食管鳞状细胞癌中PINCH蛋白的表达及意义.doc

食管鳞状细胞癌中PINCH蛋白的表达及意义 作者：朱振龙，杨艳红，张 钰，王政民，崔冬生，张金廷王铭维，孙晓峰，Ann Rearden【摘要】 目的 探讨PINCH蛋白在食管鳞状细胞癌中的表达及其临床病理意义。方法 采用免疫组化ABC法检测10例正常食管粘膜组织和64例食管鳞状细胞癌组织中PINCH蛋白的表达，并分析其临床意义。结果 PINCH蛋白在鳞癌组织相关间质中呈异质性表达，其阳性率为56.25%（36/64），明显高于正常食管粘膜组织（0/10）（P0.05），差异有显著性，而且在肿瘤浸润边缘阳性更明显。PINCH蛋白表达与患者性别、年龄及鳞癌组织学分级无相关性；淋巴结转移组的鳞癌组织中PINCH蛋白阳性表达率为90%（18/20），未转移组鳞癌病例中阳性率为40.91%（18/44），二者相比差异有显著性（P0.05）。结论 PINCH蛋白在食管鳞癌中异常表达，可能利于肿瘤的浸润和转移。提示PINCH蛋白可作一个肿瘤相关间质的标志物来预测肿瘤浸润和淋巴结转移的能力。在肿瘤的预后判断上有重要意义，并可能成为与肿瘤间质相关的抗肿瘤治疗的一个新靶点。 【关键词】 PINCH蛋白；鳞癌；食管；免疫组织化学 Expression and Significance of PINCH Protein in Esophagus Squamous Cell Carcinoma Key words：PINCH protein; Squamous cell carcinoma; Esophagus; Immunohistochemistry 在信号传导中，接头蛋白通过蛋白相互反应结构域而发挥作用，其中一个重要的结构域是一种双锌指结构，该结构是LIM（Lin11, Isl1 and Mec3 Proteins）家族的特征1，2。PINCH（Particulary interesting new cysteinehisticline rich protein, PINCH ）蛋白是新近发现的LIM家族的一个成员，它在整合素和生长因子信号的传导中起着十分重要的接头联结作用，与肿瘤的发生、发展有一定的关系3。Jessica 等4应用免疫印迹法和免疫组化法对PINCH蛋白在肺癌、前列腺癌、乳腺癌、大肠癌及皮肤癌中的表达进行了观察研究，发现其与肿瘤的侵袭和转移有关。笔者采用免疫组化ABC法对食管鳞癌组织中PINCH的表达进行检测，并初步探讨其临床病理意义。 1材料与方法 1.1材料收集河北医科大学第一医院病理科2000年4月2004年5月间各项临床资料较完整的食管鳞癌手术切除病例64例，其中伴有淋巴结转移者20例。以上标本均经病理证实为食管鳞状细胞癌。同时随机选取手术切除标本断端的正常食管粘膜组织10例作为对照。 1.2临床资料 64例食管鳞癌患者，年龄4178岁，平均59.5岁；男50例，女14例。依据WHO鳞癌组织学诊断标准进行组织学分级，高、中、低分化各20、39、5例。 1.3试剂与方法 石蜡包埋组织作5m连续切片，常规HE染色和免疫组织化学ABC法染色。所用兔抗人PINCH蛋白多克隆抗体由Prof. Ann Rearden 惠赠（Department of Pathology, University of California,U.S.A.），二抗、三抗购自福州迈新生物技术开发有限公司。免疫组织化学主要染色过程：切片脱蜡水化；3%H2O2甲醇灭活内源性过氧化物酶；依次滴加一抗、二抗和三抗； DAB显色；苏木精复染；常规脱水，透明、封片。用已知阳性的乳腺癌组织作为阳性对照。 1.4染色结果判断 以组织间质中纤维母细胞样细胞的胞膜及胞质出现棕黄色颗粒为阳性细胞。每例随机选出10个不重复、不重叠的高倍镜视野（1040），计数阳性细胞数及所有细胞数，计算阳性细胞率=阳性细胞数/细胞数100%。根据阳性细胞率进行分级，PINCH（），阳性细胞率20%；PINCH（+），阳性细胞率20%50%；PINCH（+），阳性细胞率50%。 1.5统计学分析 用2 检验进行统计学处理，P0.05为差异有显著意义。 2结果 2.1PINCH蛋白在正常食管粘膜组织中的表达 在10例正常食管粘膜组织中，除1例在上皮层下1/3有灶性阳性表达外，见图1，其余所有被检组织，无论是上皮、还是间质，均无阳性表达。且这1例的阳性表达部位主要在基底层细胞连接处和棘细胞层下1/3的细胞间连接处特别在棘细胞层细胞连接处表达明显，见图2。 2.2PINCH蛋白在食管鳞癌组织中的表达 在64例被检癌组织中，有36例PINCH蛋白在肿瘤间质中阳性表达，见图3。此外，尚发现有少量癌细胞的胞质及胞膜上有PINCH阳性表达，强度较弱，见图4。高倍镜下，阳性表达部位在癌细胞间的细胞间桥上，见图5。在36例间质阳性表达病例中，发现PINCH蛋白的表达呈明显异质性，同一切片不同区域阳性细胞多少不一，分布不均，阳性反应染色深浅不一；特别是其中的13例肿瘤中，在肿瘤浸润的边缘间质组织中PINCH蛋白表达更显著，见图6。 统计学分析表明PINCH蛋白在食管鳞癌间质中的阳性表达率为56.25%（36/64）明显高于正常食管粘膜组织0（0/10），二者差异有显著性（P0.05）。 2.3PINCH蛋白表达与患者临床病理特征的关系研究结果显示，PINCH蛋白在食管鳞状细胞癌中的表达与患者性别、年龄及肿瘤的组织学分级无明显相关性（P0.05）；但在淋巴结转移组其阳性表达率为90.00%，明显高于淋巴结无转移组40.91%，二者相比差异有显著性（P0.05），见表1。表1PINCH蛋白表达与食管鳞癌患者 3讨论 PINCH蛋白是一种含有5个LIM结构域的配体蛋白（adaptor protein）蛋白，免疫印迹结果表明其单体相对分子质量为3.71044。它与整合素一起参与了细胞的粘附作用，调节细胞的形态改变和迁移。然而PINCH并不是直接与整合素相结合，而是借其LIM结构域的第一个双锌指结构与ILK（integrinlinked kinase, ILK）N端的ANK序列相结合，而ILK的C端则与整合素的胞质域相结合，这样它们三者共同形成了信号复合物来参与整合素的信号传导通路5。 新近研究发现，PINCH蛋白还参与生长因子信号传导系统，其借助它的LIM结构域的第4个双锌指结构与Nck2相结合。Nck2是一种结合蛋白，它含有SH2/SH3结构域，其中SH3结构域能与胰岛素效应底物1（IRS1）相结合，另外它的C端SH2结构域能识别配体激活的EGF和PDGF 受体而参与生长因子信号传导系统6。由此可看出，PINCH通过它的第1和第4个LIM结构域而把ILK和Nck2连接起来，参与了整合素和生长因子的信号传导系统，在整合素和生长因子信号传导通路中PINCH蛋白处于一个关键的“十字”交汇点处，相当于一个“三通管”的作用。所以在肿瘤的发生、发展中可能起着十分重要的作用。 Jessica等4应用免疫印迹法和免疫组化法对33例乳腺癌（21例导管癌，6例小叶癌，4例导管原位癌和2例小叶原位癌）、22例前列腺癌、5例大肠癌、6例肺癌（其中3例腺癌，3例鳞癌）以及8例皮肤癌（4例基底细胞癌和4例鳞癌）共74例肿瘤和2例正常乳腺组织与1例正常肌肉组织进行了PINCH蛋白染色观察，结果发现除皮肤外，在所检测的组织中，正常的上皮和癌细胞PINCH染色很弱且呈微灶性；在正常组织的间质中PINCH着色很弱，几乎阴性；但在所有被检测的肿瘤相关间质中则强阳性表达，阳性表达率100%，尤其在肿瘤浸润的边缘强度更甚，其中以乳腺癌标本为著。 本组实验中，10例正常食管粘膜组织中仅有1例在上皮层下1/3处有弱阳性表达，而间质组织全为阴性，这与Jessica等4的实验结果有一致性。但在所检测的64例肿瘤相关间质组织中，PINCH阳性表达率仅为56.25%（36/64），这与Jessica等4所报道的100%有较大出入，其原因可能是在食管癌中原本就这样，或本室的实验条件与国外相比较差，或观察者的主观因素所为等等，具体原因尚待进一步分析探讨。 另外，本组实验结果表明，虽然仅有13例在肿瘤浸润的边缘相关间质中PINCH表达更强烈，但从某种意义上来讲，多少也能说明PINCH蛋白可能与肿瘤的浸润有关。 本实验结果还显示PINCH蛋白在食管鳞癌相关间质中的表达与患者性别、年龄及肿瘤的组织学分级无明显相关性（P0.05）。但与淋巴结转移呈正相关。在有淋巴结转移的鳞癌中阳性表达率90.00%（18/20）明显高于淋巴结无转移组的阳性表达率40.19%（18/44），二者相比差异有显著性（P0.05）。这一结果提示PINCH蛋白在肿瘤相关间质中的表达可能与肿瘤的转移有关，设想检测PINCH蛋白表达水平，可能为预测肿瘤的浸润、转移提供了一个新的生物学指标。 为什么PINCH蛋白会在肿瘤相关间质中表达增加，而且在浸润边缘尤为明显呢？这可能是由于PINCH与ILK结合参与细胞基础功能的调控，如细胞与细胞外基质的相互作用等。而纤维连接素是细胞外基质的主要成分之一。它由ILK来调节7，在这个调节过程中，它需要PINCH蛋白参加，所以在肿瘤相关间质中PINCH蛋白的表达增加可能与此处增加的纤维连接素聚集有关。在肿瘤的发展中，由肿瘤相关间质细胞移动所形成的纤维连接素和沉积的其他细胞外基质成分可能导致边缘部位为肿瘤细胞的移动提供了一个合适的界面平台8，9。 从本实验结果及文献报道4来看，PINCH蛋白主要表达在肿瘤相关间质的纤维母细胞样细胞的胞质及胞膜上，这种细胞究竟是为肿瘤的浸润转移提供了一个“脚手架作用”，还是一个“先锋开路铺桥作用”，还有待进一步研究。我们推测，肿瘤的浸润转移肯定与这种PINCH蛋白表达的纤维母细胞样细胞有关。寻找针对这种细胞的有效药物，以阻断肿瘤的浸润和转移，从而为抗肿瘤治疗提供一个新的思路和治疗靶点。【参考文献】 1 Jurata LW, Gill GN. Structure and function of LIM domainsJCurr Top Microbiol Immunol， 1998， 228(4): 75113.2Bach I. The LIM domain: regulation by associationJ. Mech Dev，000,91(3): 5173Tu Y, Li F, Goicoechea S, et al. The LIMonly protein PINCH directly interacts with intergrinlinked kinase and is recruited to integrinrich sites in spreading cells J. Mol cell Biol, 1999, 19(3): 24252434.4Jessica WR, Anna D, Ghazwan M, et al.The signaling adapter protein PINCH is upregulated in the stroma of common cancer,notably at invasive edgesJ.Cancer, 2002,95(6):13871395.5Velyvis A, Yang YW, Wu CY,et al. Solution structure of the focal adhesion adaptor PINCH LIM1 domain and characterization of its interaction with the integrinlinked kinase ankyrin repeat domainJ. J Bid Chem, 2001, 276(6): 49324939.6Tu Y, Li F, Wu C. Nck2, a novel Src homology2/3comtaining adaptor protein that interacts with the LIMonly protein PINCH and components of growth factor receptor kinasesignaling pathwaysJ. Mol Biol cell, 1998, 9(4): 33673382.7Wu C, Keightley SY, LeungHagesteijn C, et al.Integrinlinked protein kinase regulate,fibronectin matrix assembly,ECadherin expression , and tumorigernicity J.J Biol Chem ,1998, 273(5): 528536.8Armstrong PB, Armstnong MT. Intercellular invasion and the organizational stability of tissues: a role fo