膝关节骨性关节炎动物模型建立的研究现状

-精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 1 膝关节骨性关节炎动物模型建立的 研究现状 摘要 本文基于对膝关节骨性关 节炎病因和治疗机制的基础研究的不断 探索，深入分析发现当前建立骨关节炎 动物模型所选动物以鼠、兔为主，其他 动物如狗、猪、鸡等应用较少。常用造 模方法主要有自发性模型、手术造模以 及其他方法等，不同动物及不同方法有 着较为严格的区别，因此在选择模型时 应根据研究需要综合考虑。 中国论文网 /6/view-12954757.htm 关键词 膝关节；骨关节炎；动 物模型 中图分类号 R684.3 文献标识 码 A 文章编号 1673-7210（2017） -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 2 10（c）-0046-04 Research status of establishment of animal model of knee osteoarthritis SONG Hanbing1 ZHAO Feng2 GE Yuanyuan2 YANG Dan2 YU Yingjun3 1.The Third Department of Orthopaedics， the First Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine， Heilongjiang Province， Harbin 150040， China； 2.Graduate School， Heilongjiang University of Chinese Medicine， Heilongjiang Province， Harbin 150040， China； 3.School of Basic Medicine， Heilongjiang University of Chinese Medicine， Heilongjiang Province， Harbin 150040， China Abstract Based on the continuous exploration on the fundamental researches of etiology and treatment mechanism of knee osteoarthritis， this paper takes in- depth analysis and finds that the animals -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 3 used for establishing animal models with osteoarthritis at present are mainly rats and rabbits， the application of other animals， such as dogs， pigs， chickens and others， is less. The commonly model replicating methods are spontaneous models， operation models， and other methods， different animals and different methods have relatively strict distinction， so the choice of models should be based on the need of study. Key words Knee joint； Osteoarthritis； Animal model 膝关节骨性关节炎是在骨科临床 中常见的一种以关节退行性改变为主的 疾病，中老年人群多发，主要症状为膝 关节增生样肿胀、关节内翻畸形、屈伸 活动受限，负重行走尤其上下楼梯时疼 痛明显加重，关节磨糙音、弹响，部分 患者会出现关节腔积液1。目前，对于 膝关节骨性关节炎的临床和基础研究越 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 4 来越广泛，但是膝骨性关节炎发生的病 因和治疗机制的基础研究尚不丰富，有 待于进一步的探索。在试验过程中，能 够制造最为接近人的膝关节骨性关节炎 的病因及转归的动物模型则尤其重要。 经过造模方法的不断深入研究， 膝关节骨性关节炎的造模方法较多，利 用兔和大鼠来造模的方式是最为常见的， 动物模型一般有自发性模型、诱发性模 型、手术方法造模等。为了能够更顺利 地完成膝关节骨性关节炎的相关动物实 验，在目前文献研究报道的基础上，本 文总结了动物模型的常见建立方法，以 利于研究者能够更顺利地运用膝关节骨 性关节炎动物模型来进行实验研究。 1 鼠类模型的制作 1.1 喂养造模 Silberberg 等2给以含高脂肪、 高动物油脂的饲料喂养 C57BL 小鼠， 经过研究发现骨关节炎出现率较高，脂 肪酸 Omega-3 代替必需脂肪酸 Omega-6 可导致关节软骨纤维的退行性改变。 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 5 1.2 自发性模型 许多动物可以因自身关节软骨退 变形成骨关节炎，这种骨关节炎甚至不 需任何干预。由 Silberberg 等3经过观 察发现 C57 黑鼠和 STRPort 小鼠具有可 以自我发生骨性关节炎的特征，主要累 及胫内侧软骨，雄性 STRPort 小鼠病变 较重，发生率较高4。激素水平影响可 以产生自发性模型，研究l 现性激素 可以干预雌性 STRPort 小鼠转化生长因 子 1 与白介素-4 表达，此效应可以保 护关节软骨，降低关节软骨炎的发生率 5。另外，Yamamoto 等6通过对栗鼠 行走方式进行干预，使其以特殊的步态 行走，发现当栗鼠以这种步态行走一段 时间后，栗鼠踝关节软骨的边缘会出现 不同程度的增生、关节面龟裂等形态变 化，光镜观察可以发现，栗鼠关节产生 类似于人类骨关节炎病理变化的改变， 如软骨细胞数目减少、排列紊乱等。这 些改变可以进行类似骨关节病遗传学及 关节软骨细胞退行性改变方面的研究7。 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 6 1.3 基因技术模型 转基因技术的不断创新，骨关节 炎动物模型可以通过基因技术来实现， 目前主要是 Col9a1 和 Col2a1 基因部分 缩短、缺失或者基因的突变、铜转运基 因缺陷、Col11a1 基因的 1-bp 处缺失、 MMP-13 基因的过度表达以及组织特异 性 BMP-1a 型受体缺乏等，以及下列基 因的敲除，这些基因包括 ADAM-15 基 因、MMP-14 基因、白介素 -6 基因、 Mig-6 基因、a-1 整合素基因、纤维调节 素和基膜聚糖基因双链、纤维调节素和 二聚糖基因单链或者双链等。研究发现， 调控软骨细胞凋亡的基因被剔除，软骨 细胞退变，破坏速度会加速8。Arita 等9发现并制造转基因小鼠模型，表达 人突变型前胶原基因，电镜下发现相 比于正常组，软骨示型胶原纤维的密 度减少，此等变化与因该基因突变而造 成的全身骨关节炎患者相似。 虽然转基因小鼠骨关节炎模型对于研究 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 7 骨关节炎发病中的特殊基因或蛋白质的 作用十分重要，然而骨关节炎的发病机 制是基因的异常，并不能反映临床上因 劳累、环境因素等造成的关节炎，另外， 进行基因改造后的实验动物是否具有其 他可引起关节改变的病理变化尚不明确， 因此转基因能否作为评价骨关节炎治疗 方法的普通模型还存在争议。 1.4 关节固定 如果将大鼠关节较长时间固定， 可以导致关节软骨的退变，从而产生关 节炎。如果固定于关节伸直位时施加压 力可以加大关节面压力和磨损，从而促 进关节炎发生的进程。另有学者通过采 用过屈位和过伸位将模型进行固定，发 现两者均能得到满意的动物模型，但过 屈位造模方法优于过伸位所造的模型 10。 1.5 关节注射 卢锋等11 将白陶土的生理盐水 悬浮液和弗式佐剂注射液分别注射于大 鼠后肢踝趾关节，用来观察盐酸氨基葡 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 8 萄糖抑制骨关节炎的病变程度，结果显 示盐酸氨基葡萄糖对骨性关节炎存在保 护作用，具有辅助性疗效。Hagmann 等 12对雄性 Wistar 大鼠的膝关节注射碘 乙酸钠，建立膝关节骨性关节炎模型， 该方法比较简便。 1.6 Hulth 法造模 在动物实验中，早期曾有关节内 手术方法，但关节内手术方法容易导致 创伤性滑膜炎对实验的干扰，因此目前 较为常用的手术方法为 Hulth 法，采用 Hulth 法制作鼠类动物模型，首先将膝 关节的内侧副韧带离断，然后把内侧半 月板和前后交叉韧带依次切除，饲养 8 周后即可成功制作出所需要的动物模型。 例如有学者报道，将 45 个月龄大鼠 以上述方法制得模型13 。有学者14 选择豚鼠作为实验动物进行研究，方法 主要是切断豚鼠的臀大肌和深面臀小肌、 臀中肌，来对髋关节的平衡维持能力、 稳定能力以及负重能力进行干预性破坏。 12 周之后，研究人员发现其膝关节的软 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 9 骨面出现水平裂隙及软骨剥脱等早期骨 关节炎的典型表现，软骨细胞形成灶巢 样增生、双柱状病理改变，可以见到新 骨的形成。豚鼠关节软骨表面在 24 周 之后，可以观察到破溃更加严重，呈绒 毛样外观，裂隙加深，软骨下骨常常呈 象牙状裸露。这种造模通常不会造成创 伤性滑膜炎，因此可以作为骨关节炎早 期病理变化的较好模型。 1.7 诱发性模型 寒冷刺激诱发模型、药物诱发模 型是诱发性模型的两种主要类型，其中 药物诱发模型主要的造模方式是药物的 关节腔内注射，常用的药物主要有雌激 素、蛋白水解酶、肾上腺皮质激素、尿 激酶、肿瘤坏死因子、白介素等，由于 这些药物影响了膝关节软骨的代谢，直 接对关节软骨造成了破坏，因而诱发骨 关节炎。 寒冷刺激可以诱发关节液成分的 改变，进一步改变滑膜通透性，对关节 软骨的内环境造成破坏，可诱发关节炎。 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 10 此外，寒冷刺激可以造成关节软骨的直 接损伤，研究发现，局部冻疮 6 个月后 可发现诱发关节软骨微小的损伤，12 个 月后可以观察到关节更加显著的损伤 15，因此可以说明，关节损伤后常在 受伤的数月后或数年后发生关节疼痛， 尤其是在冬季容易加重。林木南等16 在研究中指出，寒冷刺激可以使细胞排 列紊乱，细胞显著簇集，可见细胞核缩、 核溶、甚至细胞消失等现象，基质染色 不均、淡染，导致结构明显疏松，胶原 纤维显著减少，新生毛细血管出现在软 骨中，软骨退化现象十分显著。 关节软骨及其附近酸水平以及肿 瘤坏死因子含量。第 30 天时发现模型 组小鼠关节炎指数（AI）远高于正常组， 最高可达 3.8，对模型小鼠进行苏木精- 伊红染色，可见小鼠典型的骨关节炎病 变，模型组血清中透明质酸、肿瘤坏死 因子- 的含量显著升高，出现骨关节炎 典型的病理改变，而且其血清中肿瘤坏 死因子和透明质酸的含量都可见明显升 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 11 高，说明冷水刺激可导致小鼠骨关节炎， 这种造模方法可作为具有地域特异性的 骨关节炎模型。 有学者发现，小鼠在行卵巢切除 术后会出现明显的关节软骨退变，而且 代表软骨变化的 CTX2和代表骨吸收 的 CTX2显著升高18 。这表明，关 节变化与 CTX2和 CTX2的水平呈 明显相关性，这说明了卵巢分泌的一类 激素可以对关节软骨起到一定的保护作 用，并且得出卵巢切除术可用于激素水 平及年龄相关的骨关节炎动物模型。 2 兔模型的制作 2.1 Hulth 法造模 兔模型也多以 Hulth 法为主，兔 Hulth 法19为兔经典手术干预造模方法， 其方法大致为：以耳缘静脉麻醉法麻醉 实验兔，实验组是将兔的膝关节皮下组 织切开，将内侧副韧带、前后交叉韧带 切断，把内侧半月板一同完整切除，术 后常规处理，固定但不制动伤肢，1 周 后每天驱赶兔子行走 2 次，共 30 min， -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 12 连续 4 周。当实验兔因手术导致膝关节 正常力线破坏时，关节负重面减少，局 部受力更加集中，导致关节软骨磨损程 度增加，加重了其退行性变的速度，促 使关节软骨发生退行性改变。3 个月后 对实验兔受损关节的观察显示，软骨出 现裂隙、破坏20 。 对实验兔采用 Hulth 造模法进行 实验时，骨关节常常会出现类似骨关节 炎中晚期的改变，病变较重，因此学者 往往对其进行改良，例如李炳辉等21 应用改良 Hulth 法进行实验造模，其主 要步骤为将实验兔下肢内侧副韧带、内 侧半月板以及前交叉韧带切断，在 Hulth 法操作中保留后交叉韧带，自术 后 1 周每天驱赶实验兔行走 30 min，并 持续 16 周。16 周后可同样发现实验兔 的膝关节内侧关节间隙不同程度的变窄， 关节面明显不平，边缘骨赘形成，细胞 检测可见软骨胞膜破损，细胞核固缩。 相对于传统 Hulth 法，改良后创伤较小， 操作简单，一定程度上维持了膝关节的 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 13 稳定性，更有利于造模成功。 2.2 其他造模方法 除了 Hulth 法之外，李钊等22 使用小针刀在 20 只实验大兔胫骨平台、 双侧股骨髁软骨表面上刻痕，每一侧刻 痕均为 45 道，刻痕不超过软骨层， 不能损伤半月板，术后第 2 天开始每天 驱赶动物活动半小时。由于小针刀闭合 刻痕对关节滑膜影响小，故该方法不会 出现滑膜炎等。该方法 5 周后发现造模 组关节软骨具有典型的骨关节炎病理改 变。 Okazaki 等23 通过将实验兔下肢 关节伸直位制动持续 14 d 后，兔关节的 软骨可以见到早期退变改变，制动 28 d 后可见到关节软骨退变程度达中度，42 d 后则可达重度退变，同时发现 p53 mRNA 参与该过程的发生。一份实验 24以成年新西兰大白兔为实验动物， 将其左后肢膝关节固定于伸直位，造模 6 周后对比其左右后肢关节软骨及滑膜 发现，关节软骨细胞在制动后 1 周即开 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 14 始发生凋亡，6 周时无论从微观或宏观 角度，实验兔手术关节均符合呈典型的 骨关节炎病理改变特征。 3 其他动物模型的制作 相比于上述实验动物，因实验动 物伦理要求，其他模型在实践中应用相 对较少，仅仅在某些特殊方法时才考虑 应用。有学者尝试以关节镜切除猪双膝 外侧部分半月板，术后 12 周时大体观 察结果表现为局限性软骨表面纤维化， 伴股骨髁间切迹骨赘形成；组织学检测 表现为软骨细胞数量和蛋白多糖含量减 少、成簇排列细胞数量增加，说明已产 生退行性变；核磁检查表现为软骨厚度 变薄、软骨信号强度改变25。因此以 关节镜行半月板部分切除能有效建立猪 双膝关节骨性关节炎动物模型，但因关 节镜设备限制，关节镜造模仅在大型动 物中可以应用。 易彩霞26 尝试以猪为实验对象 进行造模，其方法为取外侧入路进入猪 左膝关节腔，将其前交叉韧带切断后并 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 15 完全将外侧半月板切除。右侧膝关节不 予处理作为空白对