南京大学 分子生物学 课件 ppt 13讲

Nanjing University 分子生物学 授课教师：张敏跃 办公室：分子楼4 楼 电话：3595108 Nanjing University 第一章 绪 论 Nanjing University 第一节 分子生物学发展的基础 一、创世说和进化论 （一）三个与一切生物学现象有关的 问题： 生命是怎样起源的？ 为什么“有其父必有其子”？ 动、植物个体是怎样从一个受精卵发育而 来的？ Nanjing University （二）创世说 上帝创造了世间万物，包括人类。 （三）达尔文学说 1859年达尔文发表了著名的物种起 源一书，提出了进化论学说。其进化 论思想的精髓可概括为“物竞天择，适 者生存”几个字。他认为世界上的一切 生物都是可变的，物种的变异是由于大 自然的环境和生物群体的生存竞争造成 的。 Nanjing University 二、细胞学说的建立 十七世纪末十八世纪初，荷兰的 Leeuwenhoek制作了世界上 第一台显微镜，并观察了诸多生 物样本。 大约与其同时代的Hooke第一 个提出“细胞”一词。 Nanjing University 十九世纪，德国植物学家 Schleiden和动物学家 Schwann建立了细胞学说。 他们认为：所有组织的最基本 单元是形状非常相似而又高度 分化的细胞。细胞的发生和形 成是生物界普遍和永久的规律 。 Nanjing University 三、经典的生物化学和遗传学 进化论和细胞学说的结合，产生 了现代生物学。而以研究动、植 物遗传变异规律为目标的遗传学 和以分离纯化、鉴定细胞内含物 质为目标的生物化学则是这一学 科的两大支柱。 Nanjing University（一）经典的生物化学的成就 十九世纪，人们就已经发现了蛋白质 。到二十世纪初，组成蛋白质的20 种氨基酸被相继发现。Fisher还论证 了连接相邻氨基酸的“肽键”的形成。 细胞的其他成分，如脂类、糖类和核 酸也相继被认识和部分纯化。 Nanjing University 1869年，Misescher首 次从莱茵河鲑鱼精子中分离 到DNA。 1910年，德国科学家 Kossel首先分离得到了腺 嘌呤、胸腺嘧啶和组氨酸。 Nanjing University （二）经典遗传学的建立和发展 1865年，奥地利科学家孟德尔 （Gregor Mendel）发表了 植物杂交试验一书，提出了遗 传学的两条基本规律：统一律和 分离律。他认为：生物的每一种 性状都是由遗传因子控制的，这 些因子可以从亲代到子代，代代 相传。 Nanjing University 1909年，丹麦遗传学 家W. Johannsen首 先使用“基因”一词。 Nanjing University 二十世纪初，美国遗传 学家Morgan提出了基 因学说。他指出：种质 必须由独立的要素组成 ，我们把这些要素称为 遗传因子，或者简单地 称为基因。 Nanjing University Morgan及其助手发 现了连锁遗传规律， 并且第一次将代表某 一性状的基因，同某 一特定的染色体联系 起来。 Nanjing University 第二节 分子生物学发展简史 q分子生物学的定义： 是研究核酸、蛋白质等所 有生物大分子的形态、结 构特征及其重要性、规律 性和相互关系的科学。 Nanjing University 1928年英国科学家 Griffith等人发现肺炎链 球菌可以引起肺炎，导致 小鼠死亡。 1944年美国微生物学家 Avery通过肺炎链球菌对小 鼠的感染实验，证明DNA 是遗传信息的载体。 Nanjing University 1953年Watson和Crick提 出DNA右手双螺旋模型，于 1962年和Wilkins共享诺贝 尔生理医学奖。 同年，Sanger首次阐明了胰 岛素的一级结构，开创了蛋白 质序列分析的先河，他于 1958年获诺贝尔化学奖。 Nanjing University 1954年Crick提出遗传信 息传递的中心法则。 1958年，Meselson和 Stahl提出了DNA的半保留 复制。 Nanjing University 1961年，法国科学家Jacob和 Monod提出了调节基因表达的 操纵元（operon）模型， 1965年获得诺贝尔生理医学奖 。他们还首次提出了信使核糖酸 （mRNA）的存在及作用。 同年，Nirenberg等人应用合成 的mRNA分子poly(U)破译出 第一批遗传密码。 Nanjing University 1966年，美国科学家 Nirenberg等人破译了全部的 DNA遗传密码，1969年与 Holley和Khorana分享了诺 贝尔生理医学奖。 1967年发现了可将DNA连接 起来的DNA连接酶。 Nanjing University 1970年Smith、Qilcox及 Kelley分离到第一种可以在 DNA特定位点将DNA分子切 开的限制性核酸内切酶。同年 ，美国的Temin和Baltimore 发现RNA肿瘤病毒中存在逆转 录酶，他们于1975年共享诺贝 尔生理学奖。 Nanjing University 1972年，Berg、Boyer 等人第一次成功地完成了 DNA重组实验。 1974年，首次实现了异 源真核生物的基因在大肠 杆菌中的表达。 Nanjing University19751977年，美国人 Sanger和Gilbert发明了快 速DNA序列测定技术，并于 1977年完成了噬菌体X174 基因组（5386bp）的序列测 定。1980年Sanger和 Gilbert与Berg分享了诺贝尔 化学奖。 Nanjing University1982年Prusiner提出“感染 性蛋白质颗粒”的存在；次年 将这种蛋白颗粒命名为阮病毒 蛋白（prion protein, PrP ）。 1997年，Prusiner因 为发现朊病毒而获得诺贝尔生 理医学奖。 Nanjing University 1984年，德国人 Kohler、美国人 Milstein和丹麦科学 家Jern由于发展了单 克隆抗体技术而分享了 诺贝尔生理医学奖。 Nanjing University 1986年，Mullis发明 了PCR技术。1993年 Mullis与第一个设计定 点突变的Smith共享了 诺贝尔化学奖。 Nanjing University 1988年Waston出 任“人类基因组计划” 首席科学家，举世瞩 目的人类基因组测序 工作开始启动。 Nanjing University1993年，美国科学 家Roberts和Sharp 由于在不连续基因方 面的工作而获得诺贝 尔生理医学奖。 Nanjing University 1996年，酵母基因组 DNA的全部序列测定工 作完成。 2000年6月26日，人 类基因组工作框架图绘 制完成 Nanjing University 第三节 人类基因组计划 （Human Genome Project，HGP） Nanjing University 一、问题的提出 70年代对人类基因组的研究 已具有一定的雏形； 1986年著名遗传学家 Mckusick V提出从整个基 因组的层次研究遗传学的科 学称“基因组学”； Nanjing University 同年，诺贝尔奖获得者 Dulbecco R在Science杂 志上发表了题为“癌症研究的转 折点人类基因组的全序列 分析”，得到了世界范围的响应 ； 1986年美国能源部宣布实施 这一草案； Nanjing University1987年美国能源部 （DOE）和国家健康 研究院（NIH）为 HGP下拔了经费 1.66亿美元，开始筹 建HGP实验室； Nanjing University 1988美国成立了“ 国家人类基因组研 究中心”由诺贝尔奖 获得者Watson J 出任第一任主任。 Nanjing University 二、世界的行动 1987年，意大利的国家 研究委员会（NRC）组 织了15个（后来发展到 30个）实验室，开始 HGP的研究； 1989年2月，英国的 HGP开始启动; Nanjing University 1990年6月，法国的国家 HGP开始启动； 同月，欧共体通过了“欧洲 HGP研究计划”，主要资助 23个实验室； 1990年10月1日 美国国会 正式批准美国的“HGP”启动 ，计划在15年内投入至少30 亿美元进行人类全基因组的 分析； Nanjing University 1994年初，在吴旻、强伯勤 、陈竺院士和杨焕明教授的 倡导下，中国的HGP开始启 动； 1998国家科技部在上海成立 了中国南方基因中心，由陈 竺院士挂帅； 1998年1999年成立了中 国科学院北京人类基因组中 心和北方人类基因组中心， 由中科院遗传所的杨焕明教 授，强伯勤院士等人牵头； Nanjing University 1995年6月，德国正 式开始HGP。 Nanjing University 三、任务与进展 （一）遗传图谱（genetic map)： ，定义 又称连锁图谱（linkage map) 或遗传连锁图谱（genetic linkage map)，是指人类基因 组内基因以及专一的多态性DNA 标记(marker)相对位置的图谱， 其研究经历了从经典的遗传图谱 到现代遗传图谱的过程。 Nanjing University ，经典的遗传图谱（以基因 表型为标记） ，现代遗传图谱（以DNA为 标记） 第一代多态性标记：限制性片 段长度多态性（restriction fragment length polymorphism, RFLP)， 位点数目可达105以上。 Nanjing University 第二代多态性标记：小卫星/可变数 量串联重复（minisatellite / variable number tandem repeat, VNTR) 及微卫星/简短 串联重复（microsatellite / simple tandem repeat, STR) 。个数在6000个以上。 其中STR 具高度多态性，有的可形成几十种 等位片段，是目前在基因定位的研 究中应用最多的标记系统。 Nanjing University 第三代多态性标记：单 核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNP)。这种标记在人类 基因组中多达300万个 。 Nanjing University ，构建遗传图谱的基本原 理： 真核生物在减数分裂过程中 染色体进行重组和交换，染 色体上任意两点之间发生重 组和交换的概率随着两点之 间相对距离的远近而发生变 化。 Nanjing University ，构建遗传图谱的意义 ： 通过连锁分析，可以找到 某一致病基因或表型的基 因与某一标记邻近（即紧 密连锁）的证据，从而可 把这一基因定位于染色体 的特定区域，再对基因进 行分离和研究。 Nanjing University （二）物理图谱（physical map): ： ，定义 用物理学方法构建的由不同 的DNA结构按其在染色体 上的原始顺序和实际距离排 列的图谱。 Nanjing University ，内容 基因组的细胞遗传学图（ cytogenetic map，即 染色体的区、带、亚带） ； 序列标签位点 (sequence-tagged site, STS)图谱； Nanjing University DNA“重叠群(contig)”图 谱：把基因组文库中含有 相同STS序列的DNA克隆 按照其在原始基因组上线 形顺序进行排列，连接成 相互重叠的“片段重叠群 (contig)”。是构建物理图 谱的主要任务； Nanjing University 大片段限制性内切酶 切点图； cDNA/EST图谱； 基因组中广泛存在的 特征性序列（如CpG 序列、Alu序列等）的 标记图等。 Nanjing University （三）序列图谱： 2003年之前完成。 （四）基因图谱： 目标：在人类基因组中鉴 别出全部基因的位置、结 构和功能； Nanjing University定位方法：cDNA / EST的染色体定位（ 实验手段，电子杂交 ）； 完成时间：200？年 完成。 Nanjing University （五）模式生物基因组： 酵母 1996年 大肠肝菌 1997年 线虫 1999年 果蝇 2000年 拟南芥菜 2000年 小鼠 2005年之前完 成 Nanjing University 第四节 分子生物学的 研究内容 Nanjing University 一、 DNA重组技术（基因工程 ） （一）DNA重组技术的含义： 指在体外将核酸分子插入病 毒、质粒或其他载体分子， 构成遗传物质的新组合，并 将之导入到原先没有这类分 子的寄主细胞内，从而使接 受者产生新的遗传性状的技 术。 Nanjing University 关键技术：限制性内切酶 、DNA连接酶及其他工 具酶的发现和应用。 （二）DNA重组技术的建立 Nanjing University （三）DNA重组技术的应用 可用于大量生产某些在正常 细胞代谢中产量很低的多肽 ； 可用于定向改造某些生物基 因组结构 可用于基础研究 Nanjing University 二、 基因表达调控研究 生物个体在生长发育过程中， 基因表达是按一定的时序发生 变化（时序调节），并随着内 外环境的变化而不断加以修正 （环境调控）的。基因表达调 控研究的主要方面有： Nanjing University （一）信号转导（singnal transduction)研究 信号转导：指外部信号 通过细胞膜上的受体传到 细胞内部，并激发诸如离 子通透性、细胞形状或其 他细胞功能方面的应答过 程。 Nanjing University （二）转录因子研究 转录因子：是指一群能 与基因5端上游特定序列 专一结合，从而保证目的 基因以特定的强度在特定 的时间与空间表达的蛋白 质分子。 （三）RNA剪接研究 Nanjing University 三、 生物大分子结构功 能研究（又称结构分子生 物学） （一）概念： 是研究生物大分子特 定的空间结构及结构 的运动变化与其生物 学功能关系的科学。 Nanjing University （二）结构分子生物学的 研究方向： 结构测定； 结构运动变化规律； 结构与功能关系的建立 。 Nanjing University （三）结构分子生物学的 研究手段 物理和化学手段：射 线衍射的晶体学（蛋白 质晶体学）；二维和多 维核磁共振；电镜三维 重组、电子衍射、中子 衍射和各种频谱学方法 ；化学合成； 分子生物学手段 Nanjing University 第五节 分子生物学的展望 Nanjing University 对神经生物学的影响 对遗传学的影响 对分类和进化研究的影响 对发育生物学的影响 对现代医学的影响 其他 一、 分子生物学对生命科学 各个领域的渗透 Nanjing University 统一生物学（general biology)：生物学范畴 内所有学科在分子水 平上的统一。 Nanjing University 二、人类基因组计 划的延伸 人类后基因组（功 能基因组）研究 Nanjing University （一）蛋白质组（proteome ）和蛋白质组学（ proteomics) ，蛋白质组：由一个 细胞或一个组织的基 因组所表达的全部相 应的蛋白质。 ，蛋白质组的动态性 Nanjing University （1）原因： 同一个机体的不同组织和不同细胞 ； 在同一机体的不同发育阶段； 机体的生理状况； 机体所处的外界环境。 （2）结果： 基因mRNA表达种类的改变； 基因表达的不同形式（基因剪接， 蛋白质翻译修饰，蛋白质剪接等） 。 Nanjing University 测定一个有机体的基因 组所表达的全部蛋白 质。 3，蛋白质组学的任务 ： Nanjing University （二）后基因组研究的研究内容 ： 人类基因组多样性计划（ Human Genome Diversity Project ） 环境基因组学（Enviromental Genomics） 肿瘤基因组解剖计划（Cancer Genome Anatomy Project） 药物基因组学（ Pharmacogenomics） Nanjing University 核心问题： 基因组的多样性； 遗传疾病产生的起 因； 基因的表达调控作 用； 蛋白质产物的功能 。 Nanjing University 第二章 遗传的 物质基础 Nanjing University第一节 遗传物质的 本质 一、DNA是遗传物质 （一）、DNA是遗传物 质的证明 Nanjing University 1928年Griffith等进行的 肺炎球菌转化（ transformation ）实验 1944年Avery证明DNA是 遗传物质 Nanjing University （二）DNA携带两类不 同的遗传信息 1，负责基因结构的信 息 2，负责基因选择性表 达的信息 Nanjing University 二、RNA也可作为遗传物质 （一）RNA病毒 病毒颗粒（viron）：由病毒RNA 基因组和包被在外的蛋白质外壳 组成 病毒的生存方式：病毒编码包装基 因组所需的蛋白，以及一些在感 染循环中复制病毒所需的蛋白质 。其他蛋白质由宿主提供。因此 病毒不能独立生存。 Nanjing University （二）类病毒（viroid） 类病毒: 是使高等植物产生 疾病的有传染性的因子，由 很小的环状RNA分子构成 。与病毒不同，类病毒的 RNA本身就是感染因子。 类病毒只由RNA组成，其 中广泛存在不完全的碱基配 对，形成一种特有的棒状结 构。类病毒的基因组不能编 码蛋白质。 Nanjing University 类病毒的复制：必须由宿主的 酶来完成，其RNA作为模板。 类病毒对宿主的影响：类病毒 可通过复制占有宿主细胞中关 键的酶，从而影响宿主细胞的 正常功能；类病毒也能影响必 需的RNA的产生而引发疾病； 它们还可以作为一个不正常的 调控分子，对个别基因的表达 产生特殊的影响。 Nanjing University 三、是否存在核酸之外的遗 传物质？ （一）朊病毒（prion）： 是一个28KDa的疏水性糖蛋白， 由细胞的核基因编码，在正常动 物的脑组织中有表达。 （二）朊病毒的存在形式： 朊病毒以感染性形式（PrPSC)， 和非感染性形式（PrPC）两种形 式存。 Nanjing University （三）两种形式的朊病毒的异同： PrPC PrPSC 功能 ： 不详 导致退行性神经疾 病 分 布： 正常脑 被感染脑 抗蛋白酶性： 可被完全降解 只能被部分降解 溶解性： 可溶 难溶 一级结构： 两者相同 二级结构： 40%螺旋 20% 螺旋， 50%折叠 Nanjing University （四）朊病毒的感染方式 PrPSC 作用需要PrPC 的参与 PrPSC 蛋白的错误折叠形式可 以催化天然PrPC分子从正常的 可溶性的螺旋构象向不溶性 的折叠构象转化，最终导致了 疾病和感染。 Nanjing University （五）朊病毒的多株现象 不同PrPSC株可使一种PrP结构转化 为不同的构型；而同一种PrPSC可以 在具有不同PrP蛋白的多种生物中传 代，即使经过多次传代仍然保持自身 的生物学特征。 （六）朊病毒是遗传物质吗？ 多株现象难以解释 其感染方式能否被视为遗传复制？ Nanjing University 第二节 DNA的一级 结构 一、DNA一级结构的组成 一级结构：4种核苷酸的连接及其排列 顺序 (一）含氮碱基（ nitrogenous bases） Nanjing University DNA中的常见碱基有：胞嘧啶（ cytosine, C）、胸腺嘧啶（thymine, T ）、腺嘌呤（adenine, A）和鸟嘌呤（ guanine, G） Nanjing University （二）脱氧核糖核苷（nucleoside ） 由碱基和戊糖（D-脱氧核糖）缩合而成。有4 种脱氧核糖核苷：胞嘧啶脱氧核糖核苷、胸 腺嘧啶脱氧核糖核苷、腺嘌呤脱氧核糖核苷 ）和鸟嘌呤脱氧核糖核苷 + H2O Nanjing University （三）脱氧核糖核苷酸（ deoxyribonucleotide） 脱氧核糖核苷和磷酸缩合形成的磷酸酯 Nanjing University 所有的核苷酸的5位置可以连接一个以上的磷酸 基团。从戊糖开始的第一、二、三个磷酸残基依 次称为、 核苷三磷酸缩写为NTP，核苷二磷酸缩写为NDP。 Nanjing University （四）脱氧核糖核酸（ deoxyribonucleic acid, DNA） 脱氧核糖核苷酸以3，5磷酸二酯键聚合成 为脱氧核糖核酸（DNA）链。链的一端的核苷酸 有自由的5磷酸基团，称5端；另一端核苷 酸具有自由的3羟基，称3端 Nanjing University DNA链的方向就是 从5端到3端 。 DNA分子通常以线 性或环状的形式 存在。大多数DNA 由两条互补的单 链构成。少数生 物的DNA，如某些 噬菌体或病毒是 以单链形式存在 的。 Nanjing University 二、DNA的碱稳定性 DNA对碱相对稳定 RNA在碱性溶液中易降解为2，3环式 单核苷酸中间产物，然后很快转变为2 单核苷酸和3单核苷酸。 Nanjing University三、序列测定方法 （一）小片段重叠法 （二）凝胶直读法 1，酶法 （1）加减法（Sanger,1975 ） （2）末端终止法(双脱氧法 /间接拷贝法)（ Sanger,1977） Nanjing University 末端终止法的应用循环测序（cycle sequecing)实验及原理 a.测序反应的设定 体系中包括：DNA模板，TaqDNA聚合酶，寡核苷酸 引物，4种dNTP和荧光ddNTP（4种荧光）等； b.反应 包括：DNA变性，引物与模板配对，DNA聚合酶使引 物延伸（在引物3末端接上dNTP或ddNTP）； c.反应的终止 20-30个循环后，新合成所有可能的DNA片段，每个 片段的3末端都被接上ddNTP，延伸终止； d.反应产物电泳分离及检测 在聚丙烯凝胶中，不同大小的DNA片段在高压电场 作用下迁移，小分子迁移速度快，先被位于凝胶 底部的装置检测到。 e.结果的处理及输出 根据被检测到的DNA片段的顺序及颜色，绘出DNA片 段的电泳图谱。DNA序列中的每个核苷酸由一系 列按顺序排列的彩色峰型显示出来 Nanjing University2，化学法（Maxam/Gilbert,1977） 适用于DNA短片段的测定 四、一级结构的重要性 携带遗传信息 决定DNA的二级结构 决定DNA的空间结构 Nanjing University 第二节 DNA的二级结构 一、DNA螺旋的几种构象及其动态平衡 （一）Watson Crick右手 双螺旋结构（B-DNA构象） 相对湿度为92%时，DNA钠盐纤维为B-DNA构象。 在天然情况下，绝大多 数DNA以B构象存在。 1，主链: 2，碱基对 3，螺距 4，大沟和小沟 Nanjing University（二）A-DNA构象 为相对湿度改变（75%以下）或 由钠盐变为钾盐、铯盐，DNA的 结构可成为A构象。它是B-DNA 螺旋拧得更紧的状态。DNA- RNA杂交分子、RNA-RAN双 连分子均采取A构象。 Nanjing University （三）Z-DNA构象 在一定的条件下（如高盐浓度）， DNA可能出现Z构象。Z-DNA 是左手双螺旋，磷酸核糖骨架呈 Z字性走向。不存在大沟，小沟 窄而深，并具有更多的负电荷密 度。 Nanjing University B-DNA、A-DNA及Z-DNA结构特征比较 B-DNA A-DNA Z- DNA 每圈bp数 10-10.6 11 12 每bp转角（度） +34.6 +34.7 -30 每bp上升距离（A） 3.38 2.56 5.71 螺旋直径（A） 19 23 18 Nanjing University B-DNA是活性最高的DNA构象 ，B-DNA变成A-DNA后，仍有 活性，但若局部变构为Z- DNA后，活性明显降低。 Nanjing University 二、决定双螺旋结构状态 的因素 （一）氢键 1 ，碱基的氢供体 氨基、羟基 2，碱基的氢受体 酮基、亚氨基 3，GC对及AT对之间的氢键 在一定范围内DNA的稳定性与GC百 分含量成正比（图1-2） Nanjing University 4，氢键数对DNA双链稳定 性的影响 5，碱基之间形成氢键的条 件 互补性 方向性 Nanjing University （二）碱基堆集力 1，碱基堆集力 同一条链中的相邻碱基之间的非特异性作 用力 2，碱基堆集力的来源 疏水作用 累积的Van der Waal的作用力 3，碱基堆集作用的证据 单链多核苷酸倾向于碱基平行排列的规则 螺线结构 破坏疏水作用和双链的氢键可降低DNA的 稳定性 Nanjing University （三）带电荷的磷酸基的静电斥力 磷酸集团的负电对DNA双链的稳定性起负 作用。阳离子可对之产生屏蔽。DNA溶液 的离子浓度越低，DNA越不稳定。 （四）碱基分子内能 碱基内能越高，氢键和碱基堆积力越容易 被破坏，DNA双链越不稳定 Nanjing University 第三节 DNA的高级结构 一、正超螺旋和负超螺旋 （一）形成超螺旋的原因和条件 原因：因某种原因引入了额外的螺旋 条件： a, DNA双螺旋闭合或被蛋白结合，末端不能自 由转动； b, DNA双链上无断裂 （二）正超螺旋 （二）负超螺旋 Nanjing University 二、描述DNA螺旋状态的带子模型 (一）L=T+W 1，L：连接数（linking number）； specifies the number of times that the two strands of the double helix of a closed molecule cross each other in toto. 2，T：初级螺旋数（twisting number）； represents the rotation of one strand about the other. 3，W：超螺旋数（writhing number）； represents the turning of the asis of the duplex in space. Nanjing University 有相同的一级结构，而L值不同的DNA分子 叫做拓扑异构体。在DNA双链不发生断裂的 前提下，L值不变。 （二）L= W+ T （三）比连接差（specific linking difference)； 1，表达式： =（L-L0）/ L0 （L0：表示松弛环型DNA） 2，含义： 用来表示超螺旋的程度；当初级螺旋数不变 时， 代表超螺旋密度。 Nanjing University三、影响DNA高级结构的酶 L值的改变需要至少一条 DNA链断裂一次。断裂造 成的DNA自由末段的一断 可绕着另一端旋转，随后被 重新连接，DNA拓扑异构 酶通过催化此类反应将 DNA从一种拓扑结构转变 成另一种。 Nanjing University （一） I型DNA拓扑异构酶（ 图1-25） 底物： DNA单链 ATP： 不需 酶活性：DNA内切酶和连接酶活性 代表： E.Coli的DNA拓扑异构酶I ： 可催化负超螺旋DNA转化为 松弛环型 鼠DNA拓扑异构酶I：对正 、 负超螺旋有相同的松弛能 力 Nanjing University 原理： E.coli拓扑异构酶 识别部分解螺旋的 DNA分子，与DNA单 链部分结合后，切 断一条链，并以其 酪氨酸残基与DNA的 5磷酸相连。磷酸 二酯键从DNA转移蛋 白质上。酶将完整 的DNA链拉过缺口后 （ L =+1），重 新连接原先单链上 磷酸二酯键。 Nanjing University上述过程除了改变DNA的 超螺旋结构外，还可使单 链环状分子形成三叶结构 ，以及使两个单链环状分 子成为环连体分子。（图 1-24） Nanjing University （二） II型DNA拓扑异构酶 底物 DNA双链 ATP 需要 酶活性 DNA内切酶和连接酶活性 代表 E.Coli旋转酶（DNA gyrase, DNA拓扑异构酶II），可引入 负 超螺旋。无ATP时，此酶只能 缓 慢地松弛负超螺旋。 Nanjing University E.Coli的旋转 酶还具有形成 和拆开双链 DNA环连体和 成结分子的能 力。 此类酶无 碱基序列特异 性。 Nanjing University （三） DNA拓扑异构酶催化 反应的实质： 其本质是先切断DNA的磷酸二 酯键，改变DNA的链环数后再 连接，兼具DNA内切酶和DNA 连接酶的功能。然而这些酶 并不能连接事先已经存在的 断裂DNA，即其断裂及连接反 应是相互偶联的。 Nanjing University 第四节 DNA的变性、复性、 杂交和Cot曲线 一、DNA的变性 DNA变性（熔解）：DNA被加热或某 些试剂的作用下，配对碱基之间氢 键和相邻碱基之间的堆集力受到破 坏，逐步变为近似于无规则的线团 构型即变性DNA的过程。 Nanjing University （一）单、双链DNA的紫 外光吸收 双链DNA：A260=1.0时， 50g/ml 单链DNA：A260=1.0时， 33g/ml （单链RNA：A260=1.0时，40g/ml ） Nanjing University （二）DNA的熔解曲线 1，Tm值：缓慢而均匀地DNA溶液的温度，当A260增加 到最大增值的一半时的温度，叫做DNA的熔解温度或 熔点，用Tm表示。 2，计算Tm值的经验公式 在0.15mol/L NaCl+0.015mol/L柠檬酸钠溶 液中，当DNA长链G+C百分含量在30%70%时 Tm = 69.3+0.41（G+C）% 当DNA链长度为1470nt时 Tm = 81.5+16.6lgNa+0.41（G+C）% -0.6甲酰胺%-600/L-1.5错配% 当DNA链长度18nt时，可近似认为 Tm = 4（G+C）+2（A+T） Nanjing University 二、复性 DNA复性：变性DNA在一定条件下恢复 天然DNA的结构的过程。 （一）复性的条件 1，消除磷酸基的静电斥力； 2，破坏连内氢键 （二）复性的机制 1，随机碰撞 取决于DNA浓度、溶液温度、离子强 度等 2，成核作用（nucleation) 3，拉拉链作用（zippering） Nanjing University 三、杂交 重要的杂交技术： Southern Blotting Northern Blotting Nanjing University 3.In Situ Hybridization Nanjing University 4.Colony Hybridizatio n Nanjing University 四、Cot曲线 （一）DNA复性的动力学 1，单链消失的速度： -dc/dt=kc2 C/Co=1/(1+kCot) k：为二级反应常数（单位：L/mol秒 ），受DNA分子序列的复杂性、阳离 子浓度、温度的影响 C: 单链DNA的浓度（核苷酸摩尔数/L ） Nanjing University 当C=1/2C0(即DNA复性一半）时 Cot （Cot）=1/k DNA分子序列的复杂性X：最长的 没重复序列的核苷酸对的数值。 Cot X ：在DNA总浓度相同的 情况下，X值越小，片段浓度越高 ，复性时间越短， Cot 越小。 X=K Cot （影响K值的因素：阳离子浓度 、温度、片段大小） Nanjing University 2，Cot曲线 不同不同 物种物种 核酸核酸 的的 CotCot 曲线曲线 Nanjing University 3，原核生物DNA的复性动力 学（图1-10） 原核生物Cot曲线形状：不 同生物曲线形状相似，都 是单一序列； 原核生物Cot曲线跨度：一 般只有两个数量级； 原核生物Cot曲线位置：基 因组越大越靠右。 Nanjing University 4，真核生物DNA复 性动力学 （1）真核生物的DNA 复性曲线（图2-8） 真核生物Cot曲 线特点：阶梯状 ，跨度7-8个数 量级。 真核生物Cot曲 线的组成：快复 性组分/中间复 性组分/慢复性 组分 Nanjing University （2）3种复性组分复杂性的计 算 X = KC0t1/2 每种复性成分的实际C0t值 = 测得的C0t值 该组分占总 DNA的百分比 待测样品DNA的复杂长度 = 标准DNA的复杂长度 待测 样品DNA Cot / 标准DNA Cot Nanjing University 化学复杂长度和动力学复杂长度 化学复杂长度：通过化学方法测量得 到的DNA长度 动力学复杂长度：按照复性动力学计 算出来的DNA复杂长度 基因组的化学复杂长度 单一序 列的动力学复杂长度 / 单一序列 的百分比 Nanjing University （3）每一组分拷贝数（重复频率 ）的计算 重复频率f = 化学复杂长度 / 动 力学复杂长度 =（基因组化学复 杂度 标准DNA C0t） / （待测 DNA样品 C0t 标准DNA样品动力 学复杂长度 ） Nanjing University （4）同一复性曲线各组分的Cot 与重复频率的关系 C0t（1）：C0t（2）= f（2）：f（1） f（2）= f（1） C0t（1） / C0t（2） Nanjing University 第三章 基因与基因组 Nanjing University 一、基因概念的历史演 变 1909年W.Johannsen首先使 用“基因”一词，其含义与 孟德尔的“遗传因子”完全 一致。此阶段基因只是逻辑 推理的产物。 第一节 基因 Nanjing University 20世纪初，T, H. Morgan 等人提出连锁交换规律和 伴性遗传，指出基因在染 色体上直线排列。1926年 Morgan在基因论中 指出基因代表着一个有机 的化学实体。 Nanjing University 1941年Beade和Tatum提出 了“一个基因一个酶（ one gene : one enzyme hypothesis ）”的假说，认 为：基因是一个DNA片段 ，负责编码一个蛋白酶（蛋 白质）。当一种蛋白质是由 异源亚基构成时，该假说应 修正为“一个基因一条多肽 链”。 Nanjing University 1955年，S. Benzer提出了顺反子 （cistron），突变子（muton） 和重组子（recon）等术语。顺 反子学说认为，顺反子是一段编 码一种多肽链的核苷酸序列，是 一个功能单位。该学说否定了基 因是决定遗传形状的功能单位， 同时也是突变和重组的最小单位 的看法。而突变子和重组子最终 被证明是以单核苷酸对为单位的 。 Nanjing University 目前对基因的认识是： 基因是能够表达和产生 基因产物（蛋白质或 RNA）的核苷酸序列。 其内容可扩展至包括两 侧对基因表达的起始和 终止所必需的调控序列 。 Nanjing University Gene (cistron) is the segment of DNA involved in producing a polypeptide chain; it includes regions preceding and following the coding region (leader and trailer) as well as intervening sequences (introns) between individual coding segments (exons). Nanjing University 二、基因的现代概念 1，转座成分（transposable elements）又叫做移动基因（ movable genes） 是一些可以在染色体基因组 上从一个位置转移到另一个 位置，甚至在不同染色体之 间跃迁的DNA成分。有人将 之形象地称为跳跃基因（ jumping genes）。 Nanjing University 跳跃基因是由美国女科学 家B. McClintock于上个世 纪的40年代后期在玉米中 首先发现的。当时称为激 活-解离因子（activator- dissociation element，即 Ac/Ds因子）。（P449） Nanjing University 2，断裂基因（spliting gene） 真核基因的核苷酸序列中间 有与氨基酸编码无关的 DNA间隔区，使一个基因 分隔成不连续的若干区段。 这种编码序列不连续的间断 基因称为断裂基因。现已证 实，除了真核生物外，少数 原核生物，如大肠杆菌T4 噬菌体中也存在断裂基因。 Nanjing University Nanjing University 3，假基因（pseudogene） 是一些核苷酸序列与其相 应的正常功能基因基本相 同、但却不能合成出功能 蛋白质的失活基因，通常 积累了较多的突变。现已 在大多数真核生物中发现 了假基因的存在。假基因 数量一般较少。 Nanjing University 4，重叠基因 不同基因的核苷酸序列有时 是可以共用的，即这些基因 的核苷酸序列是彼此重叠的 ，这样的基因称为重叠基因 （overlapping genes）或嵌 套基因（nested genes）。 目前已在病毒、噬菌体和少 数真核基因中发现了重叠基 因。 Nanjing University 三、基因的分类 基因按其产物的功能可分 为结构基因、调控基因 和RNA基因： 1，结构基因：可被转录 形成mRNA，并进而翻 译成多肽，构成各种结 构蛋白质，催化各种生 化反应的酶和激素等； Nanjing University 2，调控基因：指某些可 调节控制结构基因表达 的基因。 3，RNA基因：是一些只 转录不翻译的基因，包 括核糖体RNA基因，专 门转录rRNA；以及 tRNA基因，专门转录 tRNA。 Nanjing University 第二节 原核生物的基因组 Nanjing University 一、大肠杆菌（ E.coli）的染色体及 其基因 （一） E.coli的染色 体 类核：大肠杆菌中可 有2-4个DNA相对集 中的区域，即类核 Nanjing University 染色体结构：E.coli的 染色体DNA是一个由 4.2X106碱基对组成的 双链环状分子。多种 DNA结合蛋白和RNA可 使染色体压缩成一个脚 手架（scaffold)结构, 分成大约100个小区（ domain）（图2-2）。 Nanjing University （二）E.coli的基因组的特点 1，功能相关的结构基因通常构成操 纵元 操纵元（operon）：大肠杆菌功能 上相关的几个结构基因前后相连， 由一个共同的调节基因和一组共同 的控制位点，即启动子（promoter ）和操作子（operator）对其表达 过程实行协同调节控制。细菌基因 表达调控的这样一个完整的单元， 称为操纵元 Nanjing University Nanjing University 调控元（regulon）：几个操纵 元和它们共同的调节基因所构成 的基因表达调控单元 2，蛋白质基因通常以单拷贝形式存在 3，RNA基因通常是多拷贝的 大多数大肠杆菌菌株都有7个核糖体 基因（rrn）操纵元，多数rrn操纵元 分布在DNA复制起始位点附近 4，其他基因的调控形式多样 Nanjing University二、噬菌体 174的基 因组及其基因 （一） 174噬菌体概 况 20面体，无尾。其DNA为 单链环状，含5386个碱基 。 Nanjing University （二） 174基因组的 特点 1，有11个基因，分别从 基因A、B、D开始转录成 3个mRNA 2，非编码区DNA占基因 组的4% Nanjing University 3，有重叠基因和基因内基因 基因内基因：B在A*内，E在 D内； 部分重叠的基因：K和C 只有一个碱基对重叠的基因 ：D的终止密码的最后一个 碱基是J起始的第一个碱基 ，两者ORF不同 Nanjing University 三、 噬菌体的基因组及其基因 （一）噬菌体的概况 1，一般情况 染色体DNA为双链，共有48502 个碱基对。在不同的生长状态 下， 噬菌体DNA可以以环状 分子（带切刻），和线形分子 （具有两个粘性末端）两种形 式存在（图2-6） Nanjing University 2，噬菌体的生活史 （1）溶菌（裂解）周期（lytic cycle）基本过程： 吸附：噬菌体吸附到细菌表面的 特殊接受器上 注入：噬菌体DNA穿过细胞壁注入 寄主细胞 转变：被感染细菌功能发生变化 ，成为制造噬菌体的场所 Nanjing University 合成：寄主细胞大量合成噬 菌体特有的核酸和蛋白质 组装：噬菌体DNA包装头部 和尾部蛋白，成为噬菌体颗 粒 释放：新合成的子代噬菌体 颗粒从寄主细胞内释放出来 Nanjing University 噬菌体溶噬菌体溶 菌（裂解）菌（裂解） 周期（周期（