生物工程专业毕业设计-金龟子绿僵菌对熊果酸转化条件的研究.doc

本科毕业论文金龟子绿僵菌对熊果酸转化条件的研究邱益池200830620120指导教师 肖苏尧 讲师学院名称食品学院 专业名称生物工程论文提交日期2012年5月7日 论文答辩日期2012年5月21日摘 要熊果酸（Ursolic Acid）是存在于天然植物中的一种三萜类化合物，分子式为C30H48O3。具有镇静、抗炎、抗菌、抗糖尿病、抗溃疡、降低血糖等多种生物学效应，熊果酸还具有明显的抗氧化功能，因而被广泛地用作医药和化妆品原料。但是熊果酸生物利用度低，制剂种类单一，限制了其生物活性的开发。修饰改造其分子结构，从而提高生物利用度，达到保护环境、创制新药的目的。本研究旨在利用金龟子绿僵菌对熊果酸进行生物转化，在已知金龟子绿僵菌可对熊果酸进行生物转化的情况下，通过优化培养基，以及将转化温度、pH、摇床速度等转化条件作为主要因素变量进行综合考察，对其转化条件进行优化。经优化培养基组分以及转化工艺条件，可得优化液体培养基PDA（g/L）：土豆200、葡萄糖20、玉米浆20、酵母膏3、K2HPO4 1.5，并可确定最佳转化条件，温度、pH、转速最佳条件分别为28、6.5、160rpm。首先，建立了熊果酸的检测方法，确定TLC定性分析法的展开剂为环己烷:乙酸乙酯:乙酸=4:1.5:2滴，显色剂为10%的硫酸乙醇溶液；通过对流动相比例的调整，确定HPLC检测法的流动相为乙腈:水的体积比为85:15，等梯度洗脱，检测波长为210nm，流速是1.0 mL/min，温度为32。利用金龟子绿僵菌（购自上海中科院研究所）对熊果酸进行生物转化，通过以熊果酸转化率为指标，逐一设定最优培养基组合、适宜斜面培养时间、最适接种量、最适转化反应时间、最适转化工艺等最适条件，特别对培养基组合与转化工艺条件组合进行正交设计实验，得到最优组合。关键词：熊果酸 金龟子绿僵菌 生物转化 Transformation Conditions of Ursolic Acid by Metarhizium AnisoplaeQiu Yichi（College of Food Science, South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China）Abstract: Ursolic acid is a pentacyclic triterpene exist in the natural plants. Its molecular formula is C30H48O3. It has many bioactivities, including sedation, anti-inflammatory activity, anti-bacterial activity, anti-virus activity, diabetes, peptic ulcer, reduce blood sugar. It is also widely used in the material of medicine and cosmetics because of the obvious antioxidant function. Since ursolic acid has limited active sites for chemical modification, its not easy to obtain large number of its derivatives for effective structureactivity relationship (SAR) study. This research studied the transformation of Ursolic acid by some microorganism in an attempt to modify its structure so as to improve the bioavailability, protect the environment and create the new medicine.This study aims to take advantage of Metarhizium anisopliase biotransformation of ursolic acid, in case of known Metarhizium anisopliase was abled to transform ursolic acid, by modifying medium components, and taking conversion of temperature, pH, wave speed of Shaker to a comprehensive study of conditions as the main variable. After modified, we got optimized liquid medium PDA(g/L):potatoes 200, glucose 20, corn steep liquor, yeast extract, K2HPO4 1.5, and got the best conditions were 28，pH6.5, 160rpm.First of all,we established the detection method of ursolic acid. And we determined the TLC qualitative analysis developing solvent is cyclohexane: ethyl acetate: acetic acid=4:1.5:2, and the color-developing agent is 10% sulfuric acid ethanol solution. Through the adjustment of the ratio of the mobile phase, we can also decide the HPLCs mobile phase: acetonitrile: water=85:15(volume ratio), constant gradient elution, detection wavelength 210nm, velocity is 1.0 mL/min, temperature 32.By using Metarhizium anisopliae to transform ursolic acid, taking ursolic acid conversion rate as indicator, setting the optimal mediun components, the appropriate slant culture, the optimum inoculation amount, the optimum transformation time, the optimum conversion conditions,ect. In particular, the design of orthogonal experiments of the medium components combination and transformation process conditions is needed to obtain the optimal combination.Key words: ursolic acid Metarhizium anisopliae biotransformation目 录1 前言11.1 熊果酸的概述11.1.1 熊果酸的性质及应用11.1.2 熊果酸的临床应用11.1.3 熊果酸的结构修饰衍生物研究31.2 微生物转化技术以及微生物催化萜类化合物的应用41.2.1 微生物催化萜类化合物的生物转化反应51.2.2 熊果酸及其衍生物的生物转化51.2.3 可催化萜类化合物生物转化的酶源菌株62 材料与方法62.1 实验材料与工具62.1.1 实验菌种和培养基62.1.2 仪器与设备62.1.3 实验试剂72.2 实验方法82.2.1 基础实验方法82.2.1.1 薄层色谱分析法82.2.1.2 反相高效液相色谱法82.2.2 菌种的保藏与扩增82.2.3 菌落观察92.2.4 培养基的选择92.2.4.1 转化培养基中碳源种类及适宜浓度的确定92.2.4.2 转化培养基中主要氮源种类及适宜浓度的确定92.2.4.3 转化培养基中辅助氮源适宜浓度的确定92.2.4.4 适宜碳氮源组成的优化实验102.2.4.5 无机盐K2HPO4适宜浓度的选择102.2.5 孢子悬浮液的配制102.2.6 菌株培养与熊果酸的转化102.2.7 发酵产物粗品的提取与检测102.2.8 转化产物在发酵体系中的分配测定102.2.9 转化产物的分离与检测102.2.10 金龟子绿僵菌自身代谢产物与加入熊果酸后代谢产物的比较113 实验结果113.1 金龟子绿僵菌菌落与孢子观察结果113.2 适宜斜面培养时间的确定113.3 转化反应产物在体系中的分配情况113.4 培养基的选择123.4.1 转化培养基中碳源种类的确定123.4.2 初始葡萄糖浓度对转化的影响133.4.3 转化培养基中主要氮源种类的确定143.4.4 初始玉米浆浓度对转化的影响143.4.5 初始酵母膏浓度对转化的影响153.4.6 适宜碳氮源组成的优化实验153.4.7 无机盐K2HPO4对转化的影响183.5 接种量对转化产物的影响及选择183.6 转化反应时间的选择193.7 转化条件对转化率的影响203.7.1 转化温度对转化率的影响203.7.2 培养基pH对转化率的影响203.7.3 摇床转速对转化率的影响213.7.4 转化工艺条件的优化实验223.8 金龟子绿僵菌对熊果酸转化的HPLC图谱结果244 讨论与分析244.1 培养基的确定244.2 不同的投底物方式254.3 稀释补料工艺255 结论25参考文献27致谢31本科生毕业论文成绩评定表321 前言1.1 熊果酸的概述1.1.1 熊果酸的性质及应用熊果酸(uxsolicacid，简称UA)又名乌苏酸、乌索酸，是乌苏烷型三萜，分子式为C30H48O3(结构式见图1)，属-香树脂醇型五环三萜类化合物，在植物界分布较广，据不完全统计，在自然界已从34科108种植物中分离得到熊果酸。熊果酸主要存在于杜鹃花科植物熊果的叶、果实，玄参植物毛泡桐的叶，茜草科植物桅子的果实，龙胆科植物湿生蕾、木挥科植物女贞的叶，紫威科植物毛子草的地上部分，以游离形式或结合成糖苷存在。有研究表明熊果酸具有广泛的生物学效应，且其资源较丰富，价格低廉，故而具有良好的开发前景。1990年，日本将熊果酸列为最有希望的癌化学预防药物之一。今年来，国内外学者围绕熊果酸及其衍生物的药理学作用、熊果酸衍生物的构效关系做了大量研究，取得了可喜的成果。熊果酸为白色针状结晶，熔点227-228。易溶于二氧六环、吡啶，溶于甲醇、乙醇、丁酮，略溶于丙酮，微溶于苯、氯仿、乙醚，不溶于水和石油醚。熊果酸作为五环三萜类化合物结构的典型代表是多种天然产物的主要功能成分，属于有机三萜酸（陈武等，2003）。具有镇静、抗炎、抗菌、抗糖尿病、抗溃疡、抗肿瘤（Yoshikawa et al，2000）、保肝（杜瑜等，2006）等多种生物学效应，另外，熊果酸还具有明显的抗氧化功能，因而被广泛地用作医药和化妆品原料。图1 熊果酸结构1.1.2 熊果酸的临床应用随着研究的不断深入，熊果酸得到了广泛的应用。熊果酸临床表现有显著而迅速降低谷丙转氨酶、消退黄疽、增进食欲和恢复肝功能的作用，具有见效快、疗程短、效果稳定的特点（陈武等，2001）。Lee I等验证了熊果酸有明显的趋脂停用和抗纤维化，并能保护和稳定肝细胞膜及细胞器的生物膜系统，使其变动通透及主动运输功能恢复正常，细胞内外离子和水的移动及分布亦随之复原，再生能力相继俄复，促进小叶中央区坏死肝细胞修复（Lee I et al，2001）。另外，以熊果酸为主要成分的女贞叶提取物制成的胶囊剂主要用于肝肾阴虚、阴虚阳亢症所致的原发性高脂血症，是我国批准的二类新药。熊果酸对肿瘤形成生长各阶段具有预防和抑制作用。Li J等实验及临床试验证明熊果酸及其同分异构提齐墩果酸均能抗DNA突变、抑制癌变的启动，并且熊果酸能对抗致癌物如苯并芘B（a）P，黄曲霉毒素B1诱发基因突变（Li J et al，2002）。石川弘伦等发明了一种毒性程序较低的转移抑制剂，熊果酸或其盐作为活性成分，可以口服或通过注射给药，使患者手术后不需要接受卧床治疗（石川弘伦等，2006）。熊果酸能导致细胞生存能力下降。王鹏证明熊果酸诱导基因组DNA分裂表面其诱导细胞死亡的机理是通过细胞凋亡，熊果酸能抑制人急性早幼粒白血病细胞（HL-60）的增殖，并能诱导共发生凋亡。日本1983-2004年的有关熊果酸的29篇专利中，有10篇是关于熊果酸的皮肤美容保健方面的应用，熊果酸及其盐或衍生物能作为蛋白酶抑制剂，尤其是丝氨酸蛋白酶抑制剂，起到预防和治疗皮炎、皮肤粗糙、干燥等作用。熊果酸及其衍生物能抗紫外线、改善和恢复真皮胶原纤维素结构，起到美白和防皱作用。熊果酸的树胶醛昔、木糖昔等昔类能充分刺激皮肤的保湿功能，熊果酸性质稳定，颜色和气味不随时间改变，而且有很好的触摸感，因此在美容、护肤中有广泛的应用。另外日本专利显示熊果酸在抗癌保健食品、饮料和护发素、头发生长剂等方面也有一定的应用。熊果酸对杀灭和抑制变形链球菌组及牙周病原菌、口腔舌癌细胞具有明显的效果，可作为有效成份用于制备口腔卫生用品、口腔保健品及制备治疗口腔疾病的药物。谭仁祥等研究证实了熊果酸的抗抑郁作用，并将含有熊果酸的紫苏提取物作为治疗抑郁症的药物（卢艳花等，2000）。熊果酸的抗抑郁作用与抗抑郁的首选西药氟西汀相似，但其几乎没有副作用，相比西药的抗抑郁谱窄、毒副作用大，用药后易复发和诱发自杀倾向等有着显著的优势。以熊果酸为主要成分的女贞叶提取物制成的胶囊剂主要用于肝肾阴虚、阴虚阳亢症所致的原发性高脂血症，是我国批准的二类新药。另外熊果酸作为药引子，常用于软膏剂、悬浮剂、凝胶剂、溶液剂、贴剂、喷雾剂等局部用药，对抗病毒药物阿昔洛韦可产生极佳的促进吸收效果（胡幼圃，1991）。1.1.3 熊果酸的结构修饰衍生物研究熊果酸广泛存在于天然植物中，具有多种显著的药理活性。今年来越来越多的科学家对其金星奖结构改造以得到高活性化合物，例如对C-3位、C12-C13双键或对C-28位的修饰。Chaomei等从锁阳中提取出了熊果酸、乙酰熊果酸、熊果酸丙二酰单酯，初步研究表明在抑制HIV蛋白酶的活性方面，熊果酸丙二酰单酯比熊果酸要高，同时还报道了熊果酸的C-3位羟基上引入酸链的长短与抑制HIV活性存在一定的关系，含6个碳以内的酸链随着链接碳原子个数的增加，抑制HIV活性增强（Chaomei et al，1999）。Finlay等将熊果酸C-3位羟基氧化成酮，然后将A环打开获得系列衍生物，用于抑制前列腺细胞NRP.152增长试验，结果显示，与熊果酸及其3-氧化化合物相比，A环开环的化合物抑制NRP.152细胞增殖的活性增强，且A环链接醛基和氨基比链接氰基、羧基抑制前列腺细胞增殖的活性更强（Finlay HJ et al，1997）。陈军等以熊果酸为先导化合物，对其A环和C-28位进行了结构修饰，共合成15个熊果酸衍生物，生物活性测试显示，熊果酸是一个中等强度的糖原磷酸化酶抑制剂，合成的大部分衍生物都显示出一定的抑制糖原磷酸化酶的活性（陈军等，2006）。Ohigashi小组（Tokuda et al，1986）在1986年研究了熊果酸及其衍生物对人淋巴瘤细胞株Raji的细胞抑制作用。熊果酸显示出与已知的肿瘤生长抑制剂-维甲酸(Retinoic acid)相当的抑制活性，同时研究表明，3-羰基熊果酸的抑制活性要明显高于熊果酸母体。目前Simone等在保留熊果酸C-3位乙酰氧基的基础上，设计和合成了20多个新熊果酸哌嗪化合物，并对抗恶性疟原虫CQ耐药株FcB1和对人胚肺成纤维细胞株MRC-5细胞毒性作用作了相关试验，结果发现7个新的熊果酸哌嗪化合对抗恶性疟原虫CQ耐药株FcB1有突出的活性，IC50均在78167nmol/L范围内，而熊果酸与3-乙酰氧基熊果酸的IC50分别是52.93和24.93mol/L，由此可见，结构改造后的新化合物抗菌活性显著提高（Simobe C B G，2008）。Zhang等在C-28位羧基酰胺化侧链上末端引入苯丙氨酸合成衍生物，PTP1B酶的抑制活性试验中呈现良好的活性，生物活性大约一高了10倍。同时研究发现，熊果酸与该衍生物均能抑制T细胞蛋白质酪氨酸磷酸酶和Src同源磷酸酶-2，它可能为治疗糖尿病和肥胖提供研究基础（Zhang W et al，2006）。为了更深入研究熊果酸类化合物构效关系，蔡伶俐以天然熊果酸为先导化合物，对其3位、28位进行结构修饰，研究结果表明，C-3位羟基乙酰化和C-28位同时连有氨基醇或环己胺的衍生物抗肿瘤活性均高于熊果酸（蔡伶俐，2009）。综上所述，对熊果酸化学结构修饰可以提高生物活性，目前对熊果酸的化学结构修饰和生物活性研究虽已取得了较大的进展，但是还未获得理想的衍生物，需要进一步的研究探索。由于熊果酸的生物活性广泛，在今后的研究中，应该对化学结构修饰的衍生物进行多种活性筛选，确保药理实验的精确性和合理性。随着科学研究的深入，对熊果酸的有效结构与必需的活性官能团、有利取代位、取代基研究也逐渐清晰，进一步阐明衍生物的构效关系，为深入的研究奠定了良好的基础。熊果酸存在于多科植物中，具有广泛的生物学效应。为了寻找高效、低毒的熊果酸衍生物，弄清其在生物体内的作用机制，进一步对熊果酸进行结构修饰和构效关系方面的探索依然是一项有价值和前景的研究工作（郑开波等，2009）。1.2 微生物转化技术以及微生物催化萜类化合物的应用生物转化(biotransformation)，亦称为生物催化(biocatalysis)，是指利用生物体系(包括真菌、细菌，植物离体培养细胞、组织或器官和动物细胞等)或其产生的酶制剂(cell free enzymes)对外源性化合物进行结构修饰的生物化学过程。今年来，随着基因工程、细胞工程、酶工程技术的不断发展和完善，使该项技术广泛用于天然化合物的转化、光学活性化合物的拆分和药物代谢研究等诸多领域。人们利用生物体系转化外源性化合物，大多是利用了生物体系的水解、糖基化、羟基化作用等。自20世纪后半叶以来化学家和药物学家努力用有机合成方法对萜类化合物进行结构改造以降低毒性、提高药效，确实取得了一定的成绩。但由于化学反应对结构区域选择性和立体构型选择性差，尤其对光学立体异构体选择性更差，加上化学反应条件一般都需要加热和较低或较高的pH作用条件，不少反应还需要加压，如此反应条件易引起有效母核的破裂或重排，因此除少数的萜类化合物外，应用化学法合成、改造或修饰三萜或四萜等结构复杂的化合物的困难是很大的。近三十年来酶工程和生物催化技术的迅速发展，并向各个学科渗透，应用微生物转化技术对萜类化合物的分子结构进行修饰和改造的研究也逐步展开。微生物转化的本质是利用微生物本身所产生的酶对外源化合物进行的催化反应，进行结构修饰而获得有价值产物的代谢反应。利用生物的酶对特定底物进行结构修饰的化学反应，与化学合成法相比，具有区域和立体选择性强、反应条件温和、操作简单、成本较低、公害少等优点，同时能完成一些化学方法难以实现的反应（沈珈琦，2006）。1.2.1 微生物催化萜类化合物的生物转化反应现代生物转化研究一般认为始于巴斯德时代，但工业化生物转化最重要的里程碑应该是20世纪50年代利用微生物对甾体化合物的结构改造：Peterson等人利用黑根霉(Rhizopus nigricans)中的羟化酶高产率地在孕酮分子中引入11-OH，这个生物酶促特异性转化反应为甾体药物的大规模合成奠定了基础（徐诗伟，1996；Mahato et al，1997；徐任生，1997）。目前生物转化已经发展成为天然产物化学的重要组成部分，一些重要的天然产物如生物碱类（Lister et al，1999；Rathbone et al，2002）、单萜类（Hylemon PB，1998；Demytt Enaerl JCR，1996）、倍半萜（Collins et al，2002；Collins et al，2001）、二萜类（Fraga et al，2001；Fraga et al，1981）、黄酮类（Hylemon PB，1998；Zhang et al，2005）化合物的生物转化报道较多。五环三萜(pentacyclic triterpene)是一类重要的天然活性物质，结构复杂，分布广泛，利用传统的有机催化的方式对该类化合物的非化学活泼位点进行结构修饰非常困难。生物转化具有区域选择性(region-selectivity)高、立体选择性(stereo-selectivity)强和反应类型众多等特点，对该类化合物进行结构修饰可以获得结构新颖的衍生物，进而可以为新药研发提供更具价值的先导化合物（张东明等，2002）。由于体内肠道菌群对药物的代谢也属于生物转化的范畴，因此，研究五环三萜类化合物的生物转化还可以辅助探索该类化合物在体内代谢和发挥药理活性的物质基础（严梅桢，2001）。1.2.2 熊果酸及其衍生物的生物转化乌苏烷(ursane)型，又称-香树脂烷(-amyrane)型，此类化合物大多是熊果酸的衍生物，余伯阳等人研究Nocardia sp对熊果酸(ursolic acid)和quinovic acid 3-O-quinovoside的生物转化时发现该菌株可以将乌苏烷型的五环三萜转化为齐墩果烷型的五环三萜。在乌苏烷类化合物的生源合成途径中，齐墩果烷型的五环三萜是通过碳正离子重排形成乌苏烷型五环三萜（姚新生，2002），该研究首次发现了微生物体系所催化的乌苏烷型向齐墩果烷型转变的反应类型，对于研究该类化合物的合成转变具有重要的意义（Cheng ZH，2004）。Collin等人利用Mucor plumbers ATCC 4740转化熊果酸甲酯(ursolic acid methyl ester)得到了1个转化产物methyl 3，7，21-trihydroxyursa-9，12-dien-28-oate，但在同样的条件下，熊果醇(uvaol)却不能发生转化反应，由此可见生物转化反应对底物的结构有较高的选择性（Collins DO，2002）。熊果酸的同分异构体齐墩果酸在Nocardia sp的作用下可以转化生成齐墩果酸甲酯(oleanolic acid methyl ester)（张剑等，2004）。由于五环三萜类化合物具有抗菌活性，C-27或C-28位具有游离羧基的化合物活性更强，在该反应中，微生物可能通过酯化反应来降低底物的溶解性，从而减少底物对微生物生长的抑制。王晋宇、沈珈琦（王晋宇等，2006）等利用赭曲霉对齐墩果酸进行羟基化成功得到11位羟基化齐墩果酸。1.2.3 可催化萜类化合物生物转化的酶源菌株在微生物转化过程中，生物催化剂的筛选和应用是关键，在众多的生物催化剂中，真核细菌是迄今为止在复杂化合物转化修饰中最常用的微生物（Stahl JD，1998；Field JA，1993），其丰富的细胞色素P450酶系由于“底物血红素囊”关键氨基酸残基的不同造成结构上的可塑性使之可与多种底物结合，成为自然界中最具催化作用的生物催化剂。新月弯孢霉、匍枝根霉、黑曲霉、赭曲霉等一系列真核细菌因其发达的P450酶系而具有很强的生物转化能力，常常被用来进行萜类化合物的生物转化。微生物转化的效果不仅取决于菌株的催化性能，还受到转化体系和环境条件的制约。微生物的酶催化转化过程通常分为两个阶段，第一阶段是菌株细胞的培养和生物催化剂的产生，第二阶段是利用所产生的生物催化剂进行酶催化转化。这两个阶段可以在同一体系中连续进行，也可以分成两个独立的阶段，分别在不同体系中进行，从而衍生出多种转化方式和转化工艺（王敏等，2000；徐诗伟等，2000；Coon et al，1996）。在菌株细胞的培养和生物催化剂的产生阶段，要控制适宜的生长温度、pH值等，保证最佳接种量，以促进菌体产生的酶的活力和产量提高，最大程度的提高发酵产物的含量。2 材料与方法2.1 实验材料与工具2.1.1 实验菌种和培养基实验菌种：金龟子绿僵菌1（购自上海中科院研究所）。固体培养基PDA（g/L）：土豆200、葡萄糖20、琼脂20，pH自然。液体培养基PDA（g/L）：土豆200、葡萄糖20，pH自然。优化液体培养基PDA（g/L）：土豆200、葡萄糖20、玉米浆20、酵母膏3、K2HPO4 1.5，pH6.5。2.1.2 仪器与设备表1 仪器设备使用表仪器厂家AL104电子天平梅特勒-托利多R204B3型旋转蒸发器上海申生科技SH-D真空泵河南予华仪器有限公司UV3010紫外可见分光光谱仪日立集团Diamonsil C18色谱柱迪马公司高效液相色谱仪LC-10ATVP plusWaters公司LC-8A制备高效液相色谱仪岛津公司全自动高压蒸汽灭菌锅上海申安医疗器械厂FD-1型冷冻干燥机北京博医康技术公司DELTA320 pH计梅特勒-托利多仪器有限责任公司SW-CJ-IG单人净化工作台苏州净化DL-5-B低速离心机上海安亭科学仪器厂DHG-970电热恒温鼓风干燥箱上海齐欣科学仪器有限公司玻璃层析柱上海精科实业有限公司IC402生化培养箱YAMATOHZQ-C恒温振荡器常州澳华仪器有限公司回流蒸发装置自己安装MiLLi-Q Synthesis超纯水发生器miLLipore移液器eppedorfKQ-500B型超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司高速中药粉碎机瑞安市环球药械厂2.1.3 实验试剂表2 试剂表试剂规格纯度厂家无水乙醇分析纯天津富宇精细化工乙酸乙酯分析纯天津富宇精细化工冰醋酸分析纯上海润捷化学试剂氨水分析纯广州化学试剂厂甲醇吐温80乙腈次氯酸钠环己烷浓硫酸超纯水色谱纯分析纯色谱纯分析纯分析纯分析纯分析纯天津大茂/Fisher天津市大茂化学试剂厂Fisher公司广东光华化学厂有限公司天津市富宇精细试剂有限公司天津富宇精细化工超纯水机制备G254硅胶薄层板青岛海洋化工厂2.2 实验方法2.2.1 基础实验方法2.2.1.1 薄层色谱分析法硅胶G板，105活化30min，备用。精密称取熊果酸标准品，用甲醇配制成每1mg/mL的溶液。吸取标准品溶液约10mL采用手动点样，点于同一薄层板上，以环己烷:乙酸乙酯:乙酸（体积比4:1.5:3滴）为展开剂，上行展开8cm，取出晾干，分别喷以10%的硫酸乙醇溶液；105烘烤5min，观察结果。2.2.1.2 反相高效液相色谱法标准对照品溶液的配制：分别用千分之一天平准确称取10.0mg熊果酸对照品，置于25.0mL棕色容量瓶中，以甲醇超声溶解并定容后备用，若溶解太慢或不完全，可适当加热使之快速充分溶解。反向液相色谱条件：柱温32，流动相为乙睛:水(V:V)为85:15，检测波长为210nm，流速为1.0mL/min，进样方式为手动进样，进样量为10L。2.2.2 菌种的保藏与扩增金龟子绿僵菌菌株培养5-7天后取得孢子，将孢子置于砂土管中冰箱内4保藏，并且每3个月用新鲜的斜面及平板培养基活化一次。孢子用茄子瓶PDA斜面培养基28下进行扩增培养。2.2.3 菌落观察在PDA平板上培养至出现孢子后观察菌落形态和颜色，并在生物显微镜下制片镜检观察其的特征。2.2.4 培养基的选择2.2.4.1 转化培养基中碳源种类及适宜浓度的确定分别以20g/L的葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、可溶性淀粉作为唯一碳源，其他条件皆同（其余培养基成分参照液体PDA培养基）。将金龟子绿僵菌的孢子悬浮液按5接种量接入发酵培养基中(100mLPDA液体培养基/250mL摇瓶)，在28以180r/min振荡培养48h后菌体进入成熟期。加入熊果酸吐温80溶液2mL（70mg熊果酸，7ml蒸馏水，0.5ml吐温80超声混匀），继续摇床培养60h。比较最终熊果酸的转化率，选择最优碳源。单纯改变最优碳源的浓度，其他条件不变的情况下，进行最优碳源的浓度对转化影响的单因素实验，得到最终熊果酸转化率，通过比较选择最佳浓度。2.2.4.2转化培养基中主要氮源种类及适宜浓度的确定分别以25g/L的牛肉膏、蛋白胨、玉米浆、黄豆粉作为唯一氮源，其他条件皆同（其余培养基成分参照液体PDA培养基）。将金龟子绿僵菌的孢子悬浮液按5接种量接入发酵培养基中(100mLPDA液体培养基/250mL摇瓶)，在28以180r/min振荡培养48h后菌体进入成熟期。加入熊果酸吐温80溶液2mL（70mg熊果酸，7ml蒸馏水，0.5ml吐温80超声混匀），继续摇床培养60h。比较最终熊果酸的转化率，选择最优氮源。单纯改变最优氮源的浓度，其他条件不变的情况下，进行最优氮源的浓度对转化影响的单因素实验，得到最终熊果酸转化率，通过比较选择最佳浓度。2.2.4.3 转化培养基中辅助氮源适宜浓度的确定虽然酵母膏也属于蛋白质氮源，但是还含有丰富的维生素和无机盐，对于细胞的生长和代谢有非常重要的作用，因此将酵母膏当做辅助氮源以为绿僵菌提供各种生长因子。分别以0g/L、1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L浓度的酵母膏为辅助氮源，其他条件皆同（其余培养基成分参照液体PDA培养基）。将金龟子绿僵菌的孢子悬浮液按5接种量接入发酵培养基中(100mLPDA液体培养基/250mL摇瓶)，在28以180r/min振荡培养48h后菌体进入成熟期。加入熊果酸吐温80溶液2mL（70mg熊果酸，7ml蒸馏水，0.5ml吐温80超声混匀），继续摇床培养60h。比较最终熊果酸的转化率，选择辅助氮源最适宜浓度。2.2.4.4 适宜碳氮源组成的优化实验以得到的最优碳源、氮源、辅助氮源进行正交设计进一步优化，取最适宜浓度以及前后两个测试浓度作为水平测试。2.2.4.5 无机盐K2HPO4适宜浓度的选择在优化的培养基中添加0.5g/L、1.0g/L、1.5g/L、2.0g/L和2.5g/L的K2HPO4，单独考察K2HPO4对转化的影响，并选择最适浓度。2.2.5 孢子悬浮液的配制将斜面培养基的菌株在无菌操作条件下接种到事先灭过菌的三角瓶中，配成107个/mL的孢子悬浮液(血球计数板计数)。如该孢子悬浮液未达预期浓度，继续接种孢子，如该孢子悬浮液高于预期浓度，则可加入适量的无菌水来稀释。孢子悬浮液可在4冰箱中保存1个月以上活性不变，使用时间最好不超过1个月。2.2.6 菌株培养与熊果酸的转化将金龟子绿僵菌的孢子悬浮液按5接种量接入发酵培养基中(100mLPDA液体培养基/250mL摇瓶)，在28以180r/min振荡培养48h后菌体进入成熟期。加入熊果酸吐温80溶液2mL（70mg熊果酸，7ml蒸馏水，0.5ml吐温80超声混匀），继续摇床培养60h。2.2.7 发酵产物粗品的提取与检测对反应后的产物碾碎后用2倍发酵液体积的乙酸乙酯提取，超声提取30分钟，乙酸乙酯层旋转蒸发器中蒸干得到含有转化产物的粗品结晶，粗品结晶用甲醇溶解。用TLC法检测，流动相条件为环己烷:乙酸乙酯:乙酸为4:1.5:2滴，显色剂为10%硫酸乙醇溶液。2.2.8 转化产物在发酵体系中的分配测定酶催化转化结束后，首先将转化体系减压过滤，固液分离以得到菌丝体和滤液。由于酶转化时间较长，不可避免会出现菌丝体自溶现象，以致滤液中会有残留的菌丝体碎片，因此还需要对滤液进行离心。菌丝体用研钵碾碎后用3倍转化液体积的乙酸乙酯于常温下提取搅拌1h后，其有机相在旋转蒸发器中蒸干得到含有转化产物的粗品结晶。滤液离心物用等转化液体积的乙酸乙酯进行提取，有机相处理方法重复以上步骤。滤液用等量的乙酸乙酯萃取后静置30min分层，弃去水相，有机相处理重复以上步骤。粗品分别用甲醇溶解，用TLC法进行分析，实验条件同2.2.1.1中实验条件。2.2.9 转化产物的分离与检测对发酵产物进行正相硅胶柱分离，选取100-200目的硅胶于105恒温活化30min，用洗脱剂浸泡过夜，匀浆湿法装柱，用洗脱剂以一定流速淋洗色谱柱使之达到平衡状态，按50:1（硅胶：样品）体积上样，洗脱剂为环己烷：乙酸乙酯：乙酸，先后按8:1:2滴，6:1:2滴和4:1:2滴进行柱层析，用试管收集洗脱液，每管10mL，利用薄层层析法跟踪监测含有转化产物的试管，把相同的含有转化产物的试管合并，挥干溶剂后继续进制备液相纯化，得到纯的转化产物。对纯的转化产物进行液相检测以及1H NMR和13C NMR经BRUCKER AV400型核磁共振仪进行分子结构表征，并通过ESI-MS确定它的分子量。2.2.10 金龟子绿僵菌自身代谢产物与加入熊果酸后代谢产物的比较按2.2.6中的转化方法可得到加熊果酸后的代谢产物，金龟子绿僵菌的自身代谢产物即在相同的外界条件下培养，与2.2.6中转化方法不同的是，反应过程中不加入熊果酸吐温溶液，按照相同的处理方法得到金龟子绿僵菌的自身代谢产物。然后通过液相检测对比两结果，实验条件同2.2.1.1中实验条件。3 实验结果3.1 金龟子绿僵菌菌落与孢子观察结果金龟子绿僵菌在PDA平板上28下培养三天后，在PDA培养基上菌落呈薄棉状，严实，暗绿色，表面凹凸不平，培养时间长后，在暗绿色菌落表面生长出粒状或者片状稠密白色绒毛。绿色菌落在显微镜下观察为扁长的孢子，透明，单胞，数目多。白色绒毛在显微镜下观察为菌丝分支，有隔，无色光滑。3.2 适宜斜面培养时间的确定霉菌孢子是一个独立的遗传体，遗传物质比较完整，因此孢子用于传代和保存均能保持原始菌种的基本特征。斜面孢子28恒温培养5-7d，孢子完全成熟，此时显微镜下可见到大量丰满成熟的孢子，从外观看斜面呈暗绿色，孢子完全覆盖斜面。如果继续培养，菌落开始有褶皱，在暗绿色菌落表面生长出粒状或者片状稠密白色绒毛，过于衰老的孢子会影响酶催化能力。因此，斜面孢子的培养时间确定为5-7d。3.3 转化反应产物在体系中的分配情况酶转化结束后，对发酵液进行处理后，TLC检测结果如图2所示：1 2 3 4 图2 转化产物在转化体系中的分配情况（1）熊果酸原料样；（2）上清液；（3）滤液离心沉淀；（4）菌丝体从图中可以看出，熊果酸衍生物主要位于菌丝体内部或者吸附于菌丝体表面，而在上清液中分布得较少。由于目的产物的含量太少会导致提取分离十分困难，又考虑到萃取需要耗费较为昂贵的乙酸乙酯，因此对上清液中的产物可忽略不计，可以采取菌丝体与滤液离心沉淀物合并后再进行提取的方法。3.4 培养基的选择培养基方案设计不仅要满足微生物菌体生长的营养需要，而且要满足产生高活性羟化酶的基质需要。在选择发酵培养基时，考察的指标是培养的菌体对底物的转化能力的高效、稳定。3.4.1 转化培养基中碳源种类的确定培养基中的碳源是主要的营养成分之一，是菌体生命活动所需能力的主要来源。改变转化培养基中的碳源种类，分别以20g/L的葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、可溶性淀粉作为碳源进行转化实验。实验结果如图3所示。由图可知，金龟子绿僵菌利用以上碳源转化底物时，转化率由高到低依次是葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、可溶性淀粉。可见，葡萄糖是该菌株的最佳碳源。葡萄糖是最易被微生物利用的碳源，可加速微生物的生长。除此之外，在微生物酶催化羟基化的过程需要NADPH的参与，而菌体在消耗葡萄糖的过程中正好能提供充足的NADPH。因此葡萄糖最有利于金龟子绿僵菌的生长和底物的转化。图3 不同碳源对熊果酸转化的影响3.4.2 初始葡萄糖浓度对转化的影响单纯改变葡萄糖的浓度，其他条件不变的情况下，进行葡萄糖浓度对转化影响的单因素实验，结果如图4。图4 葡萄糖浓度对熊果酸转化的影响从图可看出，葡萄糖浓度为20g/L时，熊果酸的转化率最高，当葡萄糖浓度继续增高时，转化率下降。葡萄糖作为菌体最依赖的碳源，其浓度的高低与菌体生长和酶催化反应有密切的关系。葡萄糖代谢主要为NADPH的再生服务并由此间接调节酶活力。葡萄糖缺乏引起的碳源不足将使菌体生长受到限制，使羟化作用停止。葡萄糖浓度过高时，由于渗透压过大，不利于提高氧的传递速度，对菌体生长不利，酶合成也会受到阻遏，阻碍转化反应的进行。3.4.3 转化培养基中主要氮源种类的确定氮源是构成菌体细胞蛋白和核酸的物质来源。酶的本质是蛋白质，因此酶的合成需要氮源，尤其对于生物转化过程中的酶，合适并足量的氮源是必不可少的。因此，本实验主要考察质量浓度均为25g/L蛋白胨、玉米浆、牛肉膏、黄豆粉进行转化实验，结果如图5。图5 不同氮源对熊果酸转化的影响从图可看出，氮源为玉米浆时转化率最高。这是因为玉米浆为速效氮源物质，主要以较易吸收的蛋白质降解产物形式存在，而降解产物特别是氨基酸可以通过转氨作用直接被机体利用，而黄豆粉中的氮主要以大分子蛋白质形式存在，需要进一步降解成小分子的肽和氨基酸后才能被微生物吸收利用。因此，玉米浆有利于菌体的生长，提高菌丝体浓度，从而增加了酶的含量。3.4.4 初始玉米浆浓度对转化的影响在保证其他组分不变的条件下，考察不同玉米浆浓度对转化的影响，结果如图6所示。图6 玉米浆浓度对熊果酸转化的影响由图可看出，玉米浆少于20g/L时对菌体生长有明显不利影响。而丰富的氮源可以提高转化率，且当玉米浆达到25g/L时，熊果酸的转化率最高。3.4.5 初始酵母膏浓度对转化的影响虽然酵母膏属于蛋白质类氮源，但是其含有丰富的维生素和无机盐，对于细胞的生长和代谢有非常重要的作用，因此需把酵母膏当做辅助氮源。本实验中单独考察了酵母膏对转化的作用，结果如图7。图7 酵母膏浓度对熊果酸转化的影响图7表明，酵母膏在生长和转化的过程中起了重要的作用，培养基中无酵母膏时，转化率最低。当酵母膏浓度达到了3g/L时，转化率能维持较高水平。3.4.6 适宜碳氮源组成的优化实验发酵培养基各组分之间有一定的内在联系，各种最优单因素的组合并不一定能获得最佳的发酵结果，因此需进行正交设计进一步优化，以确定最佳培养基配方。根据单因素实验结果，主要考察葡萄糖、玉米浆、酵母膏三个因素，考虑的因素及其水平见表3。根据因素和水平，采用正交表L9（34）进行了9组实验，结果见表4。表3 培养基正交实验的因素及水平水平因素/（g/L）葡萄糖（A）玉米浆(B)酵母膏(C)空白列(D)118222.50220253.00322283.50表4 培养基正交实验结果序号葡萄糖/（g/L）玉米浆/（g/L）酵母膏/（g/L）空白列转化率/%标准偏差118222.5011.450.035218253.5011.910.047318283.0012.260.032420223.5012.080.051520253.0012.480.044620282.5011.880.038722223.0012.080.047822252.5011.780.053922283.5011.860.063运用统计软件SPSS对正交实验结果进行分析，结果如表5所示。表5 培养基单因素统计MeanStd.Error95%Confidence IntervalLower BoundUpper Bound葡萄糖（A）111.8730.05711.62612.120212.1470.05711.90012.394311.9070.05711.66012.154玉米浆（B）111.8700.05711.62312.117212.0570.05711.81012.304312.0000.05711.75312.247酵母膏(C)111.7030.05