菌种保存得方法

菌种保存方法微生物具有容易变异的特性，因此，在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。 低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素，所以，菌种保藏方法虽多，但都是根据这三个因素而设计的。保藏方法大致可分为以下几种：1传代培养保藏法又有斜面培养、穿刺培养、疱肉培养基培养等（后者作保藏厌氧细菌用），培养后于 46冰箱内保存。2液体石蜡覆盖保藏法是传代培养的变相方法，能够适当延长保藏时间，它是在斜面培养物和穿刺培养物上面覆盖灭菌的液体石蜡，一方面可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡，另一方面可阻止氧气进入，以减弱代谢作用。3载体保藏法是将微生物吸附在适当的载体，如土壤、沙子、硅胶、滤纸上，而后进行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和滤纸保藏法应用相当广泛。4寄主保藏法用于目前尚不能在人工培养基上生长的微生物，如病毒、立克次氏体、螺旋体等，它们必须在生活的动物、昆虫、鸡胚内感染并传代，此法相当于一般微生物的传代培养保藏法。病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法与冷冻干燥保藏法进行保藏。5冷冻保藏法可分低温冰箱（-20-30，-50 -80）、干冰酒精快速冻结（约-70 ）和液氮（-196）等保藏法。6冷冻干燥保藏法先使微生物在极低温度（-70左右）下快速冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水分（真空干燥）。有些方法如滤纸保藏法、液氮保藏法和冷冻干燥保藏法等均需使用保护剂来制备细胞悬液，以防止因冷冻或水分不断升华对细胞的损害。保护性溶质可通过氢和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。保护剂有牛乳、血清、糖类、甘油、二甲亚砜等。三、器材细菌、酵母菌，放线菌和霉菌；肉膏蛋白胨斜面培养基，灭菌脱脂牛乳，灭菌水，化学纯的液体石蜡，甘油，五氧化二磷，河沙，瘦黄土或红土，冰块、食盐，干冰，95酒精，10盐酸，无水氯化钙；灭菌吸管，灭菌滴管，灭菌培养皿，管形安瓿管，泪滴形安瓿管（长颈球形底），40 目与 100 目筛子，油纸，滤纸条（051 2cm），干燥器，真空泵，真空压力表，喷灯，L 形五通管，冰箱，低温冰箱（-30），液氮冷冻保藏器。四、操作步骤、各保藏法的应用范围及优缺点下列各法可根据实验室具体条件与需要选做。1斜面低温保藏法将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌充分生长后，棉塞部分用油纸包扎好，移至 28的冰箱中保藏。保藏时间依微生物的种类而有不同，霉菌、放线菌及有芽孢的细菌保存 24 个月，移种一次。酵母菌两个月，细菌最好每月移种一次。此法为实验室和工厂菌种室常用的保藏法，优点是操作简单，使用方便，不需特殊设备，能随时检查所保藏的菌株是否死亡、变异与污染杂菌等。缺点是容易变异，因为培养基的物理、化学特性不是严格恒定的，屡次传代会使微生物的代谢改变，而影响微生物的性状；污染杂菌的机会亦较多。2液体石蜡保藏法（1）将液体石蜡分装于三角烧瓶内，塞上棉塞，并用牛皮纸包扎，105kg/cm2，1213灭菌 30 分钟，然后放在 40温箱中，使水汽蒸发掉，备用。（2）将需要保藏的菌种，在最适宜的斜面培养基中培养，使得到健壮的菌体或孢子。（3）用灭菌吸管吸取灭菌的液体石蜡，注入已长好菌的斜面上，其用量以高出斜面顶端 1cm 为准（图-12），使菌种与空气隔绝。（4）将试管直立，置低温或室温下保存（有的微生物在室温下比冰箱中保存的时间还要长）。此法实用而效果好。霉菌、放线菌、芽孢细菌可保藏 2 年以上不死，酵母菌可保藏 12 年，一般无芽孢细菌也可保藏 1 年左右，甚至用一般方法很难保藏的脑膜炎球菌，在 37温箱内，亦可保藏3 个月之久。此法的优点是制作简单，不需特殊设备，且不需经常移种。缺点是保存时必须直立放置，所占位置较大，同时也不便携带。从液体石蜡下面取培养物移种后，接种环在火焰上烧灼时，培养物容易与残留的液体石蜡一起飞溅，应特别注意。3滤纸保藏法（1）将滤纸剪成 0512cm 的小条，装入 068cm 的安瓿管中，每管 12 张，塞以棉塞，105kg/cm2，1213灭菌 30分钟。（2）将需要保存的菌种，在适宜的斜面培养基上培养，使充分生长。（3）取灭菌脱脂牛乳 12ml 滴加在灭菌培养皿或试管内，取数环菌苔在牛乳内混匀，制成浓悬液。（4）用灭菌镊子自安瓿管取滤纸条浸入菌悬液内，使其吸饱，再放回至安瓿管中，塞上棉塞。（5）将安瓿管放入内有五氧化二磷作吸水剂的干燥器中，用真空泵抽气至干。（6）将棉花塞入管内，用火焰按图-13 熔封，保存于低温下。（7）需要使用菌种，复活培养时，可将安瓿管口在火焰上烧热，滴一滴冷水在烧热的部位，使玻璃破裂，再用镊子敲掉口端的玻璃，待安瓿管开启后，取出滤纸，放入液体培养基内，置温箱中培养。细菌、酵母菌、丝状真菌均可用此法保藏，前两者可保藏 2 年左右，有些丝状真菌甚至可保藏 1417 年之久。此法较液氮、冷冻干燥法简便，不需要特殊设备。4沙土保藏法（1）取河沙加入 10稀盐酸，加热煮沸 30 分钟，以去除其中的有机质。（2）倒去酸水，用自来水冲洗至中性。 （3）烘干，用 40 目筛子过筛，以去掉粗颗粒，备用。（4）另取非耕作层的不含腐植质的瘦黄土或红土，加自来水浸泡洗涤数次，直至中性。（5）烘干，碾碎，通过 100 目筛子过筛，以去除粗颗粒。（6）按一份黄土、三份沙的比例（或根据需要而用其他比例，甚至可全部用沙或全部用土）掺合均匀，装入 10100mm 的小试管或安瓿管中，每管装 1g 左右，塞上棉塞，进行灭菌，烘干。（7）抽样进行无菌检查，每 10 支沙土管抽一支，将沙土倒入肉汤培养基中，37培养 48 小时，若仍有杂菌，则需全部重新灭菌，再作无菌试验，直至证明无菌，方可备用。（8）选择培养成熟的（一般指孢子层生长丰满的，营养细胞用此法效果不好）优良菌种，以无菌水洗下，制成孢子悬液。（9）于每支沙土管中加入约 05ml （一般以刚刚使沙土润湿为宜）孢子悬液，以接种针拌匀。（10）放入真空干燥器内，用真空泵抽干水分，抽干时间越短越好，务使在 12 小时内抽干。（11）每 10 支抽取一支，用接种环取出少数沙粒，接种于斜面培养基上，进行培养，观察生长情况和有无杂菌生长，如出现杂菌或菌落数很少或根本不长，则说明制作的沙土管有问题，尚须进一步抽样检查。（12）若经检查没有问题，用火焰熔封管口，放冰箱或室内干燥处保存。每半年检查一次活力和杂菌情况。（13）需要使用菌种，复活培养时，取沙土少许移入液体培养基内，置温箱中培养。此法多用于能产生孢子的微生物如霉菌、放线菌，因此在抗生素工业生产中应用最广，效果亦好，可保存 2 年左右，但应用于营养细胞效果不佳。5液氮冷冻保藏法（1）准备安瓿管用于液氮保藏的安瓿管，要求能耐受温度突然变化而不致破裂，因此，需要采用硼硅酸盐玻璃制造的安瓿管，安瓿管的大小通常使用 7510mm 的，或能容 12mm 液体的。（2）加保护剂与灭菌保存细菌、酵母菌或霉菌孢子等容易分散的细胞时，则将空安瓿管塞上棉塞，105kg/cm2，1213灭菌15 分钟：若作保存霉菌菌丝体用则需在安瓿管内预先加入保护剂如10的甘油蒸馏水溶液或 10二甲亚砜蒸馏水溶液，加入量以能浸没以后加入的菌落圆块为限，而后再用 105kg/cm2，1213灭菌 15 分钟。（3）接入菌种将菌种用 10的甘油蒸馏水溶液制成菌悬液，装入已灭菌的安瓿管；霉菌菌丝体则可用灭菌打孔器，从平板内切取菌落圆块，放入含有保护剂的安瓿管内，然后用火焰熔封。浸入水中检查有无漏洞。（4）冻结再将已封口的安瓿管以每分钟下降 1的慢速冻结至-30。若细胞急剧冷冻，则在细胞内会形成冰的结晶，因而降低存活率。（5）保藏经冻结至-30的安瓿管立即放入液氮冷冻保藏器（图-14 ）的小圆筒内，然后再将小圆筒放入液氮保藏器内。液氮保藏器内的气相为-150，液态氮内为-196。（6）恢复培养保藏的菌种需要用时，将安瓿管取出，立即放入3840的水浴中进行急剧解冻，直到全部融化为止。再打开安瓿管，将内容物移入适宜的培养基上培养。此法除适宜于一般微生物的保藏外，对一些用冷冻干燥法都难以保存的微生物如支原体、衣原体、氢细菌、难以形成孢子的霉菌、噬菌体及动物细胞均可长期保藏，而且性状不变异。缺点是需要特殊设备。6冷冻干燥保藏法（1）准备安瓿管用于冷冻干燥菌种保藏的安瓿管宜采用中性玻璃制造，形状可用长颈球形底的，亦称泪滴型安瓿管（图-15），大小要求外径 675mm ，长 105mm，球部直径 911mm，壁厚0612mm。也可用没有球部的管状安瓿管。塞好棉塞，105kg/cm2，1213灭菌 30 分钟，备用。（2）准备菌种，用冷冻干燥法保藏的菌种，其保藏期可达数年至十数年，为了在许多年后不出差错，故所用菌种要特别注意其纯度，即不能有杂菌污染，然后在最适培养基中用最适温度培养，使培养出良好的培养物。细菌和酵母的菌龄要求超过对数生长期，若用对数生长期的菌种进行保藏，其存活率反而降低。一般，细菌要求 2448 小时的培养物；酵母需培养 3 天；形成孢子的微生物则宜保存孢子；放线菌与丝状真菌则培养 710 天。（3）制备菌悬液与分装以细菌斜面为例，用脱脂牛乳 2ml 左右加入斜面试管中，制成浓菌液，每支安瓿管分装 02ml。（4）冷冻冷冻干燥器有成套的装置出售，价值昂贵，此处介绍的是简易方法与装置，可达到同样的目的。将分装好的安瓿管放低温冰箱中冷冻，无低温冰箱可用冷冻剂如干冰（固体 CO2）酒精液或干冰丙酮液，温度可达-70 。将安瓿管插入冷冻剂，只需冷冻 45 分钟，即可使悬液结冰。（5）真空干燥为在真空干燥时使样品保持冻结状态，需准备冷冻槽，槽内放碎冰块与食盐，混合均匀，可冷至-15。装置仪器如图-16 ，安瓿管放入冷冻槽中的干燥瓶内。抽气一般若在 30 分钟内能达到 933Pa（07mmHg）真空度时，则干燥物不致熔化，以后再继续抽气，几小时内，肉眼可观察到被干燥物已趋干燥，一般抽到真空度 267Pa（02mmHg），保持压力 68 小时即可。（6）封口抽真空干燥后，取出安瓿管，接在封口用的玻璃管上，可用 L 形五通管（图-17）继续抽气，约 10 分钟即可达到267Pa（02mmHg）。于真空状态下，以煤气喷灯的细火焰在安瓿管颈中央进行封口。封口以后，保存于冰箱或室温暗处。此法为菌种保藏方法中最有效的方法之一，对一般生活力强的微生物及其孢子以及无芽胞菌都适用，即使对一些很难保存的致病菌，如脑膜炎球菌与淋病球菌等亦能保存。适用于菌种长期保存，一般可保存数年至十余年，但设备和操作都比较复杂。厌氧菌的培养方法厌氧菌在有氧的情况下不能生长。要培养厌氧菌，必须创造一个无氧的环境。通常用培养基中加入还原剂，或用物理、化学方法去除环境中的游离氧，以降低氧化还原电势。如疱肉培养基、硫基乙酸钠培养基，牛心脑浸液培养基等。常用的厌氧培养方法有许多，可根据实际情况选用。1厌氧缸法接种好标本的平板或液体培养基试管，可放入厌氧缸内培养，厌氧缸是普通的干燥缸，用物理化学的方法使缸内造成厌氧环境，从而将厌氧菌培养出来。2厌氧袋（Bio-bag）即在塑料袋内造成厌氧环境来培养厌氧菌。塑料袋透明而不透气，内装气体发生管（有硼氢化钠的碳酸氢钠固体以及 5%柠檬酸安瓿）、美兰指示剂管、钯催化剂管、干燥剂。放入已接种好的平板后，尽量挤出袋内空气，然后密封袋口。先折断气体发生管，后折断美兰指示剂管，命名袋内在半小时内造成无气环境。如不突变表示袋内已达厌氧状态，可以孵育。3厌氧手套箱（Anaerobie glove box）是迄今为止国际上公认的培养厌氧菌最佳仪器之一。它是一个密闭的大型金属箱，箱的前面有一个有机玻璃做的透明面板，板上装有两个手套，可通过手套在箱内进行操作，故名。箱侧有一交换室，具有内外二门，内门通箱内先关着。欲放物入箱，先打开外门，放入交换室，关上外门进行抽气和换气（H2，CO2，N2）达到厌氧状态，然后手伸入手套把交换室内门打开，将物品移入箱内，关上内门。箱内保持厌氧状态，也是利用充气中的氢在钯的催化下和箱中钱残余氧化合成水的原理。该箱可调节温度，本身是孵箱或孵箱即附在其内，还可放入解剖显微镜便于观察厌氧菌菌落，这种厌氧箱适于作厌氧细菌的大量培养研究，大量培养基可放入作预还原和厌氧性无菌试验。金属硬壁型厌氧箱的抽气、充气、厌氧环境和温度等均系自动调节。4.厌氧盒：原理同厌氧袋，有成品销售。5.生物耗氧法：在一密闭的容器内放以生物（多是植物），消耗氧气，同时产生二氧化碳，供细菌生长用。我没见过。6.焦性末食子酸法：在一洁净的玻片上铺上纱布或滤纸，均匀撒上焦性末食子酸，然后再混入 NaHCO3 粉末或 NaOH 溶液，迅速将已接种细菌的平板倒扣在上面，用融化的白蜡封边，造成一个封闭空间。焦性末食子酸与碱反应后耗氧。该法用于厌氧不严格的厌氧菌的培养，简单。如有梭状芽孢杆菌。7.疱肉培养基：本身就是一个不需特殊设备的厌氧培养法。疱肉和肉汤装入大试管，液面封凡士林，造成无氧环境。细菌的保存方法1。细菌保存于穿刺培养物中：一般细菌保存于穿刺培养物可以维持两年。具体方法如下：用灭菌接种针挑取分散良好的单菌落，针缓慢穿过琼脂到达瓶底，连续几次，盖上瓶盖拧紧，做好标记。室温下存放于暗处。（最好一点可以将瓶盖放松，在适当温度下培养过夜，再拧紧瓶盖并加封 Parafilm 膜，室温或最好在 4 度避光保存）。2。细菌保存于含有甘油的培养物中：（1）：在液体培养基中生长的细菌培养物：取 0.85ml 细菌培养物，加入 0.15ml 高压灭菌甘油，振荡培养物使甘油分布均匀，然后转移到标记好的保存管内，密封，在乙醇干冰或液氮中冻结后再转至70 度长期保存。在复苏时，用灭菌接种针刮取冻结的培养物表面，然后立即把黏附于接种针上的细菌划于含适当抗生素的 LB 琼脂平板表面，于 37 度过夜。（2）：在琼脂平板上生长的细菌培养物：从琼脂平板表面刮下细菌放入装有 2mlLB 的无菌试管内，再加入等量的含有 30灭菌甘油的LB 培养基，振荡使甘油完全分布均匀后，分装于无菌保存管内，密封，再按前述方法冰冻保存。这一方法的优点在于可用于保存在质粒载体上建立的 cDNA 文库。测定细菌数量的方法1、计数器测定法：即用血细胞计数器进行计数。取一定体积的样品细胞悬液置于血细胞计数器的计数室内，用显微镜观察计数。由于计数室的容积是一定的(O.1mm3) ，因而根据计数器刻度内的细菌数，可计算样品中的含菌数。本法简便易行，可立即得出结果。本法不仅适于细菌计数，也适用于酵母菌及霉菌孢子计数。2、电子计数器计数法:电子计数器的工作原理是测定小孔中液体的电阻变化，小孔仅能通过一个细胞，当一个细胞通过这个小孔时，电阻明显增加，形成一个脉冲，自动记录在电子记录装置上。该法测定结果较准确，但它只识别颗粒大小，而不能区分是否为细菌。因此，要求菌悬液中不含任何碎片。3、活细胞计数法常用的有平板菌落计数法，是根据每个活的细菌能长出一个菌落的原理设计的。取一定容量的菌悬液，作一系列的倍比稀释，然后将定量的稀释液进行平板培养，根据培养出的菌落数，可算出培养物中的活菌数。此法灵敏度高，是一种检测污染活菌数的方法，也是目前国际上许多国家所采用的方法。使用该法应注意：一般选取菌落数在 30300 之间的平板进行计数，过多或过少均不准确；为了防止菌落蔓延，影响计数，可在培养基中加入O0012，3，5 一氯化三苯基四氮唑(TTC)；本法限用于形成菌落的微生物。广泛应用于水、牛奶、食物、药品等各种材料的细菌检验，是最常用的活菌计数法。 4、比浊法比浊法是根据菌悬液的透光量间接地测定细菌的数量。细菌悬浮液的浓度在一定范围内与透光度成反比，与光密度成正比，所以，可用光电比色计测定菌液，用光密度(OD 值) 表示样品菌液浓度。此法简便快捷，但只能检测含有大量细菌的悬浮液，得出相对的细菌数目，对颜色太深的样品，不能用此法测定。5、测定细胞重量法此法分为湿重法和干重法。湿重法系单位体积培养物经离心后将湿菌体进行称重；干重法系单位体积培养物经离心后，以清水洗净放人干燥器加热烘干，使之失去水分然后称重。此法适于菌体浓度较高的样品，是测定丝状真菌生长量的一种常用方法。6、测定细胞总氮量或总碳量氮、碳是细胞的主要成分，含量较稳定，测定氮、碳的含量可以推知细胞的质量。此法适于细胞浓度较高的样品。7、颜色改变单位法（colour change unit,简称 CCU）这种方法通常用于很小，用一般的比浊法无法计数的微生物，比如支原体等，因为支原体的液体培养物是完全透明的，呈现为清亮透明红色，因此无法用比浊法来计数，由于支原体固体培养很困难，用 cfu 法也不容易计数，因此需要用特殊的计数方法，即 CCU 法。它是以微生物在培养基中的代谢活力为指标，来计数微生物的相对含量的，下面以解脲脲原体为例，简单介绍其操作：（1）.取 12 只无菌试管，每一管装 1.8ml 解脲脲原体培养基。（2）.在第一管加入 0.2ml 待测解脲脲原体菌液，充分混匀，从中吸取 0.2ml 加入第二管，依次类推， 10 倍梯度稀释，一直到最末一管（3）.于 37 度培养，以培养基颜色改变的最末一管作为待测菌液的 CCU，也就是支原体的最大代谢活力，比如第六管出现颜色改变，他的相对浓度就是 10 的 6 次方 CCU/ml.一般来说，比浊法和菌落计数法就可以满足绝大多数细菌的计数，但是对支原体这样比较特殊的微生物，用 CCU 法比较合适。 测定微生物生长的方法很多，各种方法均有其优缺点，也不是在任何情况下都适用。在微生物学工作中一般常用的是平皿菌落计数法、计数器法和比浊法。至于哪种方法比较适合你，得根据你的具体条件而定。 细胞学技术概述及注意事项：细胞学检查包括有细胞的涂片与染色技术，其来源先于组织切片技术，目前是较为常用的病理检查方法之一。它所运用的范围也很广泛，如女性生殖系统、食管、胃、肺、浆膜腔积液、泌尿管道、鼻咽部等部位的脱落癌细胞，以及胸、腹腔的肿块、淋巴结、乳腺、和其它组织器官的细胞学诊断。标本采集注意事项：1、要在较为准确病变的部位采集病变标本。2、标本应及时处理，固定。以防止细胞自溶腐败。 3、避免异物掺入标本，如血液、粘液。4、无菌操作，动作快，以防止并发症和扩散。标本采集 ：1、直接法：在女性的外阴、阴道等部位采集时，要求患者在取材前一天避免性生活，盆溶、阴道灌洗、涂药和月经期。此法可用鼻咽、眼结合膜、皮肤、口腔和肛管、咽管等部位。2、磨擦法：使用工具如海绵磨控器、线网套和气囊等，用于鼻咽、食管、胃等处。3、自行分泌：1）痰液：患者人深处咳出可疑痰液，如含有血液，立即涂片并固定。此法可用于呼吸道恶性病变，肺石棉沉着及肺霉菌感染等病。当出现嗜酸性粒细胞时也可用于过敏性哮喘的诊断参考。2）尿液：以离心后取其沉淀物。 3）乳腺分泌物：于患处按摩挤出分泌物作涂片，或用针吸法后涂片检查。4）前列腺液：按摩腺部取分泌物。标本固定 ：涂片在尚未完全干燥时，投入固定剂中固定。以防止涂片细胞脱落。一般时间为 10-30min。常用固定剂可选用：95乙醇、乙醚乙醇（乙醚与 95乙醇 1：1 混合），20甲醛，甲醇及 Carnoy 液巴氏染色法：试剂配制：OG6 染液 桔黄 G0.5g 95乙醇 100ml 磷钨酸 0.015g EA36 染液 0.5亮绿 SF 水溶液 15ml 0.5伊红 Y 水溶液 45ml 0.5俾士麦棕水溶液 10ml 磷钨酸0.2g 碳酸锂饱和水溶液 1 滴染色方法 1、涂片固定后经梯度乙醇至水。2、苏木素液染 510min。流水冲洗返蓝。3、OG6 染液 1-2min 后，用 95乙醇洗两次。 4、入 EA36 或 EA65 染液 23min。5、用 95乙醇洗两次，分色。6、梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。结果：细胞核呈蓝色。表层扁平细胞质粉红色。中间与基底旁细胞胞质蓝至绿色。建立一种粪便细菌学检验的新方法-肠道菌谱分析（初步报告）摘要目的 建立一种以粪便标本细菌菌谱分析为主要内容的细菌学检验方法。方法 取粪便标本直接涂片做革兰染色，镜检观察标本中细菌数量、种类及比例，并进行显微照相；对粪便标本进行菌群培养，分离病原菌，并与镜检结果进行对照；将照片进行分类，建立菌群失调和病原菌感染的图谱。同时以正常大便菌谱作对照。结果 因菌群失调导致的腹泻，直接镜检表现为细菌数量和种类普遍减少，或某一类细菌增多或减少，或呈单一种类细菌；由某种病原菌引起的腹泻，直接涂片多数只能见到革兰阴性杆菌，且细菌数量少或极少，一般均与培养结果相符。结论 粪便细菌菌谱分析能直接或间接为临床提供腹泻患者的肠道微生态资料，尤其能准确地提示因各种原因造成菌群失调而导致的腹泻，为临床诊断和制定治疗方案提供快捷、科学的依据。 关键词腹泻 菌群失调 菌谱分析 粪便 中图分类号 R4422 文献标识码A 文章编号1671-9638 (2005)02-0120-05 长期以来，粪便标本细菌学检验主要是以分离沙门菌属和志贺菌属细菌为目的。但随着新的腹泻病原菌的不断被发现以及各种因素造成菌群失调引起的腹泻不断增多，传统的粪便细菌学检验方法和内容已不能满足现代医学诊治的要求。我们通过建立粪便涂片细菌菌谱，对粪便标本进行病原菌分离培养，及对肠道菌菌谱的分析，为临床提供真实可*的病因病原学诊断依据。 1 材料与方法 1.1 材料1.1.1 标本来源 粪便标本 568 份，均取自 2003 年 5-12 月来我院就诊的腹泻患者。其中门诊患者 54 份，住院患者 484 份；男性 356 份，女性 212 份； 60 岁的老年人 74 人份。对照粪便（性状：软、成形）60 份，即每做 10 份标本加l 个对照。1.1.2 培养基 5 羊血平皿（BA）、SS 平皿、l % 山梨醇麦康凯平皿（Mac ) ，均按标准自制。培养基干粉、药敏纸片、诊断药敏纸片等购自法国梅里埃生物有限公司；生化鉴定管购自杭州天和微生物生物试剂有限公司。1.1.3 诊断血清 霍乱弧菌、肠致病性大肠埃希菌( EPEC）、沙门菌属和志贺菌属诊断血清，均购自卫生部兰州生物制品研究所。1.1.4 显微镜（OLYMPUS) BX41 显微镜及 JVCTK-C1381EG 彩色摄像仪，购自朗咖生物医学工程有限公司。1.2 方法1.2.1 涂片染色 568 份腹泻粪便标本和 60 份正常对照粪便标本均直接涂片，革兰染色，置油镜下镜检，详细记录各类细菌形态、大致数量及比例，并进行显微照相，标码后存于电脑中。对照组直接涂片镜检，油镜下印象：各类细菌均有分布，数量约 500-5000 个/油镜视野（婴幼儿粪便细菌量较成人少）。革兰阳性（G +）杆菌、革兰阴性（G-）杆菌、G+球菌、G-球菌等 4 种菌的比例约为 60:35:4:1，优势菌为 G +杆菌。1.2.2 菌群培养 取每份粪便标本分别接种营养平皿做 4 区划线（评估菌量），置 36 温箱 24,48,72h 后观察细菌（需氧菌）在营养平皿 4 区上的生长情况。用打加号的方法记录细菌的生长量，即4 个划线区都有菌（每一区菌落数10 个，下同）打 4 + ; l,2,3 划线区有菌打 3 +; l、2 区有菌打 2+; 1 区有菌打 l +。同时观察细菌在此培养基上的形态特征及各菌种间的比例，必要时挑取可疑菌落做革兰染色，以便对菌谱分析结果作出初步判断。对照组菌群培养：4 个划线区菌量丰富可打 4。平皿上菌落较纯，为 G-杆菌（未作厌氧培养）。1.2.3 分离培养 各取一环标本分别接种 BA , SS , Mac3 种培养基，36 培养 24 , 48 , 72h ，记录细菌在各种培养基上的生长情况，挑取可疑菌落（无色透明不发酵乳糖或迟缓发酵乳糖菌落）进行菌种鉴定。对照组分离培养：上述培养基上均未见到可疑菌落。1.2.4 血清学鉴定 对疑似致病性大肠埃希菌菌落用 EPEC 抗血清做凝集试验；对疑似霍乱弧菌、沙门菌、志贺菌菌落分别用相应的抗血清做凝集试验。1.2.5 药敏试验 对检出的致泻菌按照美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）的要求，采用 K-B 法做药敏试验。2 结果2.1 粪便标本革兰染色镜检 其菌群象大致分为以下几种类型。（l）成形、软的正常粪便菌群象：一般是细菌量丰富，G+菌与 G-菌比例恰当，细菌的形态呈现多样性，优势菌为 G+杆菌。（2）粘液样脓血便菌群象：多数只见到 G-杆菌，细菌量少或极少。（3）稀糊样便菌群象：正常与异常菌群象并存（因为婴幼儿粪便多以稀糊样便为主），以 G+球菌为主者，成双、成链或成堆排列；有部分菌群象中可见到多量或少量真菌抱子及菌丝；以 G-杆菌为主者细菌常呈多形性，而培养细菌种类比较单一。（4) 水样稀便菌群象：有相当一部分菌量稀少，或者单独以 G+球菌或 G-杆菌或真菌为优势菌，有些标本甚至观察不到细菌。各类菌群象见彩图 1-9 （插页）, 涂片染色镜检片印象见表 l 。2.2 菌群培养 分别于 24 , 48 , 72h 观察 4 区划线的营养平皿。成形软便标本经过培养，4 区菌落都很丰富，可打 4 +（且基本以为 G-杆菌为主）。脓血便标本经培养后，平皿上菌落数较前一种标本要少很多，多数只有 1,2 区有菌,而 3 ,4 区无菌或菌落极少，可见到 1-3 种菌落，多为 G-杆菌；有可疑菌落，需进行分离鉴定。稀糊样便经培养后，菌落数有部分丰富，部分稀少，前者可以打 4 +，后者则打 12 + ；这种性状的标本多数可培养出 1 种以上的细菌，有部分以 G-杆菌为优势菌，有部分以 G+球菌为优势菌，有部分可同时见到 G+球菌和杆菌（服整肠生后，粪便中可见到 G+杆菌）及真菌 3 种或 3 种以上菌落，还有部分则以真菌为优势菌。水样稀便经培养后，多数菌落稀少，可单独以 G-杆菌或 G+球菌或真菌或 G+杆菌为优势菌，也可几种菌同时出现，另有一些标本，在上述几种培养基上经 72h 培养后仍无细菌生长。2.3 分离培养 在进行上述 2 项试验的同时，做分离培养。成形软便经培养，在选择和非选择培养基上，一般找不到致泻菌落。脓血便培养，在选择培养基上可见到 2 种或 2 种以上菌落，多数可找到致泻菌。稀糊和水样稀便经培养，如 G-杆菌为优势菌，则 BA 和选择培养基上都可有多量或少量菌生长，同时可找到致泻菌菌落；如以 G+菌为优势菌，则 BA 上可见到多量或少量 G+菌菌落，真菌菌落；选择培养基上无细菌生长（真菌和肠球菌可在选择培养基上生长）。将分离出的疑似致泻菌进行系列生化鉴定及血清学鉴定, 568份标本分离出致泻菌 15 种 302 株，见表 2 。2.4 菌谱分析 （l）成形软便菌群象：细菌量丰富，分布均匀，两种染色性状细菌及各种类型的细菌比例基本恰当，未分离出可疑菌落（致泻菌）的标本可向临床发出“未检出致病菌”( BA，SS，Mac）的报告。(2）粪便为粘液脓血便，其菌群象为单一的 G-杆菌，细菌量少甚至极少，培养基上能见到可疑病原菌菌落，经生化系列鉴定、血清学鉴定，并做药敏试验，向临床发出鉴定及药敏报告。（3）粪便为稀糊样或水样，其菌群象则为 G+球菌、杆菌及 G-杆菌、真菌孢子、菌丝，菌量或多或少，呈纯菌或无菌；培养有多量或少量G+球菌菌落、酵母样真菌菌落，或为某种菌的纯培养，或各培养基上无菌生长（24h , 48h , 72 h 培养），对上述菌落可做鉴定，并根据菌群象、菌群培养、分离培养粗略估计某种菌的百分比，向临床发出“XXX 菌”、“无细菌生长”( BA，SS，MaC，营养平皿），提示“菌群失调”报告，不报告分离菌的药敏结果。各科室菌谱分析统计结果见表 3 。2.5 粪便涂片与分离培养结果 对照 302 份阳性标本粪便涂片与分离培养结果相符，67 份不相符。见表 4 。3 讨论在人类肠道中存在着大量的微生物（如细菌、原虫、病毒等），其中主要是细菌，约占粪便固体总量的 20-30 % ，正常人粪便中的菌群分为常居菌和过路菌两大类，在这些菌中 99以上是厌氧菌（多数为 G+杆菌），需氧菌不到 1。乳婴粪便中多为 G+菌（为嗜酸性乳杆