植物组织培养的培养基.doc

植物组织培养培养基的主要成分1.无机营养物：无机营养物主要由大量元素和微量元素两部分组成，大量元素主要包括氮、磷、钾、钙、镁和硫六种，氮源通常有硝态氮或铵态氮，但在培养基中用硝态氮的较多，也有将硝态氮和铵态氮混合使用的。磷和硫则常用磷酸盐和硫酸盐来提供。钾是培养基中主要的阳离子，在近代的培养基中，其数量有逐渐提高的趋势。而钙、钠、镁的需要则较少。培养基所需的钠和氯化物，由钙盐、磷酸盐或微量营养物提供。微量元素包括碘、锰、锌、钼、铜、钴和铁, 这些元素有的对生命活动的某个过程十分有用，有的对蛋白质或酶的生物活性十分重要，有的是参与某些生物过程的调节。培养基中的铁离子，大多以螯合铁的形式存在，即FeSO4与Na2EDTA（螯合剂）的混合。2.碳源：培养的植物组织或细胞，它们的光合作用较弱。因此，需要在培养基中附加一些碳水化合物以供需要。培养基中的碳水化合物通常是蔗糖或D-葡萄糖，用量通常为2%-4%，高者可达5%，亦可用市售的白糖所代替，但一般应增加用量，而且最好用比较固定的厂家生产的产品，以保证实验的稳定性。3.有机营养成分：包括人工合成或天然的有机附加物（包括维生素，氨基酸及其它有机物质等）。最常用的有酪朊水解物(水解乳蛋白、水解酪蛋白CH)、酵母提取物、玉米胚乳、麦芽浸出物、西红柿汁、椰子汁(CM)及各种氨基酸如甘氨酸（氨基乙酸）等。维生素：在培养基中加入维生素，常有利于外植体的发育。培养基中的维生素属于B族维生素，其中效果最佳的有硫氨素（维生素B1）、盐酸吡哆醇（维生素B6）和维生素H（生物素）、泛酸钙等、肌醇（环己六醇）、烟酸。在部分培养基中还添加维生素BX（氨酰苯甲酸）、维生素C（抗坏血酸）、维生素E（生育酚）、维生素B12（氰钴胺酸）、维生素BC（叶酸）、维生素B2（核黄素）和氯化胆碱等维生素。这些可能对某些植物或植物的某些代谢过程有重要作用，如肌醇主要以磷酸肌醇和磷脂酰肌醇的形式参与由Ca介导的信号转导。4.生长调节物质（常称为激素）常用的生长调节物质大致包括以下三类：(1)植物生长素类。主要作用是：诱导愈伤组织的产生，促进细胞脱分化；促进细胞的伸长；促进生根。如吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）、IBA（吲哚丁酸）、NOA（萘氧乙酸），P-CPA（对氯苯氧乙酸）、2，4-D（2，4-二氯苯氧乙酸），2，4，5-T（2，4，5-三氯苯氧乙酸）和ABT生根粉等。生长素的使用浓度通常为0.110mg/L。(2)细胞分裂素。如玉米素（Zt，6-（4-羟基-3-甲基-反式-2-丁烯氨基）嘌呤）、6-苄基嘌呤（6-BA或BAP）和激动素（Kt，6-呋喃氨基嘌呤）、2IP（异戊烯氨基嘌呤）和TDZ（thidiazuron,噻二唑苯基脲）等。作用主要是：第一，促进细胞分裂和扩大(与生长素促进细胞伸长的作用不同)，可使茎增粗，而抑制茎伸长；第二，诱导芽的分化，促进侧芽萌发生长；第三，抑制衰老，减少叶绿素的分解。延缓离体组织或器官的衰老过程，有保鲜的效果。但是，细胞分裂素对根的生长一般起抑制作用。在组培中，细胞分裂素的使用浓度通常为0.110mgL。细胞分裂素常常与生长素相互配合，用以调节细胞分裂，细胞伸长，细胞分化和器官形成。(3)赤霉素。组织培养中使用的赤霉素只有一种，即赤霉酸（GA3）。虽然已经用于顶端分生组织的培养和维管分化的研究，但在培养基中很少添加，因为它的作用往往是负面的。乙烯等。5.琼脂或其他支持物除液体悬浮培养外，就目前情况而言，琼脂是一种极为理想的支持物。一般浓度0.4%-1%，质量越差的琼脂用量越大。琼脂作为培养基的支持物，使培养基呈固体状态，以利于各种外植体的培养。6.其他添加剂（含天然提取物、抗生素等）活性炭 渗透调节剂 抗生素 抗氧化剂等。活性炭加入培养基中的目的主要是利用其吸附能力，减少一些有害物质的影响，例如防止酚类物质污染而引起组织褐化死亡。这在兰花组织培养中效果更明显。另外，活性炭使培养基变黑，有利于某些植物生根。但活性炭对物质吸附无选择性，既吸附有害物质，也吸附有利物质，因此使用时应慎重考虑，不能过量，一般用量为1%5。活性炭对形态发生和器官形成有良好的效应。在失去胚状体发生能力的胡萝卜悬浮培养细胞中加入1一4%活性炭可使胚状体的发生能力得以恢复。7.水 水是植物原生质体的组成成分，也是一切代谢过程的介质和溶媒。配制培养基母液时要用蒸馏水，以保持母液及培养基成分的精确性，防止储藏过程发霉变质。大规模生产时可用自来水。但在少量研究上尽量用蒸馏水，以防成分的变化引起不良效果。8.pH培养基的pH因培养材料不同而异，大多数植物都要求在pH5.65.8的条件下进行组织培养。常用0.1mol/L的Na0H和0.1mol/L的HCl来调节培养基的PH。但需注意两点：第一，经高温高压灭菌后，培养基的PH会下降0.20.8，故调整后的PH应高于目标pH0.5个单位；第二，pH的大小会影响琼脂的凝固能力，一般当pH大于6.0时，培养基将会变硬，低于5.0时，琼脂就不能很好地凝固。培养基种类：根据培养基态相不同分为固体培养基与液体培养基。固体培养基是指加凝固剂(多为琼脂)的培养基，其优点是外植体只是部分接触培养基，因此会使培养基中的效应物质产生一定的浓度梯度，从而有利于外植体的分化、生长。液体培养基是指不加凝固剂的培养基。外植体在液体培养基中能够与效应物质更好地接触，因此，生长速度比在固体培养基中更快。根据培养物的培养过程，培养基分为初代培养基与继代培养基。初代培养基是指用来第一次接种外植体的培养基。继代培养基是指用来接种继初代培养之后的培养物的培养基。根据其作用不同，培养基分为诱导培养基、增殖培养基和生根培养基。根据其营养水平不同，培养基分为基本培养基和完全培养基。基本培养基(就是通常称呼的培养基)主要有MS、White、B5、N6、改良MS、Heller、Nitsh、Miller、SH等。完全培养基就是在基本培养基的基础上，根据试验的不同需要，附加一些物质，如植物生长调节物质和其他复杂有机附加物等。组织培养培养基配制：选择合适的培养基是植物组织培养成功的基础。选择合适的培养基主要从以下两个方面考虑：一是基本培养基；二是各种激素的浓度及相对比例。MS培养基适合于大多数双子叶植物，B5和N6培养基适合与许多单子叶植物，特别是N6培养基对禾本科植物小麦、水稻等很有效，White培养基适合于根的培养。根据配方要求，用量筒或移液管从每种母液中分别取出所需的用量，放入同一烧杯中，并用粗天平称取蔗糖、琼脂放在一边备用。将中称好的琼脂加蒸馏水300400毫升，加热并不断搅拌，直至煮沸溶解呈透明状，再停止加热。将中所取的各种物质（包括蔗糖），加入煮好的琼脂中，再加水至1000毫升，搅拌均匀，配成培养基。用1N的氢氧化钠或盐酸，滴入中的培养基里，每次只滴几滴，滴后搅拌均匀，并用pH试纸测其pH值，直到将培养基的pH值调到5.8。将配好的培养基，用漏斗分装到三角瓶（或试管）中，并用棉塞塞紧瓶口，瓶壁写上号码。瓶中培养基的量约为容量的1/4或1/5。培养基的成分比较复杂，为避免配制时忙乱而将一些成分漏掉，可以准备一份配制培养基的成分单，将培养基的全部成分和用量填写清楚。配制时，按表列内容顺序，按项按量称取，就不会出现差错。组织培养培养基的灭菌与保存培养基配制完毕后，应立即灭菌。培养基通常应在高压蒸汽灭菌锅内，在汽相120条件下，灭菌20分钟。如果没有高压蒸汽灭菌锅，也可采用间歇灭菌法进行灭菌，即将培养基煮沸10分钟，24小时后再煮沸20分钟，如此连续灭菌三次，即可达到完全灭菌的目的。经过灭菌的培养基应置于10下保存，特别是含有生长调节物质的培养基，在45低温下保存要更好些。含吲哚乙酸或赤霉素的培养基，要在配制后的一周内使用完，其它培养基最多也不应超过一个月。在多数情况下，应在消毒后两周内用完。组织培养中几种常用培养基的配方化合物MS(1962)White(1943)N6(1974)B5(1968)Heller(1953)Nitsh(1972)Miller(1967)SH(1972)NH4NO316501000KNO319008028302527.510002500(NH4)2SO4463134NaNO3600KCl6575065CaCl2.2H2O44016615075166200Ca(NO3)2.4H2O300347MgSO4.7H2O370720185246.525018535400Na2SO4200KH2 PO417040068300K2H PO4300FeSO4.7H2O27.827.827.8515Na2.EDTA37.337.337.7520Na-Fe-EDTA28FeCl3.6H2OFe(SO4) 32.5MnSO4.4H2O22.374.4100.01254.4ZnSO4.7H2O8.631.521101.5Zn(螯合物)0.0310NiCl2.6H2O1.0CoCl2.6H2O0.025CuSO4.5H2O0.025AlCl3MoO3Na2MoO4.2H2O0.25TiO21.0KI0.830.750.80.750.01101.65.0H3BO3 6.21.51.631NaH2 PO4. H2O16.5150125烟酸0.50.50.515.0盐酸吡哆素VB60.50.10.511.05.0盐酸硫胺素VB10.10.11100.5肌醇100100100100甘氨酸232培养基配方B5培养基(Gamborg 等,1968)(1)无机物 NaH2PO4H2O 150 mg/L；KNO3 3000 mg/L；(NH4)2SO4 134mgL；MgSO47H2O 500 mg/L；Na2一EDTA 37.3 mg/L；FeSO47H2O 27.8 mg/L；MnSO4H2O 10 mg/L；ZnSO47H2O 2mg/L；H3BO3 3mg/L ；Na2MoO2H2O 0.25 m g/L；CuSO45H2O 0.025 mg/L；CoCl26H20 0.025 mg/L；KI 10 mg/L。(2)有机物 维生素B1 10mg/L；维生素B6 1 mg/L；甘氨酸 2.0 mg/L；叶酸 0.5 mg/L；肌醇 100.0mgL；蔗糖 50 gL；pH 5.5。B5培养基是1968年由Gamborg等设计的。它的主要特点是含有较低的铵盐，较高的硝酸盐和盐酸硫胺素。铵盐可能对不少培养物的生长有抑制作用，但它适合于有些植物如双子叶植物特别是木本植物的生长。HB培养基 Holley &Baker(1963) (1)无机盐(以1/2浓度的Knop液为基础) Ca(NO3)2.4H2O 1000mg/L；KNO3 125 mg/L；MgSO47H2O 125mg/L；KH2PO4 125 mg/L；Berthelots液 0.5ml/L。Berthelots液成分组成:MnSO44H2O 20g/L，KI 0.5g/L，NiCl26H20 0.05 g/L，CoCl26H20 0.05g/L，ZnSO47H20 0.10 g/L，CuSO45H2O 0.05g/L，BeSO44H2O 0.10 g/L，H3BO3 0.05g/L，浓硫酸 1ml。(2)有机物 维生素B1理学 1 mg/L；腺嘌呤 8 mg/L；NAA 2 mg/L；蔗糖 40gL 。H培养基(1)无机盐 KNO3 950 mg/L；NH4N03 720mgL；MgSO47H2O 185 mg/L；CaCl22H2O 166 mg/L；KH2PO4 68 mg/L；Na2一EDTA 37.3 mg/L；FeSO47H2O 27.8 mg/L；MnSO44H2O 25 mg/L；ZnSO47H2O 10mg/L；H3BO3 10mg/L ；Na2MoO2H2O 0.25 m g/L；CuSO45H2O 0.025 mg/L；(2)有机物 维生素B1 0.5mg/L；维生素B6 0.5 mg/L；甘氨酸 2.0 mg/L；叶酸 0.5 mg/L；肌醇 100.0mgL；烟酸 0.5 mg/L；生物素 0.05 mg/L；蔗糖 20 gL；pH 5.5。Kassanis 培养基(1957)(1)无机盐 Ca(NO3)2.4H2O 500mg/L；KNO3 125 mg/L；MgSO47H2O 125mg/L；KH2PO4 125 mg/L；Berthelots液 10滴。(2)有机物 酪蛋白 1 mg/L；半胱氨酸 10 mg/L；腺嘌呤 5 mg/L；烟酸 1 mg/L；维生素B6 1 mg/L；泛酸钙 10 mg/L；肌醇 0.1 mg/L；维生素H(生物素) 0.01 mg/L；蔗糖 20 gL。KC培养基 Knudson C(1964)(1)无机盐 KH2PO4 250 mg/L；Ca(NO3)2.4H2O 1000mg/L；(NH4)2SO4 500mg/L；MgSO47H2O 250 mg/L；FeSO47H2O 25 mg/L；MnSO44H2O 7.5 mg/L；(2)有机物 蔗糖 20gL ；pH 5.05.2 。LS培养基RM-64Linsmair & SKoog(1964)：(1)无机盐 NH4N03 l 650mgL；KNO3 1900 mg/L；CaCl22H2O 440 mg/L；MgSO47H2O 370 mg/L；KH2PO4 170 mg/L；Na2-EDTA 37.3 mg/L；FeSO47H2O 27.8 mg/L；H3BO3 6.2 mg/L ；MnSO44H2O 22.3 mg/L；ZnSO47H2O 8.6 mg/L；KI 0.83 mg/L；Na2MoO2H2O 0.25 mg/L；CuSO45H2O 0.025 mg/L；CoCl26H2O 0.025 mg/L。(2)有机物 维生素Bl 0.4 mg/L；肌醇 10.0mgL；蔗糖 30gL；pH 5.6。 * FeSO47H2O 5.57g，Na2-EDTA 7.45g 先溶于1升蒸馏水里，然后按每升培养基含5mg的比例加入培养基中。Miller 培养基(1963)(1)无机物 NH4N03 l 000mgL；KNO3 1000 mg/L；Ca(N03)24H2O 347mg/L ；KH2PO4 300 mg/L；KCl 65 mg/L；MgSO47H2O 35 mg/L；Na一Fe一EDTA 32 mg/L；MnSO44H2O 4.4 mg/L；ZnSO47H2O 1.5mg/L；H3BO3 1.6 mg/L ；KI 0.8 mg/L；CaCl22H2O 150 mg/L。(2)有机物 维生素Bl 0.1 mg/L；维生素B6 0.1mg/L；叶酸 0.5 mg/L；甘氨酸 2.0 mg/L；蔗糖 30gL；pH 6.0。M11er培养基与MS培养基比较，无机元素用量减少l312，微量元素种类减少，无肌醇。MS培养基RM62(Murashige & Skoog (1962)(1)无机盐类同LS培养基 。(2)有机物。？它的特点是无机盐的浓度高，具有高含量的氮、钾，尤其硝酸盐的用量很大，同时还含有一定数量的铵盐，这使得它营养丰富，不需要添加更多的有机附加物，就能满足植物组织对矿质营养的要求，有加速愈伤组织和培养物生长的作用，当培养物久不转移时仍可维持其生存。故这是目前应用最广泛的一种培养基。MT(murashge and Tucker)培养基(1)大量元素 NH4N03 l650mgL；KNO3 1900 mg/L；CaCl22H2O 440 mg/L；MgSO47H2O 370 mg/L；KH2PO4 170 mg/L；Na2一EDTA 37.3 mg/L；FeSO47H2O 27.8 mg/L；H3BO3 6.2 mg/L ；MnSO44H2O 22.3 mg/L；KI 0.83 mg/L；Na2MoO2H2O 0.25 m g/L；CuSO45H2O 0.025 mg/L；CoCl26H20 0.025 mg/L。(2)有机物 维生素Bl 0.4 mg/L；维生素B6 10.0mg/L；烟酸 5 mg/L；甘氨酸 2.0 mg/L；肌醇 100.0mgL；蔗糖 50gL。N6 培养基(北京植物所,黑龙江农业科学院,1974)(1)无机物 KNO3 2800 mg/L；(NH4)2SO4 463mgL；KH2PO4 400 mg/L；MgSO47H2O 185 mg/L；CaCl22H2O 165 mg/L；Na2-EDTA 37.3 mg/L；FeSO47H2O 27.8 mg/L；MnSO4H2O 4.4 mg/L；ZnSO47H2O 1.5mg/L；H3BO3 1.6mg/L ；KI 0.8mg/L。(2)有机物 维生素B1 1mg/L；维生素B6 0.5 mg/L；叶酸 1 mg/L；蔗糖 20 gL；pH 5.8。1974年由我国的朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养而设计的。其特点是KNO3和(NH4)2SO4含量高，不含铝。目前在国内已广泛应用于小麦、水稻及其他植物的花粉和花药培养和组织培养。Nielsen(1960)培养基(1)无机盐KNO3 200 mgL；Ca(N03)24H2O 800mgL ；MgSO47H2O 200mg/L；KH2PO4 200 mg/L；ZnSO47H2O 0.2mg/L；NiCl26H2O 0.3 mg/L；MnCl2H2O 1.8 mg/L；CuSO45H2O 0.08mg/L；H2MoO4H2O 0.02 mg/L；H3BO3 2.8mg/L；(2)有机物维生素B1 1mg/L；烟酸 5 mg/L；维生素B6 1 mg/L；蔗糖 30 gL。Nitsch &Nitsch (1969)培养基(1)无机盐 KNO3 950 mgL；NH4N03 720mgL；KH2PO4 68 mg/L；CaCl22H2O 166 mg/L；MgSO47H2O 185mg/L；FeSO47H2O 27.8 mg/L；Na2-EDTA 37.3 mg/L；MnSO44H2O 25mg/L；H3BO3 10 mg/L；ZnSO47H2O 10mg/L；CuSO45H2O 0.025mg/L；Na2MoO42H2O 0.25 mg/L；(2)有机物 维生素H(生物素) 0.05 mg/L；肌醇 100 mg/L；维生素B1 0.5mg/L；烟酸 5 mg/L；维生素B6 0.5 mg/L；甘氨酸 2.0 mg/L；叶酸 5 mg/L；蔗糖 20 gL。SH培养基(Schenk和Hidebrondt) SH培养基是1972年由Schenk和Hidebrondt设计的。它的主要特点与B5相似，不用(NH4)2SO4，改用(NH4)PO4，是矿质盐浓度较高的培养基。在不少单子叶和双子叶植物上使用效果很好。White培养基, White(1963)：(1)无机盐类 Ca(NO3)24H2O 287mg/L；KNO3 80mg/L；KCl 65 mg/L；NaH2PO4H2O 19.1 mg/L；MgSO47H2O 738 mg/L；Na2SO4：10H2O 453 mg/L；MnSO44H2O 6.6 mg/L；H3BO3 1.5 mg/L；ZnSO47H2O 2.7 mg/L；KI 0.75 mg/L；(2)有机物 甘氨酸 3.0 mg/L；烟酸 0.5 mg/L；维生素B6 0.1 mg/L；维生素B1 0.1 mg/L；柠檬酸 2.0 mg/L；蔗糖 20g/L；pH 5.7。又称WH培养基，是1943年White设计的，1963年做了改良。其特点是无机盐浓度较低。它的使用也很广泛，无论是生根培养还是胚胎培养或一般组织培养都有很好的效果。White培养基（改良）(White,1963)(1)无机盐 KNO3 80 mg/L；Ca(N03)24H2O 300mgL；MgSO47H2O 720 mg/L；Na2SO4 200 mg/L；KCl 65 mg/L ；Na H2PO45H2O 16.5 mg/L；Fe(SO4)3 2.5 mg/L；MnSO44H2O 7 mg/L；ZnSO47H2O 3mg/L；H3BO3 1.5mg/L ；CuSO45H2O 0.001 mg/L；MoO3 3 mg/L。(2)有机物 维生素B1 0.1mg/L；维生素B6 0.1 mg/L；甘氨酸 3.0 mg/L；肌醇 100.0mgL；烟酸 0.3 mg/L；蔗糖 20 gL；pH 5.0。花肥培养基Kano(1963)(Kyoto so1ution)花肥 3g/L；KH2PO4 250 mg/L；Ca(NO3)2.4H2O 1000mg/L；MgSO47H2O 250 mg/L；(NH4)2SO4 2mg/L；蔗糖 20gL ；pH 5.0。木本植物用培养基(WPM,Woody Plant medium)(1)无机盐 NH4N03 400mgL；Ca(NO3)2.4H2O 556mg/L；K2SO4 990 mg/L；CaCl22H2O 96 mg/L ；KH2PO4 170 mg/L；Na2MoO42H2O 0.25 mg/L；MgSO47H2O 370 mg/L；MnSO4H2O 22.4mg/L；ZnSO47H2O 8.6mg/L；CuSO45H2O 0.25mg/L；FeSO47H2O 27.8 mg/L；Na2-EDTA 37.3 mg/L。(2)有机物 肌醇 100 mg/L；维生素B1 1.0mg/L；烟酸 0.5 mg/L；维生素B6 0.5 mg/L；甘氨酸 2.0 mg/L；蔗糖 20 gL；琼脂 6gL；pH 5.2。MS培养基的配制：1、MS大量元素母液的配制一般将大量元素分别配制成10倍的母液，使用时再分别稀释10倍。依次分别称取：NH4NO3 16.5g；KNO3 19.0g ；KH2PO4 1.70g；MgSO47H2O 3.7g；CaCl22H2O 4.4g；共配成1L的母液。倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。2、MS微量元素母液的配制一般将微量元素配制成100倍母液。依次称取：KI 0.083g；Na2MoO42H2O 0.025g；H