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犐犆犛07.080
犃40
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犌犅/犜38164—2019
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????犘犆犚?
犐犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犪狀犻犿犪犾犻狀犵狉犲犱犻犲狀狋犳狉狅犿犮狅犿犿狅狀犾犻狏犲狊狋狅犮犽犪狀犱狆狅狌犾狋狉狔—
犚犲犪犾狋犻犿犲犘犆犚
20191018??20191018??
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??
??
?????GB/T1.1—2009???????。
??????????????????(SAC/TC387)?????。
???????:???????????、????、????、????、????。
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???、???。
Ⅰ
犌犅/犜38164—2019
??????????????
????犘犆犚?
1??
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???????????、??、?、???????、??、??、??、??、?、??、??、??
?、??、?、?、?、?、?、??、??、??、?、??、??、?、??????Taqman??????
PCR????。
???(LOD)1%(????)。
2???????
??????????????????。??????????,????????????
?。???????????,?????(????????)??????。
GB/T6682??????????????
GB/T27403—2008??????????????????
GB/T34796?????????????????????
GB/T35918?????????????????Sanger???
3?????、
???
3.1?????
?????????????。
3.1.1
????犘犆犚狉犲犪犾狋犻犿犲犘犆犚
?PCR???????????,???????????????PCR????。
3.1.2
犆狋?犮狔犮犾犲狋犺狉犲狊犺狅犾犱
??????????????????????????。
3.2???
???????????。
ATP8:ATP?????8(ATPsynthasesubunit8)
COⅠ:????C?????Ⅰ(CytochromeCoxidaseⅠ)
CTAB:??????????(Cetyltrithylammoniumbromide)
犮狔狋犫:????b(Cytochromeb)
DNA:??????(Deoxyribonucleicacid)
Dloop:D??(Displacementloopregion)
EDTA:??????(Ethylenediaminetetraaceticacid)
1
犌犅/犜38164—2019
Na2EDTA:????????(Ethylenediaminetetraaceticaciddisodiumsalt)
ND1:?????????????????1(Nicotinamideadeninedinucleotideoxidoreductase
subunit1)
犜犪狇
DNA???:??DNA???(
犜犪狇
DNApolymerase)
Tris:????????(Trishydroxymethylaminomethane)
4??
???????????????????????????PCR??,??PCR?????
???????????????,??????????????????。
5????????
???????????????????????????1。
?1??????
??????????
????
F:TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA
R:AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT
P:5′FAMCCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACC3′TAMRA
18SrRNA??
??
F:TGGAGTAATCCTTCTGCTCACAGT
R:TGACTGTTGCTCCTCAGAATGATA
P:5′FAMAGCATTTATAGGATACGTCC3′MGBNFG
犮狔狋犫??
??
F:GACTAATATTCGAAAATCC
R:CTCCTAGGAGGGAGCCGAAGTTTCAC
P:5′FAMCAACGCATTCATTGACCTTCCAGCTCCAT3′TAMRA
犮狔狋犫??
??
F:TTCATTGAYCTCCCTGCTCC
R:GGAATAGGCCGGTGAGGATT
P:5′FAMACTTTGGCTCTCTCC3′MGBNFG
ATP8??
??
F:ATTCTTTGCCTTCCACTTCA
R:AGCGTATGCGAATAGGAAAT
P:5′FAMCCTACACGAAACAGGCTCTAATAACCCGAC3′TAMRA
犮狔狋犫??
???
F:CCTACCACCGAAGCAATAGTGG
R:GGTGCACTCTCAATAACTTCTGAGA
P:5′FAMCACTGTAGCTACTCAAGAAGC3′TAMRA
COⅠ??
??
F:TAGTTATGTAAACAAGACTG
R:ATAGACTGTAGTAGCAAGGAA
P:5′FAMAGGACTTGGCGGTGCTTTAT3′TAMRA
12SrRNA??
??
F:CTCCCAGTACGAAAGGACCA
R:GGGCGGGATATGTTTGTGTA
P:5′FAMCCAACTTTAATCAAGCGCCT3′TAMRA
16SrRNA??
2
犌犅/犜38164—2019
?1(?)
??????????
??
F:TGGAGTAATCCTCCTGCTC
R:GGATTGCTGAAAGAAGATTA
P:5′FAMCATAGGCTATGTTTTACCATGAG3′TAMRA
犮狔狋犫??
??
F:CGGAGTAATCCTCCTATTTGC
R:CTAGGCTTGTGCCAATATATGGA
P:5′FAMTATTACCAACCTCCTTT3′MGBNFG
犮狔狋犫??
??
F:GAGCAACCCCTCAACGTACT
R:ACCTCCTCGTCGATATGGACTC
P:5′FAMCCCCTCAACGTACTAACAGTAACCAGAC3′TAMRA
16SrRNA??
?
F:GGCCACACAAATCCTCACAG
R:TGTGTTGGCTACTGAGGAGAAA
P:5′FAMCCTACTGGCTATGCACTACACCGCAGAC3′Eclipse
犮狔狋犫??
?
F:CCACCGCGAATCCTCAAT
R:TCTTGTTTTTGGAGGATTTGTTCTC
P:5′FAMCCATCGCAGAGCCTGGTCGATATTTTT3′Eclipse
16SrRNA??
??
F:GGATCACTTTGCCCACTTTAA
R:GGGTGACGGGCGGTATG
P:5′FAMATGGCCCTGAGGCAC3′Eclipse
12SrRNA??
??
F:GCTTCAATCCTCTATTTCATAA
R:GCTTCTTCCTTGAGTCTTA
P:5′FAMCCTCCTAGTCTTCATGCCAATCGT3′Eclipse
犮狔狋犫??
?
F:CTGCTGTCTTACTACTTCTA
R:GGTGTTTAGGTTTCGATC
P:5′FAMCACTTCCAGTCTTAGCAGCGG3′Eclipse
COⅠ??
?
F:TAATCGTCACCGCACATGCC
R:CTATGTCAGGAGCCCCAATTATCA
P:5′FAMACAAGCCAGTTCCCGAAGCCTCCA3′Eclipse
COⅠ??
?
F:ATCTACATGATTCATTACAATTAC
R:CTATGTTTTTGAGTTTTGAGTTCA
P:5′FAMATCTCAAACTACTCATACCCA3′TAMRA
ATP8??
?
F:TCCAGGTAAACCCTTCTTCCC
R:TTACGAGCAAGGGTTGATGGT
P:5′FAMATCACTTAGTCCAATAAGG3′MGBNFG
Dloop??
??
F:TGGAGCATCAGTAGACCTTACAATTT
R:GGCGGGAGGTTTTATATTGATAATAG
P:5′FAMCCCTGCACCTGGCCGGAGTC3′TAMRA
COⅠ??
?
F:AATCTTGCCTGGGTTTGGAA
R:CAGTAAATATGTGGTGGGCTCACA
P:5′FAMCATACTACTCCGGGAAAA3′MGBNFG
COⅠ??
3
犌犅/犜38164—2019
?1(?)
??????????
?
F:CCCTCCTCCTTTCATCCTCAT
R:GTCATAGCGGAACCGTGGATA
P:5′FAMCTATGAATCCGGGCCTC3′TAMRA
ND1??
??
F:GCCCTAACCCCTTAAGAAAAGAAT
R:AGTTGCTATGGCTAAGTCAAGTTTACAC
P:5′FAMCTTGCTTGAGCCACACC3′MGBNFG
12SrRNA??
?
F:CCGCCCAATCACCCAAA
R:GCCTCCGATTCATGTTAAGA
P:5′FAMTACTGAATYCTAGTAGCCAACCT3′MGBNFG
犮狔狋犫??
?:F??????;R??????;P????。
6??
??????,?????????。??????GB/T6682???????。
6.1????。
6.2???。
6.3????。
6.4??????(10mol
/L):?160mL??????80.0g????(NaOH),???,????
?,????????200mL。
6.5Na2EDTA??(500mmol/L,pH8.0):??18.6gNa2EDTA,??70mL????,????
???????(6.4),????????,?????,???????(6.4)?
pH
?8.0,?????
??100mL。?103.4kPa(121℃)?????20min。
6.6TrisHCl??(1mol/L,pH8.0):??121.1gTris???800mL????,?HCl?
pH
?
8.0,???????1000mL。?103.4kPa(121℃)?????20min。
6.7CTAB?????(pH8.0):??4.0gCTAB,16.364gNaCl,??20mL1mol/LTrisHCl?
?(pH8.0)(6.6),8mL500mmol/LNa2EDTA??(pH8.0),??70mL?????,????
200mL,?103.4kPa(121℃)?????20min。
6.8CTAB???:??1.0gCTAB,0.467gNaCl,??70mL?????,????200mL,?
103.4kPa(121℃)?????20min。
6.9???K(670U/mL):
??0.10g???33.5U/
mg
(Unit,????)????K??,??
5mL???,????,?????K????,????????-20℃。
6.10PCRMasterMix(2×),??????????PCR???。
7????
7.1????PCR?。
7.2???????????????。
7.3?????。
7.4???:
???≥12000犵。
4
犌犅/犜38164—2019
7.5pH?:0.01?。
7.6??:??0.1g、0.01g、0.001g。
8????
8.1?????
8.1.1??
????????,???????????,??????、?????????。
8.1.2????
???70%????????2?~3?,?????50mL??????????,-20℃?
???。
8.1.3???、
????
??????????50mL??????????,-20℃????。
8.2犇犖犃??
??GB/T35918?????。
?????DNA???????DNA。
8.3犇犖犃????????
??GB/T34796???????DNA???,??DNA???。
?:????PCR?????,??DNA?????5ng/μL~50ng/μL??。
8.4????犘犆犚??
???????????、?????????。
??????????????????????????,???????????????
?????????????,?????????。
???????2????????,???????????????,?Ct???????
??。????????25μL,??????2,??????3。
?2????犘犆犚??????
?????????/μL
PCRMasterMix(2×)1×12.5
????(10μmol/L)200nmol/L0.5
????(10μmol/L)200nmol/L0.5
??(10μmol/L)200nmol/L0.5
DNA??(5ng/μL~50ng/μL)—5.0
???—6.0
5
犌犅/犜38164—2019
?3????犘犆犚????
???????
???95℃10min;95℃15s,60℃1min,40???
??95℃10min;95℃15s,60℃1min,40???
??95℃10min;95℃15s,60℃1min,40???
??95℃10min;95℃15s,60℃1min,40???
??95℃10min;95℃15s,60℃1min,40???
???95℃10min;95℃15s,60℃1min,40???
??95℃10min;95℃15s,60℃1min,40???
??95℃10min;95℃15s,60℃1min,40???
??95℃10min;95℃15s,60℃1min,40???
??95℃10min;95℃15s,62℃1min,40???
?95℃10min;95℃15s,60℃1min,40???
?95℃10min;95℃15s,60℃1min,40???
??95℃10min;95℃15s,60℃1min,40???
??95℃10min;95℃15s,60℃1min,40???
??95℃5min;95℃15s,60℃40s,40???
?95℃5min;95℃15s,60℃40s,40???
?95℃5min;95℃15s,60℃40s,40???
?95℃10min;95℃15s,62℃40s,40???
?95℃2min;95℃15s,65℃80s,40???
?95℃2min;95℃15s,65℃80s,40???
??95℃2min;95℃15s,65℃80s,40???
?95℃10s;95℃5s,60℃30s,40???
??95℃10s;95℃5s,52℃10s,72℃34s,40???
?95℃10s;95℃5s,52℃10s,72℃34s,40???
9????
???????????,??????:
a)???:???????????,??????????,Ct?<30.0;
b)????:???????????,Ct??≥40.0;
c)????:???????????,Ct??≥40.0;
d)????:???????????,??????????,Ct?≤35.0。
10???????
10.1????
????9?????,???????????:
6
犌犅/犜38164—2019
a)?Ct?≤35.0,??????????,??????????A;
b)?Ct?≥40.0,??????????;
c)?35.0<Ct?<40.0,?????。??????Ct???<40.0,?????????;?
?????Ct?≥40.0,?????????。
10.2????
10.2.1??????,
???“??×××(????)??”。
10.2.2??????,
???“???×××(????)??”。
11??????????????
??GB/T27403—2008???D?????。
7
犌犅/犜38164—2019
??犃
(?????)
???????????????
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ataggatacgtcctaccatgaggacaaatatcattctgaggagcaacagtca
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acaacgcattcattgaccttccagctccatcaaacatttcatcatggtgaaacttcggctccctcctaggag
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aaactttggctctctcctaggcatctgcctaattctgcaaatcctcaccggcctattcc
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cctagtagccgtacacctattattcctacacgaaacaggctctaataacccgacaggaatctcctcagacatagacaaaatcccattccacccctactaca
caattaaagacatcctaggagcactgctactaatattaattctccttattctcgtactgttctcaccagacttattaggagatcctgacaactatactcccgc
taaccccctcaatacaccaccacacattaagccggaatgatatttcctattcgcatacgct
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aagctttctcagaagttattgagagtgcacc
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caatagcttaaaactcaaaggacttggcggtgctttatacccttctagaggagcctgttctataatcgataaaccccgataaacctcaccattccttgcta
ctacagtctat
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aatcaagcgccttaaattaactaatgatttcatcttaattagatacacaaacatatcccgccc
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taggctatgttttaccatgaggacaaatatcattttgaggggcaacagtcatcactaatcttctttcagcaatcc
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taattgaccaatggaccaagctaccccagggataacagcgcaatctcctccaagagtccatatcgacgaggaggt
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accgcagacacatcccttgctttctcctcagtagccaacaca
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agagcctggtcgatatttttcggttggggcgaccttggaggagaacaaatcctccaaaaacaaga
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taccgcccgtcaccc
???????????????(GenBank:AB052720.1):gcttcaatcctctatttcataatcctcctagtcttcatgccaa
tcgtcagyattattgaaaataatctattaaaatgaagagtctttgtagtatatcaattacyttggtcttgtaaaccaaaaatggagaaccctatctccctaa
gactcaaggaagaagc
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actatattattaacagatcgaaacctaaacacc
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tatagtcatgcctattataattggaggcttcgggaactggcttgtccccctgataattggggctcctgacatag
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tattttattccaactaaaaatctcaaactactcatacccagcaagcccagaatcaaccgaactcaaaactcaaaaacatag
8
犌犅/犜38164—2019
??????????????(Genbank:KY700649.1):tccaggtaaacccttcttccctcccctatgtacgtcgtgcatta
atggtttgccccatgcatataagcatgtacataatattatattcttacataggacatatcaactcaatctcacaattcattgatctgtcagcagtat
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