FISH技术的探针要求必须具有较好的特异性.doc

F ISH 技术的探针要求必须具有较好的特异性、灵敏性和良好的组织渗透性。根据需要合成的 DNA或 RNA寡核苷酸探针可识别靶序列内一个碱基的变化, 能够用酶学或化学方法进行非放射性标记。F ISH 技术不仅能提供静止的实验结果, 还可以动态地观察流动水体中的微生物种群变化, 因此 FISH 技术被用于监测环境中微生物在时间或空间上的动态变化, 以帮助人们理解环境中微生物种群的组成和生长动力学。FISH 的首次应用是在 1980 年，Bauman 1等用荧光染料直接标记探针 RNA 的 3端，检测到了特异的 DNA，1988 年 Giovnanoni 2等将 FISH 技术引进到了细菌学，他第一次用放射性同位素标记已知的 rRNA 寡核苷酸探针进行细菌的显微镜观察，随后该技术在系统发育微生物学、微生物生态学、微生物的诊断和周围环境的研究中得到了迅速的发展。目前在单一样品 ( 如纯培养菌种) 检测中的应用已十分普遍，准确度较高3，4，但在复杂样品( 如活性污泥) 检测中的应用仍不成熟，易受到样品中所含杂质的影响，出现假阳性或假阴性信号5。本文采用细菌通用探针 EUB338，结合 DAPI全细胞染色技术，探讨了针对活性污泥样品的荧光原位杂交实验方法，并对自发荧光和真实信号的辨别要点进行了讨论。7 Bauman J G J ，Wiegant J ，Van Duijn P . Cytochemical hybridization with fluorochromelabeled RNA. . Increased sensitivity by the use of anti-fluorescein antibodiesJ. Histochemistry，1981，73（4）: 181-1938 Giovannoni S J ，DeLong E F ，Olsen G J ，Pace N R . Phylogenetic group-specific oligodeoxynucleotide Probes for identification of single microbial cellsJ. Bacteriol，1988，170（21）: 720-726.3 万春黎 . 同步脱氮脱硫工艺生物强化及种群动态分析初探M. 哈尔滨:哈尔滨工业大学，2006.123-1274 任艳红 . 降解五氯酚厌氧生物反应器微生物种群结构的分子特性研究M. 浙江: 浙江大学，2004.342-1455 王明义，袁晓燕，宋雪珍，等 . 荧光原位杂交法在检测硫酸盐还原菌中的应用J.中国现代医学杂志，2008，18( 3) :302-304.荧光原位杂交技术结合分子生物学的精确性和显微镜的可视性, 可进行微生物的空间分布情况分析和特征性微生物的鉴定与定量分析。1989年, DeLong首次将荧光标记寡核苷酸探针应用于检测单个微生物细胞 3, 开创了应用于微生物生态学的先河。由于该法操作容易、安全、检测迅速, 目前已广泛应用于环境微生物生态学 4, 5和食品学 6等领域, 成为研究微生物群落最具生命力的技术之一。 1 Choi B. K . , Past er B. J . , D ew hi rst F. E . , 等 . Diversity of cultivable and uncultivable oral spirochetes f rom a patient with severe destructive periodontitis J . Inf ect . Immun . ,1994, 62( 5) : 1 889-1 895. 2 Wagner M . , A m ann R. , Lem mer H . , et a l . Probing activated sludge with proteobact eria- specific oligonucl eotides :in adequacy of culture-dependent methods for describing microbial community structure J . A ppl. Environ. Microbiol. , 1993, 59( 5) : 1 520-1 525. 3 D eLong E. F. , Wickham G . S. , Pace N . R. . Phyl ogenetic stains : ribosomal RNA based probes for the identif ication of single microbial cells J . Science, 1989, 243( 4896 ) :5554-5563. 4 Call i B. , M ertoglu B. , Inanc B. , et al . Methanogenic diversity in anaerobic bioreactors under extremely high ammonia levels J . Enzyme and Microbial . Technol. , 2005,37( 4) : 448-455. 5 Icgen B. , H arrison S. . Exposure to sulfide causes populations shift s in sulfate-reducing consortia J . Res. in M icrobiology, 2006, 157( 8) : 784-791. 6 Ercolini D . , H ill P. J. , D odd C. E. R. . D evelopment of aflu or escence in situ hybridization method for cheese using a 16S rRNA probe J . M icrobiol. Methods, 2003, 52( 2 ) :267-271. 7 Zwirglmaier K . , Ludwig W . , Schleifer K. H . , et al . Recognition of individual genes in a single bacterial cell by fluorescence in situ hybridiz ation- RIN G-FISH J . Molecular Microbiology, 2004, 51( 1) : 89-96.Simon Nathalie25 等在2002年利用FISH技术研究海水中细菌和有害藻类种群之间的相互作用;Araya Ruben26等在2003年对溪流中和水中生物膜上的微生物群落进行了FISH研究。Mcnamara Christopher J27等利用FISH技术对美国卡罗莱纳州南部溪流沉积物中可培养和不可培养的细菌群落进行了分析。应用FISH技术不仅能研究微生物群落结构的特征,还可以跟踪微生物种群的动态变化。Liu J28等在2002年利用FISH技术监测了河流中微生物群落的动态变化,并利用此技术得到了一些在人工条件下很难培养的菌种以及一些新的微生物信息。FISH技术也被用于监测环境中的微生物群落动态,如季节变化对高山湖水微生物群落的影响、原生动物的摄食对浮游生物组成的影响等。此外,我们不仅可以更准确地了解不同环境下微生物群落中各种功能菌群的组成比例,而且对不同功能菌群的相互作用有了更直观的认识。研究表明,自然界中在空间上聚集在一起的不同微生物类群大都在代谢上互惠互利28 。总之,FISH技术在国内外环境微生物监测中已得到较为广泛的应用,技术水平日趋成熟。 25 Simon Nathalie ,Biegala Isabelle C. Kinetics of attachment of potentially toxic teria to Alexandrium tamarense J . Aquatic Microbial Ecology ,2002 ,28 :249 - 258. 26 Araya Ruben , Tani Katsuji , Takagi Tatsuya. Bacterial activity and community composition instream ater and biofilm from friver determined by fluorescent in situ hybridization and DGGE analysisJ . FEMS Microbiology Ecology , 2003 ,43 :111 - 119. 27 Mc Namara Christopher J , Lemke Michael J , Leff Laura G. Culturable and nonculturable fractions of bacterial populations in sediments of a South Carolina streamJ . Hydrobiologia ,2002 ,482 :151 - 159. 28 Liu J , Leff L G. Temporal changes in the bacterioplankton of ar Northeast Ohio (USA) RiverJ . Hydrobiologia ,2002 ,489 :151 - 159.近几年来,分子生物学技术和现代分析技术快速地 向环境工程领域渗透,为废水处理系统中的微生物 生态结构和功 能解析提供了强大的技术支持1。目前,应用于污水处理系统中微生物生态群落解析的主要技术:16s和23S rDNA分子克隆技术、荧光原位杂交技术 、变性梯度凝胶电泳技术、温度梯度凝胶电泳技术、微生物呼吸醒分析技术以及微电极探测技术等。这些技术在环境中的应用大大促进了微生物生态分析技术的发展,并将推动对环境工程的机理和调控研究。1Wilderer P,Bungartz H J,Lemmer H,Wagner M,Keller J,Wuertz S.Modern scientific methods and their potential in wastewater science and technologyJ.Water Res,2002,36(12):370-393F ISH技术不仅提供静止的实验结果,还可以动态地观察流动水体中的微生物种群变化,可以检测季节更替对高山湖泊中微生物群落的影响。Liu J , Leff L G在2002年利用此技术监测了河流中微生物群落的动态变化5 。利用F ISH技术得到了一些在人工条件下很难培养的菌种以及一些新的菌种信息。Girgu s P R , Delong E F在2002年用厌氧富集的方法从深海沉积物中培养到一些古菌,随后使用F ISH技术对这些古菌进行了鉴定6 。Mcnamara Christopher J , Lemke Michael J , L ff Laura G利用F SH技术对美国卡罗莱纳州南部溪流沉积物中可培养和不可培养的细菌群落进行了分析7 。所有这些研究对于人们理解环境中微生物种群的组成和动力学都有极大的重要性. 5 Liu J , Leff L G, Tem poral changes in the bacteriop lank ton of a Northeast Ohio (USA ) River, Hydrobiologia, 2002, 489: 151159. 6 Girguis P R , D elong E F, Anaerobic enichment of methane-oxidizing archaeal bacterial consortia in deep-sea marine sediments. Abstracts of the General Meeting of the American Society for M icrobiology , 2002, 102: 327. 7 Mcamara Christopher J , Lemke Michael J , Leff Laura G. Culturable and non-cultu rable fractions of bacterial populations in sediments of a South Carolina stream , Hydrobiologia, 2002, 482: 151159.上世纪 80 年代末至 90 年代以来, 分子生物学技术开始被广泛应用于微生物群落结构分析, 且发展迅速, 研究的焦点集中在具有保守序列的 16SrRNA 上。研究方法包括分子杂交法、PCR 法、SSCP 法、DGGE 法、TGGE 法、RFLP 法、ERIC- PCR 法和克隆基因文库分析法等,具有很高的灵敏性, 与传统的培养方法或其它不依赖培养技术的方法相比显示出明显的优越性, 推动了微生物群落结构研究的快速发展。但是, 这些基于PCR 的方法可能会在扩增反应中引入误差, 降低所得信息的精确度。荧光原位杂交(FISH)作为一种不依赖 PCR 的分子分析技术是以上各种分子标记技术的有益补充, 它结合了分子生物学的精确性和显微镜的可视性信息, 可以在自然或人工的微生物环境中监测和鉴定不同的微生物个体, 同时对微生物群落进行评价。目前, FISH 技术广泛应用于微生物分子生态学和环境微生物物学中, 已成为微生物群落研究的重要技术手段, 对环境中复杂的混合微生物群落进行及时监控和准确鉴定也变得越来越重要, 为污染治理和防治提供了新的思路和方法。1 荧光原位杂交技术的发展1969 年, Pardue 等2和 John3两个研究小组开发了原位杂交技术, 用放射性同位素标记的 DNA 或28S rRNA 与爪蟾卵细胞制备物进行杂交, 进行显微放射自显影检测。这一技术可以在保持细胞形态完整的条件下, 检测出细胞核酸序列, 自此, 原位杂交技术在染色体进化、肿瘤病人和白血病人的染色体分析以及多种细胞遗传学研究方面得到应用。1988年, Giovannoni 等4首次将 FISH 技术引入细菌学研究中, 使用放射性标记 rRNA 寡核苷酸探针检测微生物。随着荧光标记的发展, 非同位素染料逐渐代替了放射性标记。1989 年, Delong5首次使用荧光标记寡核苷酸探针检测单个微生物细胞。与放射性探针相比, 荧光探针更安全, 具有较好的分辨力, 不需要额外的检测步骤。此外, 可用不同激发和散