹玻片、载玻片、盖玻片、镊子、接种环、滴管、擦镜纸、显微镜。,四 实验方法,1清洗玻片：选择光滑无裂痕的玻片，最好选用新的。为了避免玻片相互重叠。应将玻片插在专用金属架上，然后将玻片置洗衣粉过滤液中（洗衣粉煮沸后用滤纸过滤，以除去粗颗粒）煮沸20min。取出稍冷后用自来水冲洗、晾干，再放入浓洗液中浸泡56天，使用前取出玻片，用自来水冲去残酸，再用蒸馏水洗。将水沥干后，放入95乙醇中脱水。 2 菌种的准备及制片：菌龄较老的细菌容易脱落鞭毛，所以在染色前应将待染细菌在新配制的牛肉膏蛋白胨培养基斜面上（培养基表面湿润，斜面基部含有冷凝水）连续移接35代，以增强细菌的运动力。最后一代菌种放恒温箱中培养12-16h。然后，吸取少量蒸馏水滴在洁净玻片的一端，无菌操作在斜面上取菌少许，在蒸馏水中轻沾，立即将玻片倾斜，使菌液缓慢地流向另一端。用吸水纸吸去多余的菌液。涂片放空气中自然干燥。,3 染色 1）滴加 A液，染46min。 2）用蒸馏水充分洗净A液。 3）用B液冲去残水，再加B液于玻片上，在酒精灯火焰上加热至冒气，约维持0.5lmin (加热时应随时补充蒸发掉的染料，不可使玻片出现干涸)。 4) 用蒸馏水洗，自然干燥。 4 镜检：先低倍，再高倍，最后用油镜检查。 结果：菌体呈深褐色，鞭毛呈浅褐色。,运动性观察,1制备菌液。在幼龄菌斜面上，滴加34mL无菌水，制成轻度混浊的菌悬液。 2 涂凡士林。取洁净无油的盖玻片一块，在其四周涂少量的凡士林。 3 滴加菌液。加1滴菌液于盖玻片的中央，并用记号笔在菌液的边缘做记号、以便在显微镜观察时，易于寻找菌液的位置。 4 盖凹玻片：将凹玻片的凹槽对准盖玻片中央的菌液，并轻轻地盖在盖玻片上使两者粘在一起，然后翻转凹玻片，使菌液正好悬在凹槽的中央，再用铅笔或火柴棒轻压盖玻片，使玻片四周边缘闭合，以防菌液干燥。 若制水浸片，在载玻片上滴加一滴菌液，盖上盖玻片后即可置显微镜下观察。 5 镜检：先用低倍镜找到标记，再稍微移动凹玻片即可找到菌滴的边缘，然后将菌液移到视野中央换高倍镜观察。由于菌体是透明的镜检时可适当缩小光圈或降低聚光器以增大反差，便于观察。镜检时要仔细辨别是细菌的运动还是分子运动即布朗运动），前者在视野下可见细菌自一处游动至它处，而后者仅在原处左右摆动。细菌的运动速度依菌种不同而异，应仔细观察。,四 实验报告,绘出细菌鞭毛的形态及着生位置 绘出所看到的细菌的形态图，并注明表示其运动性。,五 注意事顶,1 检查细菌运动的载玻片和盖玻片都要洁净无油。否则将影响细菌的运动。