生物工程下游技术第五章ppt课件

Separation and purification of products,Chapter 5 Cell disruption, protein recovery and separation,第五章 细胞破碎、蛋白质复性和固液分离,In this chapter, We consider the methods for cell rupture most likely to be useful at larger scales. These methods are conveniently split into two groups, described as “chemical” and “mechanical” . In the chemical methods, the cell membrane is ruptured by osmotic pressure, dissolved by detergents, or enfeebled by organic solvents. These chemical cases are often gentle so that the products are not irreversibly denatured even while the cells are ruptured. Scale-up is easy: If we want to treat 10 times the biomass, we need to use 10 times as much chemical.,The mechanical methods are dominated by homogenization or ball mill grinding. In both cases, cells are broken by high mechanical shear. Heat generation is a problem.,TABLE 1. Chemical Cell Disintegration Techniques,表 1. 细胞化学破碎法,TABLE 2. Mechanical Cell Disintegration Techniques,表 2. 细胞物理破碎法,CHEMICAL METHODS,The chemical methods of cell rupture are dominated by osmotic shock, detergent solubilization, and lipid dissolution. These three methods are described in the following paragraphs. Before this description, we want to give some brief generalizations about the other two methods: enzyme digestion and alkali treatment.,Both enzyme digestion and alkali treatment are effective methods of cell rupture, but each has a major disadvantage.,The disadvantage of enzyme digestion is the cost of the enzymes which Frequently makes this method prohibitive at a large scale. This is unfortunate, because the method is both gentle and selective. It is nothing more than adding to a cell suspension enzymes which react quickly with the cell walls and destroy them. Because the enzymes selectively catalyze these cell wall reactions, they react only sparingly with other solutes within the cell.,Alkali treatment is the antithesis of enzyme digestion, for it is harsh rather than gentle, nonselective rather than specific, and cheap rather than expensive. Alkali added to a cell suspension reacts with the cell walls in a number of ways, including the saponification of lipids in the cell walls.,In a sense, the treatment is an extreme example of solubilization, for it converts cell wall components into detergents. Including protein denaturations. As a result, the method tends both to rupture cell walls and to destroy products. Even though it is cheap, alkali treatment is less useful than the three methods which are detailed next.,A、Osmotic Shock,The simplest of the three major chemical methods is osmotic shock. This is nothing more than dumping a given volume of cells into pure water - often about twice the volume of cells. The cells swell because they contain solutes which cause an osmotic flow of water into the cells. In some cases, they swell so much that they burst. Their contents, released into the surrounding solution.,The susceptibility of cells to lysis depends strongly on their type. Red blood cells are easily lysed. Animal cells often can be lysed, but only after animal tissue has been mechanically minced or homogenized. Plant cells are much more difficult to lyse, for their cell walls often contain strong woody material which is relatively impermeable to osmotic flow.,B 、Solubilization,The second major method of chemically rupturing cells is solubilization by detergents. Typically, a concentrated detergent solution is added to about half the solutions volume of cells. The detergent disrupts the cell membrane. The resulting suspension can be centrifuged to remove cell fragments, and then run through an adsorption column or an extractor to isolate the product.,5. Large-Scale Recovery of Protein Inclusion Bodies by Continuous Centrifugation,Inclusion bodies (IBs) are micron-sized solid protein particles that form within the cytoplasm of certain host cells such as Escherichia coli following overexpression of a protein. IBs are comprised primarily of the recombinant protein of interest. Some contaminants including nonproduct protein, nucleic acids, and cell-envelope contaminants can also be incorporated into the granules.,However, it is believed that the majority of contaminants actually adhere to the IB surface following release from the cytoplasm during processing (1). This indicates that IB formation in vivo is a rather specific process that offers certain advantages for downstream processing. Specifically, the protein of interest already exists in a relatively pure state as a small granule that can be recovered by physical separation from nonassociated contaminants. Of course, if a suitably efficient protein refolding strategy is not available (2), then any gains achieved through inclusion body formation may be easily lost.,Strategies for the large-scale processing of proteins formed as IBs within E. coli are highly conservative, and based largely on laboratory procedures. IBs are initially released from the cell by mechanical disruption, providing a mixture of solid cellular debris (cell-wall particles, and so on), soluble host contaminants, and the IBs.,Continuous centrifugation is then employed to separate the denser IBs from contaminants. Continuous centrifugation differs from laboratory centrifugation, as the machines can be operated to provide a degree of separation of the solid IBs and the particulate cell debris. Following collection, and usually washing, the IBs are dissolved in strong denaturant prior to protein refolding and recovery by high-resolution methods such as chromatography. Further description of typical processes is provided elsewhere (3,4).,IB recovery depends strongly on the centrifuge design and operational parameters. The most commonly employed centrifuge for large-scale IB collection is the disk-stack design (Fig. 1). Material is fed through the center of the disk stack to the outer periphery, where it is then forced between the disks which are rotating at a high speed.,Solids are collected on the disks and flung to the outer periphery by centrifugal force. A sludge of particles (IBs and some debris) is collected in the bowl periphery, where it can be discharged (see Note 1). Clarified supernatant flows between the disks and exits at the machine centre, carrying any uncollected particles.,Essentially continuous separation of sludge and supernatant is therefore achieved, without the need to disassemble the centrifuge for solids removal. Machines ranging from laboratory size (e.g., 200 mL/min of feed suspension) through to full-scale production are available from the two main manufacturers, namely Westfalia Separator AG (Oelde, Germany) and Alfa Laval Separation AB (Tumba, Sweden).,Fig. 1. Cross section of a typical disk-stack centrifuge for inclusion-body collection. Reproduced with the kind permission of Westfalia Separator AG, Oelde,Germany, from the booklet “Centrifugal clarifiers and decanters for biotechnology.”,working principles,how a disk stack centrifuge works,1、目标产品分离与纯化的意义 目标产品的分离纯化在现代生物技术工业中占十分重要的位置，它决定着产品的纯度和安全性，也决定着产品的收率和成本。 2、分离纯化的两个基本阶段 1）产物的初级分离阶段 2）产物的纯化精制阶段,第一节 概述,初级分离阶段一般位于生物反应之后，其任务是分离细胞和培养液，破碎细胞释放产物（如果产物在胞内），溶解包涵体，复原蛋白质，浓缩产物和去除大部分杂质等。 纯化精制阶段是在初级分离的基础上，用各种高选择性手段（其中主要是各种色谱层析）将目标产物和干扰杂质尽可能地分开，使产物的纯度达到有关的要求，最后制成可以储藏、运输和使用的产品。,悬浮液的共同性质,1、目标产物浓度普遍比较低，悬浮液中大部分是水 2、组分非常复杂，是含有细胞、细胞碎片、蛋白质、核酸、脂类、糖类、无机盐类等多种物质的混合物。 3、分离过程很容易发生失活现象，PH、离子强度、温度等变化常常造成产物的失活。 4、性质不稳定，易随时间变化，如受空气氧化，微生物污染，蛋白质水解作用等。,分离要做到什么？,1、迅速加工，缩短停留时间 2、控制好操作温度和PH值 3、减少或避免与空气接触受污染的机会 4、设计好各组分的分离顺序,第二节 细胞破碎,细胞破碎技术是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术，是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质（产品）的基础。 结合重组DNA技术和组织培养技术上的重大进展，以前认为很难获得的蛋白质现在可以大规模生产。,细胞破碎机理图,1、自20世纪80年代初重组DNA技术得到广泛的应用以来，生物技术发生了质的飞跃，产品的数量越来越多，许多具有重要应用价值的产品应用而生（胰岛素、干扰素、生长激素、白细胞介素等）。 2、细胞破碎是提取胞内产物的关键步骤，它影响产物的活性、收率和成本，因而引起基因工程和生化工程学者的关注。,细胞破碎技术的发展背景,细胞破碎技术很多，可以用渗透原理，让细胞吸水涨大而达到细胞膜破碎的目的。 例：用纯化水稀释血液 也可以用离心的原理让细胞破碎，如将血液放入离心机中在4000转/分的转速下离心3分钟。 需注意的是细胞破碎用的是细胞而不是组织或其他。,细胞破碎阻力,细菌 几乎所有细菌的细胞壁都是由肽聚糖（peptidoglycan）组成，它是难溶性的聚糖链（glycan chain），借助短肽交联而成的网状结构，包围在细胞周围，使细胞具有一定的形状和强度。短肽一般由四或五个氨基酸组成，如L-丙氨酰-D-谷氨酰-L-赖氨酰-D-丙氨酸。而且短肽中常有D-氨基酸与二氨基庚二酸存在。 破碎细菌的主要阻力是来自于肽聚糖的网状结构，其网结构的致密程度和强度取决于聚糖链上所存在的肽键的数量和其交联的程度，如果交联程度大，则网结构就致密。,酵母菌,酵母细胞壁的最里层是由葡聚糖的细纤维组成，它构成了细胞壁的刚性骨架，使细胞具有一定的形状，覆盖在细纤维上面的是一层糖蛋白，最外层是甘露聚糖，由1,6一磷酸二酯键共价连接，形成网状结构。在该层的内部，有甘露聚糖-酶的复合物，它可以共价连接到网状结构上，也可以不连接。与细菌细胞壁一样，破碎酵母细胞壁的阻力主要决定于壁结构交联的紧密程度和它的厚度。,真菌,霉菌的细胞壁主要存在三种聚合物，葡聚糖（主要以-1,3糖苷键连接，某些以-1,6糖苷键连接），几丁质（以微纤维状态存在）以及糖蛋白。最外层是-和-葡聚糖的混合物，第2层是糖蛋白的网状结构，葡聚糖与糖蛋白结合起来，第3层主要是蛋白质，最内层主要是几丁质，几丁质的微纤维嵌入蛋白质结构中。与酵母和细菌的细胞壁一样，真菌细胞壁的强度和聚合物的网状结构有关，不仅如此，它还含有几丁质或纤维素的纤维状结构，所以强度有所提高。,植物细胞,植物细植物细胞可以分为初生壁和次生壁。初生壁是细胞生长期形成的。 次生壁是细胞停止生长后，在初生壁内部形成的结构。目前，较流行的是由Lampert等人提出来的经纬模型。依据这一模型，纤维素的微纤丝以平行于细胞壁平面的方向一层一层敷着在上面，同一层次上的微纤丝平行排列，而不同层次上则排列方向不同，互成一定角度，形成独立的网络，构成了细胞壁的“经”，模型中的“纬”是结构蛋白（富含羟脯氨酸的蛋白），它由细胞质分泌，垂直于细胞壁平面排列，并由异二酪氨酸交联成结构蛋白网，径向的微纤丝网和纬向的结构蛋白网之间又相互交联，构成更复杂的网络系统。,一、细胞破碎技术的分类,目前已发展了多种细胞破碎方法，以便适应不同用途和不同类型的细胞壁破碎。 破碎方法可规纳为机械法和非机械法两大类。,常用破碎方法,二、几种常用的破碎方法,采用高压匀浆器（由高压泵和匀浆阀组成，英国APV公司和美国 Microfluidics公司均有产品出售）。,高压匀浆法（High-pressure homogenization） 大规模细胞破碎的常用方法,1、高压匀浆破碎法（homogenization）,(1)作用机理 高压匀浆器是常用的设备，它由可产生高压的正向排代泵（positive displacenemt pump）和排出阀（discharge valve）组成，排出阀具有狭窄的小孔，其大小可以调节。细胞浆液通过止逆阀进入泵体内，在高压下迫使其在排出阀的小孔中高速冲出，并射向撞击环上，由于突然减压和高速冲击，使细胞受到高的液相剪切力而破碎。在操作方式上，可以采用单次通过匀浆器或多次循环通过等方式，也可连续操作。为了控制温度的升高，可在进口处用干冰调节温度，使出口温度调节在20左右。在工业规模的细胞破碎中，对于酵母等难破碎的及浓度高或处于生长静止期的细胞，常采用多次循环的操作方法。,高压匀浆器,在工业规模的细胞破碎中，对于酵母等难破碎的及高浓度的细胞，常采用多次循环的操作方法。,易造成堵塞的团状或丝状真菌， 较小的革兰氏阳性菌， 含有包含体的基因工程菌（因包含体坚硬，易损伤匀浆阀）,不宜采用高压匀浆法。,(2)动力学方程,Rm Ln =KNpa Rm-R,R:单位生物量释放的产物量；Rm:R的最大值 K：破碎速度常数；N: 破碎次数；P：操作压力 a:指数，因生物而异。,影响因素,1、匀浆次数 2、压力 3、环境条件（培养基、生长期、稀释率等） 4、产物的性质（胞间物质释放快于胞内物质，膜结合酶最难释放）,高压匀浆过程的蛋白质释放率R与匀浆次数N及压力P(MP）的关系,（3）温度控制和能耗,1、温度影响产物的活性 2、温度控制需要能耗,（4）存在的问题,除了较易造成堵塞的团状或丝状真菌以及较小的革兰氏阳性菌不适合用高压匀浆器处理外，其他微生物细胞都可以用高压匀浆法破碎。另外有些亚细胞器（如包涵体）质地坚硬，易损伤匀浆阀，也不适合用该法处理。,（1）作用机理：进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂（直径小于1mm）一起快速搅拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内含物。在珠液分离器的协助下，珠子被滞留在破碎室内，浆液流出从而实现连续操作。破碎中产生的热量一般采用夹套冷却的方式带走。,2、高速珠磨法（high-speed Bead mill）,WSK 卧式高效全能珠磨机,Crushing in ball mill,ZM系列 卧式密闭珠(砂)磨机,在珠磨法中，细胞的破碎率也能用一级速率方程式表示： ln1/(1-R)=Kt K破碎速率常数 t停留时间 R破碎率 破碎速率常数K与许多操作参数有关，如搅拌转速、料液的循环流速、细胞悬浮液的浓度、玻璃小珠的装置和珠体的直径以及温度等。,High Speed Bead Mill,（2）动力学方程,（3）温控与能耗,珠磨机是采用夹套冷却的方式实现温度控制的，一般情况下能够将温度控制在要求的范围内。 珠磨机破碎的能耗与细胞破碎率成正比（提高破碎率，需要增加装珠量，或延长破碎时间，或提高转速，这些措施不仅导致电能消耗的增加，而且产生较多的热量，引起浆液温度升高，从而增加了制冷费，因此总能耗增加。 试验表明，破碎率80%，能耗大大提高。不仅如此，高破碎率还给后分离带来麻烦。 总之，不管是高压匀浆，还是珠磨机破碎，都不是以破碎率为基准的，而考虑产物的收率和兼顾上下游过程。,水平搅拌式珠磨机破碎酵母细胞过程的能耗E与流速F及浓度C的关系,实验室规模的细胞破碎设备有Mickle高速组织捣碎机、 Braun匀浆器； 中试规模的细胞破碎可采用胶质磨处理； 在工业规模中，可采用高速珠磨机（瑞士WAB公司和德国西门子机械公司制造）。,珠磨法的破碎率一般控制在80%以下：降低能耗、减少大分子目的产物的失活、减少由于高破碎率产生的细胞小碎片不易分离而给后续操作带来的困难。,振荡珠击破碎法 (Skaking Bead),将等体积的小量组织样品与高密度的ZircoBeads放入可密封的2ml螺旋盖微量管中,再加入缓冲液与稳定成份到1.5ml的体积, 用6500RPM振荡机高速上下振动8秒,休息8秒,再振动8秒即可.此方法是目前最快且一次可处理最多样品的方法. 一台机器最多可以在一天处理2400支样品.对小量且多样的人很方便.,（4）两种方式的比较,高压匀浆法同高速珠磨法相比各有特点，前者操作参数少，易于确定，后者操作参数多，一般凭经验估计，并且玻璃珠之间的液体损失使一次处理85ml悬浮液最终只能得到50ml左右的浆液。 连续操作时，珠磨机兼具破碎和冷却双重功能，减少了产物失活的可能性，而高压匀浆器配备换热器进行级间冷却。 珠磨机法破碎在适当条件下一次操作就能达到较高的破碎率，而高压匀浆往往需循环2-4次才行。 几乎所有种类的微生物细胞都可以用珠磨机破碎，包括含有包涵体的基因工程菌。,3、超声波破碎法（ultrasonication）,超声波破碎法利用超声波振荡器发射的15-25kHz的超声波探头处理细胞悬浮液。 超声波振荡器有不同的类型，常用的为电声型，它是由发生器和换能器组成，发生器能产生高频电流，换能器的作用是把电磁振荡转换成机械振动。超声波振荡器可分为槽式和探头直接插入介质两种型式，一般破碎效果后者比前者好。,（1）作用机理,声频高于1520kHz的超声波在高强度声能输入可以进行细胞破碎，其破碎机理尚未清楚，可能与空化现象引起的冲击波和剪切力有关。 空化现象是在强声波作用下，让气泡形成，胀大和破碎的现象。 超声破碎的效率与声频、声能、处理时间、细胞浓度及菌种类型等因素有关。,在15-25 kHz的频率下操作。其原理可能与空化现象（cavitation phenomena）引起的冲击波和剪切作用有关。 空穴泡由于受到超声波的迅速冲击而闭合，从而产生一个极为强烈的冲击波压力，由它引起的粘滞性旋涡在介质中的悬浮细胞上造成了剪切应力，促使细胞液体发生流动，从而使细胞破碎。,超声波破碎法（Ultrasonication）,一般杆菌比球菌易破碎，G-细菌比G+细菌易破碎，对酵母菌的效果较差， 该法在实验室小规模细胞破碎中常用。 但超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质失活。,(2)动力学方程,（3）存在的问题,超声破碎在实验室规模应用较普遍，处理少量样品是操作简便，液量损失少。 超声波产生的化学自由基团能使某些敏感活性物质变性失活，噪声令人难以忍受，而且大容量装置声能传递，散热均有困难，因而超声破碎的应用潜力有限。,电声超声波发生器,非机械法,某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁或膜的通透性（渗透性），从而使胞内物质有选择地渗透出来，这种处理方式称为渗透法。,4.化学渗透法（Chemical permeation）,（1）作用机理,化学渗透取决于化学试剂的类型以及细胞壁和膜的结构与组成。 不同试剂对各种微生物细胞作用的部位和方式有所差异。,处理G-细菌，对细胞外层膜有破坏作用。G-细菌的外层膜结构通常靠二价阳离子Ca2+或Mg2+结合脂多糖和蛋白质来维持，一旦EDTA将Ca2+或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子将脱落，使细胞壁外层膜出现洞穴。这些区域由内层膜的磷脂来填补，从而导致内层膜通透性的增强。,（1）EDTA作为螯合剂,能溶解细胞壁中的类脂，使胞壁膜溶胀，细胞破裂，胞内物质被释放出来。 溶解细胞膜的磷脂层 甲苯、苯、氯仿、二甲苯及高级醇等。,（2）有机溶剂,如Triton X-100是一种非离子型清洁剂，对疏水性物质具有很强的亲和力，能结合并溶解磷脂，破坏内膜的磷脂双分子层，使某些胞内物质释放出来。 其他的表面活性剂，如牛黄胆酸钠、十二烷基磺酸钠等也可使细胞破碎。,（3）表面活性剂-Triton X-100,可促使细胞某些组分溶解，其增溶作用有助于细胞的破碎。,盐酸胍（Guanidine hydrochloride）和脲（Urea）是常用的变性剂。 变性剂与水中氢键作用，削弱溶质分子间的疏水作用，从而使疏水性化合物溶于水溶液。,（4）变性剂,* 表适用,通用性差. 时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过50%. 有些化学试剂有毒 .,化学渗透法优点：(与机械法相比）,缺点：,对产物释放有一定的选择性. 可使一些较小分子量的溶质如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍滞留在胞内。控制条件可以有选择地释出细胞不同部位的产物。 细胞外形完整，碎片少，有利于后分离。 核酸释出量少，浆液粘度低，易于固液分离和进一步提取。,五、酶溶法（enzyme lysis） 酶溶法就是用生物酶将细胞壁和细胞膜消化溶解的方法。,酶溶法（Enzymatic Lysis）,外加酶法,常用的溶酶,溶菌酶、 -1，3-葡聚糖酶、 -1，6-葡聚糖酶、 蛋白酶、 甘露糖酶、 糖苷酶、 肽键内切酶、 壳多糖酶等,溶菌酶主要用于细菌类,细胞壁溶解酶是几种酶的复合物,酵母菌的结构,对酵母细胞采用酶法破碎时，先加入蛋白酶作用蛋白质-甘露聚糖结构，使二者溶解，再加入葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖层，最后只剩下原生质体，这时若缓冲液的渗透压变化，则细胞膜破裂，释出胞内产物。,利用溶酶系统处理细胞时必须根据细胞壁的结构和化学组成选择适当的酶，并确定相应的次序。,酶溶法的优点： 选择性释放产物，条件温和，核酸泄出量少，细胞外形完整。,缺点：溶酶价格高，溶酶法通用性差（不同菌种需选择不同的酶），产物抑制的存在。 在溶酶系统中，甘露糖对蛋白酶有抑制作用，葡聚糖抑制葡聚糖酶。,诱发微生物产生过剩的溶胞酶或激发自身溶胞酶的活力，以达到细胞自溶的目的。 影响自溶过程的主要因素有温度、时间、pH值、激活剂和细胞代谢途径等。 缺点是：对不稳定的微生物，易引起所需蛋白质的变性，自溶后细胞悬浮液粘度增大，过滤速度下降。,自溶法（Autolysis）,自溶是一种特殊的酶溶方式。控制条件（温度、pH、添加激活剂等）可以增强系统自身的溶酶活性，是细胞壁自发的溶解。,（1）作用机理,溶酶同其他酶一样具有高度的专一性，蛋白酶只能水解蛋白质，葡聚糖酶只对葡聚糖起作用，因此利用溶酶系统处理细胞必须根据细胞的结构和化学组成选择适当的酶，并确定相应的使用次序。,（2）存在问题,在溶酶系统中，产物抑制是一个不可忽视的问题，甘露糖对蛋白酶有抑制作用，葡聚糖抑制葡聚糖酶。产物抑制可能是导致胞内物质释放率低的一个重要因素。目前酶溶法仅限于实验室规模应用。,6、微波加热法,微波加热法（microvave heating)是利用微波场中介质的偶极子转向极化与界面极化的时间与微波频率吻合的特点，促使介质转动能级跃迁，加剧热运动，将电能转化为热能。,作用机理,微波加热导致细胞内的极性物质，尤其是水分子吸收微波能，产生大量的热量，使胞内温度迅速上升，液态水汽产生的压力将细胞膜和细胞壁冲破，形成微小的孔洞。 细胞内部和细胞壁水分减少，细胞收缩，表面出现裂纹。 （孔洞和裂纹的存在使胞外溶剂容易进入胞内，溶解并释放出胞内产物）,优缺点,优点： 微波具有穿透力强、选择性高、加热效率高等特点，可以用来处理微生物、植物和动物细胞提取胞内有效成分。 缺点： 1、一般只适用于对热稳定的产物（如寡糖、多糖、核酸、生物碱、黄酮、苷类等中药成分），对于热敏感性物质（如蛋白质、多肽、酶等）微波加热容易 导致变性失活。 2、要求被处理的材料具有良好的吸水性，或者待分离的产物所处的位置容易吸水。 3、不适合于富含淀粉或树胶的天然植物。,将浓缩的菌体悬浮液冷却至-25形成冰晶体，利用500MPa以上的高压冲击，使冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。细胞破碎是由于冰晶体的磨损，使包埋在冰中的微生物变形而引起的。 此法主要用于实验室，适应范围广、破碎率高、细胞碎片粉碎程度低及活性保留率高等优点，但不适应于对冷冻敏感的生化物质。,7、其他方法,X-press法,将细胞放在高渗透压的介质中（如一定浓度的甘油或蔗糖溶液），达平衡后，转入到渗透压低的缓冲液或纯水中，由于渗透压的突然变化，水迅速进入细胞内，引起细胞溶胀，甚至破裂。 仅适用于细胞壁较脆弱的细胞或细胞壁预先用酶处理或在培养过程中加入某些抑制剂（如抗生素等），使细胞壁有缺陷，强度减弱。,渗透压法（Osmotic pressure）,将细胞放在低温下突然冷冻而在室温下缓慢融化，反复多次而达到破壁作用。由于冷冻，一方面使细胞膜的疏水键结构破裂，另一方面胞内水结晶，使细胞内外溶液浓度变化，引起细胞膨胀而破裂。 适用于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较低，需反复多次，此外，在冻融过程中可能引起某些蛋白质变性。,反复冻结-融化法,使细胞结合水分丧失，从而改变细胞的渗透性。当采用丙酮、丁醇或缓冲液等对干燥细胞进行处理时，胞内物质就容易被抽提出来。 气流干燥主要适用于酵母菌，一般在25-30的气流中吹干； 真空干燥多用于细菌。,干燥法,三、细胞破碎技术研究的发展方向,多种破碎方法相结合： 化学法、酶法、机械法相结合。 如用溶解酶预处理面包酵母，然后高压匀浆，95MPa压力下匀浆4次，总破碎率接近100%。而单独采用高压匀浆法，同样条件下破碎率只有32%。,与上游过程和下游工程相结合： 在发酵培养过程中，培养基、生长期、操作参数（如pH、温度、通气量、搅拌转速、稀释率等）等因素都对细胞壁膜的结构与组成有一定的影响。细胞的破碎与上游培养过程有关。 此外，用基因工程的方法对菌种进行改造，以提高胞内物质的提取率也是非常重要的。 在生长后期，加入某些能抑制或阻止细胞壁物质合成的抑制剂（如青霉素、环丝氨酸等），继续培养一段时间后，新分裂的细胞其细胞壁有缺陷，利于破碎； 选择较易破碎的菌种作为寄主细胞，如革兰氏阴性细菌； 在细胞内引进噬菌体基因，培养结束后，控制一定条件（如温度等），激活噬菌体基因，使细胞自内向外溶解，释放出内含物。,第三节 蛋白质复性,蛋白质的复性：指在一定条件下，变性的蛋白质分子恢复其原有的天然构象并恢复生物活性的现象。,蛋白质工程-途径,基因工程（基因导入细胞） 产物表达 产物获得,存在问题,获得产物需要破碎细胞 蛋白质结构错误,分离活性蛋白过程,破碎细胞 分离包含体 溶解包含体 目标产物的构型复原,包涵体的优点,1、包含体蛋白能够免受宿主蛋白质的降解。 2、不会对宿主细胞造成毒害，影响生长。,蛋白质复性路径,1、机械破碎-离心提取包含体-变性剂溶解-除变性剂 2、机械破碎-膜分离除可溶性蛋白-变性剂溶解包含体-除变性剂复性 3、化学破碎-离心除细胞碎片-除变性剂复性,具体复性方法,1、稀释复性与透析复性-蛋白质复性最常用的方法 1）溶液稀释 2）透析、超滤或电渗析除去变性剂 2、色谱复性 1）凝胶过滤色谱复性 2）吸附型色谱复性 优点： 1）色谱介质对变性蛋白质的作用可明显地减少变性蛋白质分子在