大花萱草新品种“御衣黄”组织培养及植株再生

第3 8卷第3期 2 0 1 1年6月 江苏林业科技 Journal of Jiangsu Forestry Science&Technology Vo13 8 No3 Jun2 0 1 1 文章编号：10017380(2011)03001205 大花萱草新品种“御衣黄”组织培养及植株再生 何月秋，祝志勇 (宁波城市职业技术学院环境学院，浙江宁波315502) 摘要：以大花萱草“御衣黄”花蕾为外植体建立其组织培养再生体系。研究结果表明，大花萱草“御衣黄”花蕾经 75乙醇30 S+01升汞10 min处理后可获得较为理想的灭菌效果；诱导培养基MS+6-BA 5 mgL+NAA 5 mgL是花蕾理想的脱分化培养基，愈伤组织诱导率达到75；在降低了激素质量浓度的培养基MS+6-BA 15 mgL+NAA 03 mgL能促进愈伤组织增殖和分化，不定芽分化率457；在生根培养基为12 MS+NAA 01 mgL中，组织培养苗生根率可达917，且大花萱草“御衣黄”组织培养苗移栽1个月后成活率可达到100。 关键词：大花萱草“御衣黄”；花蕾；愈伤组织；植株再生 中图分类号：s68219 文献标识码：A Tissue culture and plant regeneration of Hemerocallis middendorfii HE Yueqiu，ZHU Zhiyong (Faculty of Environmental Science，Ningbo City College of Vocational Technology，Ningbo 315502，China) Abstract：An in vitro plant regeneration system of Hemerocallis middendoi was established using buds as explants in the articleResults showed that the optimum sterilization method was 75alcohol soaking 30 seconds and 01HgC12 treat ment 10 minutes for explantsThe optimum callus inducing medium was Murashige and Skoog(MS)+NAA 05 mgL 6-BA 30 mgL with an induction rate of 75Callus was proliferated and adventitious buds were effectively generated on MS+6-BA 15 mgL+NAA 03 mgL with a differentiation rate of457The best rooting medium was 12 MS+ NAA 01 mgL with a rooting rate 917The plantlet was transplanted with a transplanting survival rates up to 100af- ter one month Key words：Hemerocallis middendorfii；Buds；Callus；Plant regeneration 大花萱草(Hemerocallis middendoi)新品种“御 衣黄”是由国外引入并新育成的品种，花形较大，花 色为醒目的橙黄色，6月初开花持续到10月上旬， 花期长达4个月，适应性强，管理较粗放，同时“御 衣黄”在江浙地区四季常绿，在大花萱草中颇为稀 少。它不仅是优良的地被植物，而且还是深受欢迎 的庭院植物，广泛用于庭院绿化，盆栽观赏，花境设 计以及艺术插花中，具有广阔的开发前景。经过栽 培观察，大花萱草“御衣黄”品种自然结实率低，通 常采用分株繁殖，每株每年只能年繁殖45株。采 用组织培养繁殖不仅可提高繁殖系数，还不受季节 限制，可加快其繁殖速度，满足市场需求。相关文献 表明，早在1990年，郭达初等就以大花萱草杂交品 种的花茎为外植体，成功获得生根苗 。随后一些 大花萱草的新品种如“金娃娃”、“红运”、“奶油卷” 等获得组织培养再生体系，部分品种甚至实现商业 化生产 “ ，然而对“御衣黄”品种的组织培养研究 尚未见报道。因此探索大花萱草“御衣黄”的组织 培养关键技术，实现其规模化繁殖，不但可丰富园林 绿化植物品种，满足市场需求，同时也可为大花萱草 的新品种选育提供技术平台。 收稿日期：2011-0313 基金项目：宁波市农业科研公关项目(2009C10019) 作者简介：何月秋(1975一)，女，四川成都人，讲师，博士，主要从事植物组织培养研究。Email：18848406qqcon。 第3期 何月秋等：大花萱草新品种“御衣黄”组织培养及植株再生 l3 1 材料与方法 11 大花萱草“御衣黄”初代培养物的建立 以宁波鄞州绿城园艺花卉培育基地种植的大花 萱草“御衣黄”花蕾为外植体。6月从田问将幼小花 苞(长度为15 cm左右)连同花梗采回实验室。先 用洗涤精进行表面清洗，后用流水冲洗45次。分 装好后移至超净工作台用75乙醇浸泡后在01 升汞中进行振荡灭菌处理，用无菌水冲洗56次， 用消毒滤纸吸干花蕾表面水分，然后用解剖刀将花 蕾顶部切除并露出子房，再对半剖开接种至添加有 不同种类和质量浓度激素的诱导培养基中。其中， 75乙醇浸泡的时间分别设为5，1O，15，20，30，40 S；01升汞的灭菌时间分别设为7，10 rain，具体实 验设计如表1。 表1 不同灭菌方法中灭菌剂种类及处理时间 灭菌剂种类及处理时间 ，【L 75乙醇 处理时间s 01升汞 处理时间min S1 、 5 、 7 S2 、 10 、 7 S3 、 15 、 7 s4 V 20 、 l0 s5 、 3O 、 1O S6 V 40 、 l0 12大花萱草“御衣黄”愈伤组织的诱导 将经过灭菌处理的花苞对半切割开接种至以 MS为培养基附加不同质量浓度6BA、NAA的诱导 培养基中。其中6-BA设10，30，50 mgL，NAA 设05，10，30，50，70 mgL，采用正交的方法共 l5个诱导培养基，每种诱导培养基接种407O个 花蕾。定期观察并记录花蕾生长情况，30 d后统计 各组实验的愈伤组织诱导率、愈伤组织的生长情况。 13 大花萱草“御衣黄”愈伤组织增殖与分化 将已经诱导形成的愈伤组织接种至以MS为基 本培养基且添加有不同质量浓度6一BA为10，15， 20 mgL；NAA为02，03，05 mgL的愈伤组织 增殖和分化培养基中，每5 d观察并记录愈伤组织 的生长情况，20 d后统计愈伤组织的分化情况和不 定芽的生长状况。 14大花萱草“御衣黄”不定芽的生根及组织培养 苗的移栽 不定芽长至23 cm时，将不定芽分割成单个 外植体，以12 MS为基本培养基附加NAA，IBA、活 性炭的生根培养基中。转接10 d后开始观察记录 苗的生根情况，30 d后统计苗生根率和苗生长情 况，继续培养1个月后进行移栽。 以上培养基中除生根阶段白糖的质量分数为 15而外，其他阶段白糖均为3，琼脂为07， pH值调至60。培养室内控制恒温(251)oC，光 照为40zmol(m s)，光照时间为每天14 h。 2结果与分析 21 不同灭菌方法对大花萱草“御衣黄”花蕾无菌 体系建立的影响 大花萱草“御衣黄”花蕾属比较幼嫩的器官，如 果灭菌方法使用不当容易导致外植体的死亡。本实 验体系分别采用了6种灭菌处理方法，具体实验情 况见表1，2。在升汞处理时间一定的条件下，外植 体的死亡率随乙醇的处理时间增加而升高；同时外 植体的污染率也随升汞与乙醇的处理时间增加而减 少。这表明，乙醇处理时间过长容易导致外植体死 亡，然而乙醇处理时间短则容易导致灭菌效果不理 想。同样，当乙醇处理时间一致的情况下外植体的 污染率随着升汞处理的时间增加而减少，但死亡率 也同步上升。结合实验结果和提高灭菌效率认为， 75乙醇30 S+01升汞10 min是大花萱草“御 衣黄”花蕾适宜的灭菌方法。这一结果与相关资料 的结果基本一致 。 表2不同灭菌方法对外植体的影响 灭菌接种总数 污染数 污染率 死亡数 死亡率 法 7 ， ， ， S2 S3 S4 S5 ,56 65 55 50 69 64 14 9 l1 5 2 215 3 l64 5 22O 5 072 9 031 14 59 1O9 128 141 226 22激素对大花萱草”御衣黄”愈伤组织诱导的 影响 将大花萱草“御衣黄”花蕾接种至愈伤组织诱 导培养基中，经过观察，一般60 d左右外植体可脱 分化形成愈伤组织，少数可形成不定芽(如图1所 示)。实验表明，在不同诱导培养基中，花蕾脱分化 后愈伤组织的诱导率和质地均有较大差异。NAA 质量浓度低于10 mgL、6-BA质量浓度低于30 14 江苏林业科技 第38卷 mgL时，大花萱草“御衣黄”花蕾愈伤组织诱导率 为0；当培养基中NAA在3050 mgL，花蕾逐渐 分化出疏松、黄绿色的愈伤组织，并随着6-BA质量 浓度的增加，愈伤率逐渐上升，在诱导培养基MS+ 6BA 5 mgL+NAA 5 mgL中，愈伤组织诱导率可 达到75；当培养基中NAA为70 mgL时，花蕾 分化出疏松、乳白色的愈伤组织，并随着6一BA质量 浓度的增加，愈伤率逐渐上升，在诱导培养基MS+ 6-BA 5 mgL+NAA 7 mgL中，愈伤组织诱导率可 达到896(见表3)。这表明，高质量浓度的6BA 和NAA是大花萱草“御衣黄”花蕾脱分化的必要条 件，同时随着2种激素质量浓度的增加，愈伤组织的 质地也由致密变得疏松，颜色也逐渐由黄色变为乳 白色。不过，后续继代实验发现，黄色的愈伤组织有 利于不定芽的形成。因此，综合愈伤组织的诱导率 和质地认为，MS附加NAA 50 mgL和6-BA 50 mgL是大花萱草“御衣黄”花蕾理想的诱导培 养基。 图1愈伤组织的诱导 23 激素对大花萱草“御衣黄”愈伤组织增殖与分 化的影响 将诱导形成的愈伤组织接种(每种分化培养基 接种愈伤组织30块)至分化培养基中，30 d后淡黄 色瘤状的愈伤组织逐渐变绿，并形成大量嫩绿的不 定芽(见图2)；但疏松、乳白色的愈伤组织虽能增殖 但不能形成不定芽。在低生长调节物质的培养基中 愈伤组织既不增殖，也不分化；在含有高质量浓度 6-BA和NAA培养基中，均有不定芽的发生，但分化 的频率有较大的差异(见表4)。细胞分裂素6-BA 对大花萱草“御衣黄”不定芽的形成作用非常关键， 6-BA质量浓度低于10 mgL时，不定芽的诱导率 为0；6一BA质量浓度在15 mgL以上时，不定芽的 表3不同激素组合及其质量浓度对愈伤组织诱导的影响 培养慕 接种外 产生愈伤 愈伤组织 愈伤组织 6-BA NAA 植体块组织数块诱导率 的生K状态 (mgI )(mgI ) 敛街、黄绿色 致镥、黄绿色 敛密、黄绿色 致密、黄绿色 疏松、黄绿色 疏松、黄绿色 疏松、楚绿色 疏松、乳lt色 疏松、乳门色 疏松、乳t1色 表4不同外源激素配比对愈伤组织分化的影响 (NAnlgAL) mgAL)愈 织不 导 生长状态 ( )( ) 块 率 4 6 9 O 5 0 O 6 O O O O O 4 7 眇 O O O 0 0 2 5 7 5 5 5 0 0 O 3 3 l 3 5 l 3 5 1 3 ：合 第3期 何月秋等：大花萱草新品种“御衣黄”组织培养及植株再生 l5 诱导率明显增加，最高达到95。但6-BA质量浓 度在30 mgL以上时，形成的不定芽生长状态逐渐 变差，叶片卷曲甚至畸形，出现玻璃化趋势(甚至死 亡)。NAA在02，03和05 mgL 3个水平变化 时，对愈伤组织和不定芽增殖影响较大。NAA质量 浓度在02 mgL时，愈伤组织几乎不能增殖；而 NAA质量浓度为05 mgL时，愈伤组织增殖速度 很快，但容易出现褐变，且形成的不定芽叶片干枯、 甚至死亡。说明，细胞分裂素和生长素之间适宜的 配比对大花萱草“御衣黄”愈伤组织的增殖、形成生 长正常的不定芽起着关键性的作用。综合多方面因 素，大花萱草“御衣黄”愈伤组织分化培养基选择 MS+6-BA 15 mgL+NAA 03 mgL，在该培养基 中，愈伤组织既能较快增殖也能形成不定芽。 图2不定芽的分化 24激素对大花萱草“御衣黄”组织培养苗生根的 影响 植株生根之前，将丛生芽转移至不添加任何激 素的12 MS培养基中进行壮苗培养，待芽丛长至2 cin左右，单植株切下接种至生根培养基。15 d后大 花萱草“御衣黄”组织培养苗开始生根，新生长根吸 收营养物质后会明显促进植株生长，20 d后组织培 养苗可生根13条，长成粗状的根系后，植株高可 长N335 cm(见图3)。各处理对大花萱草“御衣 黄”组织培养苗生根率影响较大，不但生根率差异 明显，而且苗的长势也有不同(见表5)。初步实验 表明，大花萱草“御衣黄”组织培养苗在添加有NAA 的G1培养基中获得较好的诱导效果，生根率达到 917；而在添加有IBA的G2培养基效果次之，生 根率只有842；在相同的激素水平下，添加活性 炭生根率明显降低，生根率仅在30左右，但组织 培养苗的叶色转绿，叶尖仅仅少量出现发枯情况。 这说明培养基添加活性炭可改善组织培养苗的生长 环境，提高苗的生长势；但同时也会吸附部分生长 素，导致生根率降低。因此，添加活性炭的生根培养 基需适当加大生长素的用量，以提高组织培养体系 的高效性(相关的生根培养基优化研究尚在进行 中)。组织培养苗生根后继续培养1个月进行炼苗 移栽，成活率可达100(见图4)。 图3生根的大花萱草组织培养苗 图4成活的组织培养移栽苗 表5 大花萱草“御衣黄”组织培养苗生根 16 江苏林业科技 第38卷 3 讨论 大花萱草是一类重要的园林植物，市场应用前 景广泛，近年来不断有新品种引入，其组织培养研究 也倍受关注。资料显示，选择适当外植体是诱导大 花萱草愈伤组织的必要条件，多数使用花茎、茎尖、 花蕾。本实验以大花萱草“御衣黄”花蕾为外植体 成功建立再生体系，说明大花萱草不同品种进行组 织培养诱导使用的起始材料具有共性。然而大花萱 草不同品种之问愈伤组织诱导和分化的条件差别较 大，本体系中MS+6-BA 5 mgL+NAA 5 mgL是大 花萱草“御衣黄”花蕾适合的诱导培养基，而孙月 剑 等研究表明在培养基Ms+BA 0102 mgL +2，4一D 0210 mgL+GA 05 mgL适合于欧 洲矮化大花萱草花蕾愈伤组织的诱导。 愈伤组织增殖和分化是植物组织培养中重要的 一个环节。一般间接器官发生途径中常常使用高质 量浓度的激素以促使外植体脱分化，而形成愈伤组 织后则需降低激素的质量浓度以利于培养物正常的 增殖和分化。本实验中将诱导形成的黄色瘤状愈伤 组织置于降低了激素的MS+6-BA 15 mgL+NAA 03 mgL培养基既可获得较好的增殖效果，也可获 得生长正常的不定芽。实验中发现，愈伤组织形成 后，新增殖的愈伤组织与新芽形成是相伴发生，这与 王晓娟研究结果相似 ，这将有利于建立高频的大 花萱草“御衣黄”组织培养再生体系。 参考文献 1 J 郭达初，刘克斌，柴明良，等大化萱草组织培养快速繁殖【Jj 浙江农业学报，1990，2(3)：l37141 2 王汉海，程贳召，杜延飞大花萱革新品种“金娃娃”的组织培 养和快速繁殖J植物生理学通讯，2002，38(5)：458 3 李艳梅，王桂兰，陈超，等大花萱草新品种“红运”快繁体系 的建立J河南农业科学，2006(8)：120122 4 张伟丽，金欣庆大花萱革新品种奶油卷的组织培养和生 产应用J植物生理学通讯，2007，43(1)：129130 5李成，张建伟大花萱草组织培养与快繁技术_J林业实用 技术，2009(7)：5253 6 姜凤英，栾绍武，吴志刚，等多倍体黄草“金娃娃”的离