《化学检测》PPT课件.ppt

第六章 化学检测,根据物质的化学性质而对物质进行定量、定性测定。 应用最早、最广泛的检测技术 简便、快速、操作容易,一 糖类的化学检测,糖类包括多糖、双糖、单糖 单糖和某些双糖具有游离羰基还原糖 多糖和蔗糖等无还原性非还原糖 糖类化学检测主要是利用游离羰基的还原性质，与试剂（氧化剂）进行氧化还原反应而进行测定的。 非还原糖必须转化为还原糖再进行测定,最常用的试剂：斐林（Fehling）试剂 基本组成：A：CuSO4溶液 B: NaOH和酒石酸钾钠溶液 使用时A、B等体积混合(生成酒石酸钾钠铜） 酒石酸钾钠铜是氧化剂，可与还原糖的游离羰基发生氧化还原反应，而进行糖的测定。,定糖常用方法,1 兰爱农（Lane-Eynon）法 次甲基蓝（亚甲基蓝、四甲基蓝）法、置换法、直接滴定法 反应终点用次甲基蓝指示剂显示（还原糖滴定斐林试剂，由于次甲基蓝氧化能力比二价铜弱，待二价铜全部还原后，过量1D还原糖使次甲基蓝还原，蓝色消失） 多糖或其他非还原糖需转化为还原糖后再滴定 如淀粉，可用酸解或酶解,操作要点,（1 ）斐林试剂的标定 （a）标定预备试验 A、B各5mL10mL水（250mL三角瓶中）摇匀，加热至沸腾，2D1次甲基蓝溶液，用标准葡萄糖液滴定至蓝色消失，耗标准葡萄糖液（0.1或0.2）V1mL。 （b）标定 A、B各5mL10mL水（250mL三角瓶中）摇匀，从滴定管中预先加入（V1-1)mL标准葡萄糖液，摇匀后加热加热至沸腾，2D1次甲基蓝溶液，用标准葡萄糖液滴定至蓝色消失（滴定在1min内完成），记录消耗标准葡萄糖液的总毫升数V0,(2) 定糖 （a）定糖预备试验 A、B各5mL10mL样品糖液（250mL三角瓶中）摇匀，加热至沸腾，2D1次甲基蓝溶液，用标准葡萄糖液滴定至蓝色消失，耗标准葡萄糖液（0.1或0.2）V2mL。 （b）定糖 A、B各5mL10mL样品糖液（250mL三角瓶中）摇匀，补加（V0-V2）mL水，并从滴定管中预先加入（V2-1)mL标准葡萄糖液，摇匀后加热加热至沸腾，2D1次甲基蓝溶液，用标准葡萄糖液滴定至蓝色消失（滴定在1min内完成），记录消耗标准葡萄糖液的总毫升数V,(3) 计算 还原糖含量（以葡萄糖计） （V0-V) c (1/10 )n 注意： （a）AB分开储存，防止Cu+变化，临用混合 （b）单标移液管吸液准确，外壁也需擦干净 （c）体积需控制在一定范围内，对pH有影响 （d）煮沸时间要一致 （e）注意指示剂加入时间和加入量一致 （f）滴定速度一致（后滴定0.51mL，1min内完成） （g）产物Cu2O不稳定，次甲基蓝变色也不稳定，暴露于空气或沸腾颜色变化，滴定过程不能摇动，不可中途中止加热,斐林试剂快速法： 在斐林试剂中加入亚铁氰化钾（黄血盐）反应终点为蓝色消失，淡黄色出现。反应终点比兰爱农法更为明显。,2 碘量法,I2 NaIO(氧化剂），其氧化能力较弱，仅适用于醛糖的测定，与酮糖不起反应 操作要点： （1）标准硫代硫酸钠溶液配制，0.05 mol/L，沸腾后冷却水配制，存放在棕色瓶中，一周后用标准重铬酸钾标定。 （2）标准碘液配制，0.1mol/L （3）空白滴定：空白液，用硫代硫酸钠滴定试剂中全部碘,碘量瓶中，10mL0.1mol/L碘液15mL0.1 mol/LNaOH5mL空白液，摇匀后暗反应15min1mL1mol/L硫酸溶液，用0.05mol/L硫代硫酸钠滴定至浅黄色，加0.2mL0.5淀粉液作指示剂，滴定至蓝色消失，记录V0 (4)样品滴定：以5mL样品液代替空白液， V1 (5) 计算： 醛糖含量 （V0 V1）C M n 注意：暗反应后需酸化再滴定，滴定时开始轻摇（碘挥发），后再摇（淀粉吸附碘） 配合次甲基蓝法测定某些糖含量（如果糖）,3 铜试剂法,将还原糖与二价铜离子反应生成的Cu2O用碘氧化，再用硫代硫酸钠滴定反应液中剩余的碘而测定样品还原糖的含量。 （1）铜试剂的配制 主要提供二价铜离子及碘 （2）标准曲线的制作,（a)标准葡萄糖液的配制 0.1%或0.05（根据所用铜离子试剂定） （b)三角瓶编号 1 2 3 4 5 6 葡萄糖标准液（mL ) 0 1 2 3 4 5 蒸馏水（mL ) 5 4 3 2 1 0 铜试剂（mL ) 5 5 5 5 5 5 沸水浴10min，冷却至室温 （c)各加入0.5mol/L硫酸5mL，振荡，待红色Cu2O完全溶解后，用硫代硫酸钠滴定至终点，记录耗用量V (d) 绘标准曲线 葡萄糖含量（mg）为纵坐标，（V0-V)为横坐标,二 蛋白质和氨基酸的化学检测,蛋白质含氮量几乎恒定，平均16 测出N含量6.25，即为蛋白质量 含氮量 每gN相当P 肉、蛋、豆 16 6.25 面粉 17.6 5.70 奶品 15.7 6.38 花生 18.2 5.50 鲑精蛋白 31.5 3.17,蛋白质常用检测方法,1 定氮法（经典的，仲裁的） 常用凯氏定氮法或微量凯氏定氮法 （1）原理 消化、蒸馏、吸收、滴定计算 （2）操作要点 (a) 消化：凯氏定氮瓶，样品K2SO4-CuSO4、浓H2SO4, 通风厨内进行，消化液全部移入100mL容量瓶定容。,(b)蒸馏：防止漏气 (c)吸收：5mL2H3BO3甲基红溴甲酚绿几滴或一定量标准酸溶液（如25mL 0.05mol/L H2SO4) (d)滴定计算： H3BO3吸收：0.01mol/LHCl滴定至绿色 淡紫红色 样品中的总氮量（mg)=（A-B)C14n 标准硫酸接收：0.1mol/L标准NaOH滴定，甲基红黄色终点 样品中总氮量=（C1V1-C2V2) 14n 粗蛋白含量样品的总氮量6.25,2 双缩脲试剂法测定蛋白质,缩脲CuSO4、NaOH 紫红色化合物 A C缩脲 蛋白质含有两个以上脲键，有双缩脲反应 蛋白质（多肽） CuSO4 （ NaOH） 铜钠双缩脲络合物 A Cp，与蛋白质的分子量和氨基酸组成无关 Tris缓冲液干扰P的测定，测定范围110 mg/mL,操作： （1）双缩脲试剂的配制 CuSO4、酒石酸钾钠、NaOH、0.1%KI (2) 标准曲线的制作 1标准酪蛋白(mL) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水(mL) 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 双缩脲试剂 (mL) 4 4 4 4 4 4 室温反应30min测A540 (3)样品测定 1mL4mL双缩脲试剂 ，30min，测A540,3 福林酚试剂法测定蛋白质含量,双缩脲法的发展，灵敏100倍，需时较长，对双缩脲反应有干扰的物质对其影响更大，酚类和柠檬酸也有干扰。 碱性铜试剂双缩脲反应 稀释的苯酚试剂与酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸反应呈蓝色 两种呈色反应可叠加,操作： （1）福林酚试剂的配制 甲液：碱性铜试剂（A、NaOH、NaCO3, B、CuSO4和酒石酸钾钠) 乙液：稀释的苯酚试剂 （2）标准蛋白溶液配制 结晶牛血清蛋白溶于0.9NaCl或用酪蛋白（凯氏定氮法测定含量） （3）标准曲线制作 （4）样品测定 1mL样品（含P15500 g）5mL甲液，室温10min，乙液0.5mL，混匀，室温30min，测A500750,蛋白质的免疫化学检测,概念：免疫化学检测、抗体、抗原、凝集反应、沉淀反应 检测方法： （1）凝集反应 效价测定，细菌、病毒分类 （2）沉淀反应 沉淀反应、界面（环状）试验、免疫扩散、免疫电泳、免疫亲和层析、免疫荧光检测等,氨基酸含量测定方法,1 茚三酮显色法 微酸性条件下，氨基酸茚三酮反应生成紫色化合物，亚氨基酸（脯氨酸和羟脯氨酸）茚三酮反应生成黄色化合物 取1mL样品溶液（含氨基酸0.150ug)加1mL缓冲液（pH5.06.7），再加1mL茚三酮显色液，100 水浴15min，自来水冷却后，加入3mL60乙醇溶液，测定OD570，脯氨酸或羟脯氨酸测OD440,2 甲醛滴定法测定氨基酸,氨基酸是两性电解质，不能用一般酸碱指示剂通过氢氧化钠来测定。 加进甲醛生成羟甲基衍生物，可以用碱滴定。 注意：需用过量中性甲醛。,三 核酸的化学检测,根据核酸所含的磷及戊糖的化学性质，可用定磷法、二苯胺法和地衣酚法等进行检测。 1 定磷法测定核酸含量 （1）核酸的消化 （2）磷的测定 定磷试剂，45 水浴25min，冷却至室温测OD650 无机磷标准液作标准曲线 （3）核酸含量的计算 一般DNA含磷9.5,RNA含磷9.2， RNA量（总磷量无机磷量）10.9 DNA量 （总磷量无机磷量）10.5,2 二苯胺法测定DNA含量,DNA中的2-脱氧核糖在酸性环境中与二苯胺试剂一起加热产生蓝色反应，在595nm处有最大吸收峰。在40400 g范围内，OD595与DNA浓度成正比。少量乙醛可提高反应灵敏度。 （1）二苯胺试剂的配制 （2）标准曲线制作 （3）样品DNA含量测定,3 地衣酚法测定RNA含量,核糖核酸在浓盐酸和三氯化铁的存在下，与3，5二羟甲苯（地衣酚）反应，生成绿色物质。一定浓度范围内，OD670与RNA浓度成正比。所有戊糖均可进行此反应，注意干扰（如DNA）。 操作： 地衣酚试剂配制；标准曲线制作；样品RNA测定,思