生物技术制药

1、生物技术制药：采用现代生物技术可以人为的创造一些条件，借助某些微生物、植物、或动物来生产所需的医药品，称为生物技术制药。生物技术：广义的角度来说是人类对生物资源（包括微生物、植物、动物）的利用、改造并为人类服务的技术。基因工程是核心和关键；酶工程是条件；发酵工程是获得终产物手段；细胞工程是基础。第二代基因工程:蛋白质工程第三代基因工程：海洋生物技术。现在生物药物的四大类型：应用重组dna技术生产的基因重组多肽，蛋白质类药物基因药物，基因疫苗基因治疗剂天然生物药物合成和部分合成的生物药物生物技术药物: 采用DNA重组技术或其他生物技术研制的蛋白质或核酸类药物。不能忘记的人：MendelMende

2、l：遗传学分离规律和自由组合规律。T H Morgan（1866-1945）：一是发现基因在染色体上，二是发现遗传的基因连锁和互换定律。J D Watson F H C CrickJ Crick：DNA双螺旋结构。桑格（英国化学家）最早测定胰岛素的氨基酸顺序获得1958年诺贝尔化奖。吉尔伯特在DNA测序领域，因其卓越的工作获得1980年诺贝尔化学奖。Paul Berg：重组DNA技术之父。二、生物技术药物的特性：分子结构复杂具有种属特异性治疗针对性强、疗效高稳定性差基因稳定性免疫原性体内的半衰期短受体效应多效性和网络效应检验的特殊性第三节、生物技术制药特点高技术高投入长周期高风险高收益第二章基

3、因工程药物生产的基本过程：基因工程药物的生产分为上游和下游两个阶段：上游阶段：主要是分离目的基因、构建工程菌(细胞)。目的基因获得后，最主要的就是目的基因的表达。选择基因表达系统主要考虑的是保证表达的蛋白质的功能，其次是表达的量和分离纯化的难易。此阶段的工作主要在实验室内完成。下游阶段：从工程菌的大量培养一直到产品的分离纯化和质量控制；此阶段是将实验室的成果产业化、商品化，主要包括工程菌大规模发酵最佳参数的确立，新型生物反应器的研制，高效分离介质及装置的开发，分离纯化的优化控制高纯度产品的制备技术，生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造，电子计算机的优化控制等。克隆真核基因常用方法：反转录法和

4、化学合成法。宿主细胞的分类：原核细胞，常用的有大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌等；真核细胞，常用的有酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞。大肠杆菌：表达产物的形式：细胞内不溶性表达（包含体）、胞内可溶性表达、细胞周质表达，极少还可分泌到胞外表达。不同的表达形式具有不同的表达水平，且会带来完全不同的杂质。特征：多为胞内产物；分泌能力不足，真核蛋白质常形成不溶性的包含体(inclusion body)。不存在翻译后修饰作用。多余一个甲硫氨酸残基，容易引起免疫反应。枯草芽孢杆菌：分泌能力强，可将蛋白质产物直接分泌到培养液中，不形成包含体。该菌也不能使蛋白质糖基化，另外由于它有很强的胞外蛋白酶，会对产物进行不同

5、程度的降解，因此，它的应用也受到限制。链霉菌：重要的工业微生物。特点是不致病、使用安全，分泌能力强，可将表达产物直接分泌到培养液中，具有糖基化能力，可做理想的受体菌。Why？2、真核细胞（1）酵母：繁殖迅速，可廉价的大规模培养，而且没有毒性，基因工程操作与原核生物相似，表达产物直接分泌到细胞外，简化了分离纯化工艺;表达产物能糖基化;特别是某些在细菌系统中表达不良的真核基因，在酵母中表达良好。目前以酿酒酵母应用最多。干扰素和乙肝表面抗原已获成功。（2）丝状真菌：很强的蛋白质分泌能力；能正确进行翻译后加工，包括肽剪切和糖基化；而且糖基化方式与高等真核生物相似；丝状真菌（如曲霉）被确认是安全菌珠，有

6、成熟的发酵和后处理工艺。（3）哺乳动物细胞：由于外源基因的表达产物可由重组转化的细胞分泌到培养液中，培养液成分完全由人控制，从而使产物纯化变得容易。产物是糖基化的，接近或类似于天然产物。但动物细胞生产慢，生产率低，而且培养条件苛刻，费用高，培养液浓度较稀。1、载体：表达载体必须具备的条件（1）载体能够独立的复制（需要复制起始点）；（2）具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记。且克隆位点应在启动子序列后，以使克隆的外源基因得以表达；（3）具有很强的Promoter，能为大肠杆菌的RNA聚合酶所识别；（4）具有Repressor，使启动子受到控制，只有当诱导时才能进行转录；（5）具有很强的终止子，以便

7、使RNA聚合酶集中力量转录克隆的外源基因，而不转录无关的基因。（6）所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号，即起始密码AUG和SD序列，以便转录后能顺利翻译。复制子：可以定义为质粒dna中能自主复制并且维持正常拷贝数的一段最小的核算序列单位。真核基因在大肠杆菌中的表达方式：融合蛋白：融合蛋白氨基端是原核序列，氨基端终止子去掉，羧基端是真核序列。见融合蛋白的原则。优点：操作简便；蛋白质在菌体内比较稳定；易高效表达。缺点：只能做抗原；一般不能作为人体注射药物。带有一段原核序列。非融合蛋白优点：能较好的保持原来蛋白的活性。 缺点：易被蛋白酶破坏；N端有甲硫氨酸，易引起免疫反应。 细菌或噬菌体启动子S

8、D序列真核基因的起始密码结构基因终止密码子。分泌型表达蛋白：外源基因融合到编码原核蛋白信号肽序列的下游。优点：分泌表达，在周质中稳定，有活性，不含AUG编码的甲硫氨酸；缺点：产量不高，信号肽不被切割主要元件：启动子和SD序列信号肽序列：SD下游，编码信号肽，可引导蛋白跨膜，切除N端的信号肽（信号肽酶）。细菌或噬菌体启动子SD序列信号肽编码基因真核基因的起始密码结构基因终止密码子。影响目的基因在酵母菌中表达的因素（1）外源基因的拷贝数：高度稳定、高拷贝-高表达（2）外源基因的表达效率：启动子；分泌信号的效率；终止序列的影响（3）外源蛋白的糖基化：酵母分泌的异源蛋白糖基化产物与天然产物完全相同。（

9、4）宿主菌株的影响：菌体生长力强；菌体内源蛋白酶要弱；菌株性能稳定；分泌能力强。“严紧反应”：当氨酰tRNA不足时，核糖体在密码子上停留，并合成被称为“魔点”的ppGpp。表达体系产物产生部位培养方式提纯产物活性潜在危险大肠杆菌多肽蛋白融合蛋白细胞内一般一般对原核生物外源基因一般较好无大致命危险酵母多肽蛋白，糖基化产物细胞内或者细胞外容易 可高产菌体内复杂真核产物接近天然产物一般不大动物细胞完整糖基化蛋白分泌出细胞外不容易获得高产简单与天然蛋白质几乎相同有致癌风险第五节基因工程菌生长代谢的特点大肠杆菌的蛋白/菌体量的比值是基本恒定的。军体生长速度：比生长速率反映了蛋白质生产速度。对菌体生长的调

10、控主要有两种观点：一种认为能量的供应决定了菌体的最大比生长速率；另一种认为是小分子前体和催化组分等的限制决定了菌体的最大比生长速率。碳源物质是组成培养基的主要成分。碳源物质为细胞提供能量能量不足的时候，当菌体生长所需能量大于菌体有氧代谢所能提供的能量时，菌体往往会产生代谢副产物-乙酸。高浓度的乙酸能明显抑制菌体的生长。培养方法中的措施:分批培养中选用不同的碳源补料培养中控制补料速度连续培养中控制稀释速率通过控制菌体的生长，从而控制乙酸的产生，减少抑制作用，以实现高密度培养和重组产物的高表达水平。加入甲硫氨酸和酵母提取物都能减少乙酸的产生：前者提高菌体有氧代谢，后者减少葡萄糖的摄入。减少乙酰辅酶

11、A的积累。实质：控制菌体的糖酵解速度，使之低于三羧酸循环和呼吸链的最大代谢能力，从而避免乙酰辅酶A的积累和乙酸的产生。代价：降低供能速度或前体供应速度来降低蛋白合成和菌体生长速度。二、菌体生长与前体供应的关系在基础培养基中加入氨基酸（小分子前体）能使菌体比生长率提高，蛋白合成增加。小分子前体量和催化结构是有限，基因工程菌质粒的复制和外源基因的转录和翻译需要与宿主细胞竞争共同的前体和催化结构，从而加剧了这些成分的不足，因而在同样的培养基中，工程菌的比生长速率往往低于其宿主细胞，特别是工程菌诱导后，由于外源基因的大量表达，引起菌体比生长速率下降，甚至生长停滞。中等拷贝质粒（56拷贝）这些酶的基因大

12、多受终产物的反馈调节。高拷贝质粒的工程菌（240拷贝）中，生长速率和菌体，总蛋白合成均减少。这与工程菌大量前体被利用引起前体不足，从而产生“严紧反应”有关。基因工程菌在传代过程中常出现质粒不稳定的现象。稳定性至少要维持25代以上质粒不稳定可分为：分裂不稳定指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象。含质粒的细菌比wt细菌长的慢。结构不稳定指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。二、提高质粒稳定性的方法：1、选择合适的宿主菌2、选择合适的载体：3、选择压力4、分阶段控制培养：先使菌体生长至一定密度；再诱导外源基因的表达5、控制培养条件6、固定化：一、基因工程菌的培养方式1

13、. 分批培养2. 补料分批培养3. 连续培养4. 透析培养5. 固定化培养包涵体：包含体产生原因新肽链聚集速率超过蛋白正确折叠速率缺乏蛋白合成所需的酶和辅助因子包含体表达形式的优点：高密度，易于分离纯化，能简化外源基因表达产物的分离操作；有效地抵御了大肠杆菌中蛋白酶对目的蛋白的降解，在一定程度上保持表达产物的结构稳定对宿主细胞无毒害。包含体表达形式的缺点：以包含体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性，必须通过有效的，必须通过有效的变性复性操作，才能回收得到具有正确空间构象（因而具有生物活性）的目标蛋白，才能回收得到具有正确空间构象（因而具有生物活性）的目标蛋白，体外复性蛋白质的成功率相当低，

14、一般不超过30%分离纯化的基本过程：发酵液细胞分离胞内产物细胞破碎固液分离包涵体变性复性浓缩初步分离高度纯化制剂产品胞外产物直接浓缩初步分离高度纯化产品细胞破碎的方法：1物理破碎法：高压匀浆法高速珠磨法超声破碎高压挤压法（X-PRESS）2化学破碎法：渗透冲击增溶法脂溶法3生物法酶溶法非蛋白质类的去除：（1）DNA的去除（2）热原质的去除（3）病毒的去除DNA在pH4.0以上呈阴离子，蛋白质的pI在6.0以上,可用阴离子交换剂吸附除去。 如蛋白质为强酸性，可选择条件使其吸附在阳离子交换剂上，而DNA不吸附。如蛋白质为强酸性，可选择条件使其吸附在阳离子交换剂上，而DNA不吸附。 亲和层析和疏水层

15、析也有效。热原质的去除：热原质是肠杆菌科产生的细菌内毒素细菌内毒素（脂多糖）去除困难。分子量小的多肽或蛋白质中的热原可用超滤或反渗透，脂多糖是阴离子可用阴离子交换层析除去，脂多糖是疏水性可用疏水层析法。病毒的去除 ：层析或过滤可将病毒去除。动物细胞的形态：贴壁细胞：悬浮细胞：兼性贴壁细胞生理特性：细胞的分裂周期长：1248h细胞生长需要贴附于基质并且有接触抑制现象正常二倍体细胞传代数有限培养基要求高蛋白质合成途径和修饰功能与原核细胞不同原代培养：从体内取出的组织细胞进行体外接种培养，培养的从体内取出的组织细胞进行体外接种培养，培养的第1代细胞与传10代以内的细胞称为原代细胞培养。原代培养的细胞

16、生长分裂并不旺盛，与体内细胞相似，适合于药物检测实验。传代培养：将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为传代培养。动物细胞的培养条件和培养基细胞体外培养基本条件:? 无菌? 营养充足,防止有害物质? 适量的氧气? 随时清除代谢有害物质? 良好的生存外环境（PH、渗透压、离子浓度）? 及时分种，保持合适的细胞密度培养条件：器材的清洗：清洗要求比细菌培养高。关键在于防止微生物污染水质：电阻值大于18兆欧姆Ph：动物细胞培养最适ph7.27.4.常用的缓冲溶液：磷酸氢二钠磷酸二氢钠；碳酸氢纳和二氧化碳；tris-gly缓冲液。渗透压290300mosm

17、/kg 通过加减Nacl的方法，1mg Nacl =32omsm/kg.温度37度空气不同比例的氧气氮气二氧化碳以及空气。动物细胞大规模培养的方法：1悬浮培养2贴壁培养3假悬浮培养：微载体培养包埋和微囊培养结团培养兼具单层培养和悬浮培养的优势，且是均相培养。可创造相当大的贴附面积，载体体积较小，比重较轻，在轻度搅拌下即可携带细胞自由地悬浮在培养基内，载体体积较小，比重较轻，在轻度搅拌下即可携带细胞自由地悬浮在培养基内，发挥悬浮培养的特长发挥悬浮培养的特长。培养操作可系统化、自动化，障低了污染发生的机会。操作方式1分批式操作分批式培养是指将细胞和培养液一次性装入反应器内，进行培养，细胞不断生长，

18、产物也不断形成，经过一段时间反应后，将分批式培养是指将细胞和培养液一次性装入反应器内，进行培养，细胞不断生长，产物也不断形成，经过一段时间反应后，将整个反应系取出。缺点：细胞所处的环境时刻都在发生变化，不能使细胞自始至终处于最优条件下，在这个意义上它并不是一种好的操作方式。，不能使细胞自始至终处于最优条件下，在这个意义上它并不是一种好的操作方式。优点：操作简便，容易掌握，因而又是最常用的操作方式。分批式培养过程中，细胞的生长可分为延迟期、对数生长期、减速期、平稳期和衰退期分批式培养过程中，细胞的生长可分为延迟期、对数生长期、减速期、平稳期和衰退期5个阶段。半连续式操作?半连续培养又称为反复分批

19、式培养或换液培养，是指在分批式操作的基础上，是指在分批式操作的基础上，不全部取出反应系，剩余部分重新补充新的营养成分，再按分批式操作的方式进行培养，这是，剩余部分重新补充新的营养成分，再按分批式操作的方式进行培养，这是反应器内培养液的总体积保持不变反应器内培养液的总体积保持不变的操作方式。3. 灌流式操作? 高密度培养动物细胞时，必须确保补充给细胞以足够的营养以及去除有毒的代谢废物。 在分批培养中，可以采用取出部分用过的培养基和加入新鲜的培养基的办法来实现。这种分批部分换液办法的中，可以采用取出部分用过的培养基和加入新鲜的培养基的办法来实现。这种分批部分换液办法的缺点在于当细胞密度达到一定量时

20、，废代谢物的浓度可能在换液前就达到了产生抑制作用的程度废代谢物的浓度可能在换液前就达到了产生抑制作用的程度。降低废代谢产物的有效方法就是用新鲜的培养基进行灌注。灌流式操作是指细胞接种后进行培养，一方面新鲜培养基不断加入反应器新鲜培养基不断加入反应器，一方面又将反应液连续不断地取出反应液连续不断地取出，但细胞留在反应器内，使细胞处于一种不断的营养状态。，使细胞处于一种不断的营养状态。细胞被截留在反应器内的连续操作，是最受推崇的用动物细胞生产药物的方式。，是最受推崇的用动物细胞生产药物的方式。灌流规模分为几十升至几百升。动物细胞制药的前景和展望1改进表达载体，提高表达水平和产量2利用代谢工程，改进

21、培养工艺，降低生产成本3抑制细胞凋亡，延长培养周期4糖基化工程提高产品质量5转基因动物的研究6组织工程的研究第四章抗体制药：抗原抗体的基本概念抗体：指能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白抗原：能刺激机体免疫系统启动免疫应答，并能与相应的免疫应答产物在体内或体外发生特异性结合的物质，即抗原。单链抗体：是由一段弹性连接肽把抗体可变区重链与轻链相连而成，是具有亲代抗体全部抗原结合特异性的最小功能结构单位。双功能抗体，就是双特异性单链抗体。制备方法：非共价键二聚体；共价连接双特异性单链抗体应用亮氨酸拉链抗体融合蛋白：配基配基型融合蛋白配基ig型嵌合蛋白配基-Fv型嵌合蛋白受体-Fv型融合蛋白酶

22、-抗体型融合蛋白构建抗体融合蛋白的基本原则：删除第一个基因的终止序列；接上带有终止密码子的第二个基因。主要有三大类抗体诊断用药：?血清学鉴定用的抗体试剂鉴定病原菌的抗体试剂乙型肝炎病毒表面抗原的反向被动血凝诊断试剂 妊娠诊断试剂 抗abo血型系统血清?免疫标记技术用的抗体试剂 荧光抗体诊断试剂 免疫酶抗体诊断试剂 放射性免疫用抗体诊断试剂?导向诊断药物血清学鉴定是指用已知抗体来鉴定未知的抗原型，主要用于疾病的病原菌的诊断和血型鉴定。是指用已知抗体来鉴定未知的抗原型，主要用于疾病的病原菌的诊断和血型鉴定。?常用凝集反应。? 方法简单快速，应用广泛，普及到基层抗体诊断试剂：血清学鉴定用的抗体试剂抗

23、ABO型系统血清：免疫标记用的抗体试剂导向诊断药物Cd单克隆抗体系列噬菌体抗体库技术的特点模拟天然全套抗体库：抗体文库可以达到10的11次库容，包含整个B细胞的全部克隆。避开了人工免疫和杂交瘤技术可以获得高亲和力的人源化抗体。 抗体导向前药治疗：选用单克隆抗体导向原理，前药和专一性活化酶选择性结合与癌症部位特异性的是前药在靶部位成为活性细胞毒分子。毒素：植物毒素和细菌毒素。第五章次级代谢作用和次级代谢产物：次级代谢作用是由特异蛋白质调控产生的内源性化合物的合成、代谢和分解作用的综合过程。次级代谢产物：除了初级代谢产物以外有如下特点的物质有明显的分类学区域界限。其生物合成需要在一定的条件下才能发

24、生。缺乏明确的生理功能。是生命活动的多余成分。第一个植物细胞工程的商品紫草宁生长素、细胞分裂素、赤霉素、脱落酸、乙烯类细胞后含物生物碱：麻黄碱、黄连素、喹宁等糖苷类：洋地黄毒苷、紫草宁挥发油：薄荷油、丁香油有机酸：苹果酸、柠檬酸、酒石酸、水杨酸生物活性物质酶类维生素植物激素植物杀菌素用于植物组织的表面灭菌剂：次氯酸钙氯化汞次氯酸钠植物生长调节剂：生长素、细胞分裂素、赤霉素、脱落酸、乙烯类。影响植物次级代谢产物积累的因素：生物条件：外植体季节休眠分化物理条件：温度光照通气化学条件无机盐碳源植物生长调节剂维生素氨基酸工业培养条件培养罐类型通气搅拌诱导子：是植物抗病生理过程中诱发植物产生植物抗毒素和

25、引起植物过敏反应亦称抗性反应或自身防御反应的因子包括侵染植物的微生物以及植物细胞内分子。前体饲喂是增加次级代谢产物产率的重要方法三种主要的前体：莽草酸：芳香氨基酸、肉桂酸和某些多酚化合物的前体，芳香氨基酸、肉桂酸和某些多酚化合物的前体氨基酸：生物碱及肽类抗生素的前体乙酸：聚乙炔类、前列腺素类、大环抗生素类、多酚类、类异戊二烯的前体两相法培养定义：加入固相或疏水液相，形成两相培养系统，从而达到收集分泌物的目的出发点：在细胞外创造一个次级代谢产物的储存单元。利用微生物生产酶制剂的优点（1）能够生产酶的微生物种类繁多，有较大的选择余地。（2）微生物繁殖快、培养周期短、产量高，培养方法简便，培养过程容

26、易控制（3）微生物具有较强的适应性，能够培育出新的高产菌株。大肠杆菌-用来生产谷氨酸脱羧酶、天门冬氨酸酶、青霉素酰化酶、-半乳糖苷酶。曲霉（黑曲霉、黄曲霉）-用来生产糖化酶、蛋白酶、淀粉酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、氨基酰化酶、脂肪酶。枯草杆菌-用于生产a-淀粉酶、-葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酯酶。啤酒酵母-用来生产转化酶、丙酮酸脱羧酶、乙醇脱氢酶。固定化酶：指是指限制或者固定于特定空间位置的酶，具体来说，就是指经过物理、化学方法处理，使酶变成不易随水流失的固定化催化剂特点：（1）固定化酶属于修饰酶，这种酶可以通过化学、生物、分子工程手段加以改良。 （2）固定化酶的稳定性很高，可以多次连续使用。（3）

27、反应以后，产物中不含酶，易于纯化。（4）反应条件易于控制，可实现连续化和自动控制。（5）酶的利用率高，酶的实际使用量较少。（6）固定化酶比水溶性酶更适合进行多酶反应。固定化方法：1、载体结合法 （1）物理吸附法：优点：（1）操作简单（2）可选用不同的吸附剂（3）酶失活之后，载体可以再生缺点（1）酶的最适吸附量无规律可寻（2）酶与载体之间的吸附力不强，酶容易脱落。（2）离子结合法 A、离子结合法的优点-操作简单、处理条件温和，酶的活性中心不容易被破坏。B、离子结合法的缺点-载体和酶的结合力较弱、常常发生酶脱落的现象 C、常用的离子结合剂：树脂（3）共价键结合法 酶分子上的氨基、羧基、羟基、咪唑基

28、、巯基与载体表面的反应基团载体表面的反应基团形成共价键，因而将酶固定在载体上的方法。2、交联法交联法是采用双功能、或者多功能试剂，使得酶与酶之间发生交联的固定化方法。基团之间的交联通过共价键共价键结合。 交联法的优点-交联后的酶活性较高 交联法的缺点-反应条件剧烈、酶的回收率低。常用的交联剂：戊二醛3、包埋法 包埋法的优点-不需要改变酶的高级结构，酶的回收率较高。包埋法的缺点-包埋酶容易导致酶的失活，包埋法，包埋法只适用于小分子底物的反应过程，大分子底物由于无法进入凝胶，故不适用。4、选择性热变性法将含酶细胞在一定温度下加热处理使细胞膜变形而酶不变性，使酶固定在细胞内。适用于对热稳定性较好的酶

29、的固定化反应器：间歇式搅拌反应器（bstr）分批搅拌反应器，其特点是结构简单、操作方便。其缺点是，经过单一批次的反应之后，酶就随着反应产物流失。主要用于游离酶反应。当前食品和饮料工业中常用这类反应器。当前食品和饮料工业中常用这类反应器。其方法是将酶和底物一起加入到反应器中，控制反应温度，当达到预期的转化率时，随即放料。连续流动搅拌反应器（cstr）：这是一种连续进料、连续出料的反应器。结构上与间歇式搅拌反应器基本相同。但是区别在于连续出料和连续进料，有搅拌桨。（3）填充式反应罐（PBR）属于使用最普遍的反应器。主要用于固定化酶生产的反应器。固定化酶通常以各种形状如球形、碎片、薄片、丸粒填充于反

30、应层内。固定化酶所使用的载体有多孔玻璃珠、珠状离子交换树脂、聚丙烯酰胺凝胶、二乙胺乙基葡聚糖凝胶，胶原蛋白薄膜片。工业生产填充式反应罐系统运转时，底物按照向上流动的方向以恒定的速度通过反应床。有较高的转化率，有高压压密现象，不适用于不溶性的和粘性的。4）流化床反应器（FBR） 在流化床反应器，底物溶液以足够大的流速向上通过反应床，使得固体颗粒处于流化状态，从而来增加反应效率。 由于流化床反应器具有混合程度高，传热性能良好等特点，因此可以用来处理粘性较强的底物、或者用来处理含有固体颗粒的底物。热交换性好，消耗动力大，不宜直接模仿放大。循环反应器（RCR） 这种反应器是让部分反应产物流出，流出物再

31、与原始底物混合之后重新流入反应系统的方法。 循环反应器能够提高液体的流速，并能减少底物在固定化酶表面沉积提高液体的流速，并能减少底物在固定化酶表面沉积，从而达到较高的转化效率。 当反应底物是不溶性物质时，可以采用循环反应器生产。采用高速液流克服外扩散的限制，设备成本较高。（6）连续流动搅拌-超滤膜反应器（CSTR/UFR） 连续流动搅拌-超滤膜反应器=连续流动搅拌反应器 + 超滤膜装置。 超滤膜被安装在连续流动搅拌反应器的出口处，这种膜只允许反应产物、或者是未曾反应的底物通过，而分子量较大的酶就被截留在反应器中，从而这种膜只允许反应产物、或者是未曾反应的底物通过，而分子量较大的酶就被截留在反应

32、器中，从而实现酶的反复利用。同样适用于水溶性酶，长时间运转酶稳定性下降。模拟酶概念：根据酶的作用原理，采用人工方法合成的，具有活性中心和催化反应作用的、非蛋白质结构的化合物。分子印迹技术 分子印迹技术是制备针对某一特定分子具有特异性结合能力的聚合物的过程。其实质已经接近于基因芯片技术。（1）特定分子 + 特异性结合的功能单体，发生互补性结合作用，形成特定分子-功能单体复合物。（2）采用交联剂，在特定分子-功能单体复合物周围发生聚合反应，形成交联聚合物。（3）从聚合物中除去特定分子，得到具有反应选择性的模板。分子印迹技术的应用价值（1）分离手性药物。（2）作为人工模拟酶，进行聚合反应。（3）用于

33、构建成生物传感器。酶分子修饰:通过各种方法使酶分子结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的过程三、酶化学修饰的方法1.酶的表面化学修饰（一）大分子修饰（大分子结合修饰）是目前应用最广的酶分子修饰方法。定义：利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶的特性与功能的方法。消除了抗原性延长了酶在体内的半衰期提高了酶的热稳定性。修饰剂：聚乙二醇（PEG）修饰方法：修饰前活化，然后在一定条件下与酶分子共价结合。小分子修饰 （酶蛋白侧链基团修饰）定义：通过选择性的试剂或亲和标记试剂与酶分子侧链上特定的功能基团发生化学反应。侧链基团：组成蛋白质氨基酸残基上的功能团。活性部位或者活性部位以外。主要有：氨基、羧基、胍基、巯基、酚基、咪唑基20种不同氨基酸的侧链基团中只有极性氨基酸的侧链易被修饰，它们一般具有亲核性极性交联修饰用双功能基团试剂(如戊二醛)，与酶分子内不同肽链部分，与酶分子内不同肽链部分共价交联，使酶分子空间构象更加稳定。（四）固定化修饰（固定化酶）通过酶表面的酸性或碱性残基，将酶共价连接到惰性载体上，由于酶所处的微环境发生改变，使酶的性质（最适pH、最适温度和稳定性），特别是动力学性质发生改变。酶分子内部修饰非催化活性基团的修饰