血管内皮抑制素

1、 血管内皮抑制素(Endostatin)和衍生物(中国商品名:恩度)(一)血管内皮抑制素的发现1997年，Folkman等首先报道从小鼠血管内皮细胞瘤中得到一种具有抑制血管生成 的因子，经N端氨基酸序列测定表明，该物质为型胶原C-末端的184个氨基酸片段， 被命名为血管内皮抑制素(Endostatin，ES)。人体血液循环中有极微量Endostatin存在。 OReilly等(1997年)利用重组后并纯化的Endostatin进行体外试验，证明Endostatin对 牛毛细血管内皮细胞、牛肺主动脉内皮细胞有特异的抑制增殖作用，而对非血管内皮细胞 系细胞、平滑肌细胞等则无增殖抑制作用。随后又进行

2、了体内药效学试验，证明Endostatin可抑制鸡胚绒毛尿囊膜毛细血管的生长，对接种Lewis肺癌、T 241纤维肉瘤和 B16F10黑素瘤的小鼠具有明显的肿瘤抑制作用。免疫组化的实践表明，Endostatin能 阻断血管生成。Michael等(1997年)实验显示，血管内皮抑制素是通过抑制肿瘤新生血 管的形成从而对原发和转移瘤均表现极强的特异的抑瘤活性;并且动物实验中发现反复 使用内皮抑制素也不会产生耐药性。Entre Med公司于1998年10月至2000年7月在美国的3个癌症中心进行了重组 人血管内皮抑制素的期临床试验。我国山东先声麦得津生物工程有限公司首家开发了 Endostatin(

3、Jia等，2006年)，商品名为“恩度”。与国外产品不同的是，Entre Med公司采 用的是酵母菌作为表达载体，而恩度是采用大肠埃希菌，且在ES母体上添加了9个氨基 酸的新型Endostatin，不仅使ES稳定性提高，半衰期延长，而且生物活性增加，纯度 99.9%，蛋白性质稳定，可以在室温放置1年仍然保持活性，而国外的同类产品则需 -80冷冻保存。(二)血管内皮抑制素的作用原理Hajitou等(2002年)研究显示，Endostatin能下调VEGF mRNA和蛋白表达，作用 于VEGF的受体KDR/Flk-1，从而抑制VEGF介导的内皮细胞迁移和血管生成。Endostatin还与bFGF竞

4、争结合，干扰其信号传导通路。基质金属蛋白酶MMP-2在血管生成中发挥重要作用，Endostatin能结合MMP-2 的催化活性区，阻断其作用。Endostatin能结合于Tropomyosin，破坏微丝的完整性，抑制内皮细胞的迁移，诱导 其凋亡，发挥抗肿瘤作用。Endostatin能抑制Wnt信号通路，促进-catenin的降解，抑制内皮细胞移动，导致 内皮细胞停滞在G1期，减少内皮细胞在S期的比例，从而引起细胞周期停滞。Endostatin对于血管内皮细胞凋亡的影响可能与诱导酪氨酸激酶活性，抑制bcl-2、 bcl-xl和bad表达有关，而没有改变bax、p53、cdc-5A、p38 MAP

5、K等的基因表达。Endostatin能下调体内的促血管生成因子，上调体内的血管生成抑制因子，通过改变 血管生成调节因子的平衡关系，发挥抗血管生成作用。根据Folkman等(2006年)的研究 结果，Endostatin可抑制65种肿瘤生长，影响占人类基因组12%的与血管生成相关的基 因发挥抗血管生成作用。国内学者如Ling Y等(2007年)通过动物体外和体内实验，对恩度的抗血管生成作 用机制进行了研究，结果显示恩度在体内外均有明显的抑制血管生成作用，机制可能在于 阻断了血管内皮生长因子(VEGF)介导的促血管生成信号转导通路(VEGFR2)。罗永章 等2007年在Blood网络电子版文章“核

6、仁蛋白是介导血管内皮抑制素抗血管生成以及 抗肿瘤活性的受体”中指出，核仁蛋白(Nucleolin)是血管内皮抑制素的新型功能性膜受 体。他的研究首次证实血管内皮抑制素与新生血管的内皮细胞膜上的核仁蛋白高亲和性 结合后内化，并转运入核，抑制核仁蛋白的磷酸化，从而抑制血管内皮细胞增殖的过程。 这可能是Endostatin发挥特异性抗血管生成以及抗肿瘤活性的细胞内分子通路之一。综上所述，血管内皮抑制素有以下潜在优势：由于血管内皮细胞的基因组较为稳 定，针对血管内皮细胞的治疗不易获得耐药性;正常成熟组织毛细血管内皮细胞处于 静止状态，而肿瘤血管内皮细胞增殖活跃，出现许多相对特异的标记分子，如VEGF受

7、 体、E-selectin、Tie受体等，它们的表达较正常静止内皮细胞可高达50倍以上，是潜在的 抗肿瘤血管靶向分子;由于肿瘤血管本身是药物的靶部位，因此，药物易于到达并在局 部形成较高浓度;从理论上推算，一个内皮细胞要饲养50100个肿瘤细胞。因此，针 对血管内皮细胞比直接针对肿瘤细胞更为有效;肿瘤生长的血管依赖性为所有肿瘤共 性，即使血液系统的非实体性肿瘤，如急性淋巴细胞性白血病等，在骨髓中也有大量新生 血管的形成。需要指出的是，血管内皮抑制素是一个广谱的血管生成抑制剂，能阻断多种血管生长 因子诱导的血管生成。它有多个靶点，如VEGF、bFGF、bFGF受体、HIF1、EGF受体、 ID-

8、1、Neuropilin、Thrombos、pondin-1、Maspin、HIF1、inhibitor、TIMP-2等。因此， 针对肿瘤血管治疗策略具有抗瘤的“广谱性”，在理论上适合对不同肿瘤的治疗。(三)Endostatin和恩度的应用及疗效1. 期临床研究在美国多中心医院所进行的期临床试验中，初步观察了美国Entre Med公司研制 的rh-Endostatin的疗效。其中MD Anderson癌症中心报道了1例恶性上颌骨瘤患者接 受300 mg/(m2日)治疗2个月后，经磁共振成像(MRI)扫描，测量肿瘤萎缩了50%以 上。Dana-Farber医院1例神经内分泌瘤患者接受1年治疗后，

9、肿瘤萎缩了约20%。另 外，还有12例患者接受了412个月的rh-Endostatin治疗。其中至少有5例患者经4 个月短期治疗、2例患者经1年治疗后病情得到稳定。MD Anderson癌症中心通过正电 子发射断层成像系统(PET)扫描肿瘤血流速度及代谢的方法观察到在一些患者体内肿瘤 周围血流速度及代谢减慢。此外，该中心使用015PET摄影发现，随着药物剂量的增加， 血流速度明显减慢。Wisconsin大学(Thomas等，2003年)用rh-Endostatin治疗21例患 者56日后，发现流经心脏的血量没有改变，而流经肿瘤的血流量减少。Dana Farber医院 发现药物的剂量与血清中促血

10、管生成的生长因子(尿中的bFGF、VEGF)的含量有一定关 系。随着rh-Endostatin剂量的增加，许多患者尿中的bFGF、VEGF含量降低。常见的 不良反应有贫血、深静脉血栓、呼吸困难、发热和胃肠反应。国内杨林等于2001年8月至2002年3月对恩度进行了期临床试验。结果显示，人体 对恩度耐受性良好，在210 mg/m2最大耐受剂量下未出现严重不良反应;而7.5 mg/m2 剂量组除1例出现轻度胸闷外，其余未出现不良反应，且初步观察治疗肿瘤疗效较好。在 连续给药耐受性试验中，10例肿瘤患者于治疗结束时和治疗结束2周后，观察X线片、 CT、MRI、B超、骨扫描等指标，与治疗前比较，在30

11、 mg/m2剂量组的3例肿瘤患者中，2 例乳腺癌患者病情稳定(SD)，1例胃癌患者病情进展(PD);在15 mg/m2剂量组的3例肿 瘤患者中，1例黑色素瘤患者病情好转(MR)，1例肝癌患者病情稳定(SD)，1例肝癌患者 病情进展(PD);在7.5 mg/m2剂量组的4例肿瘤患者中，2例肾癌、1例直肠癌和1例胃 癌患者的病情均达到稳定(SD)。2. 期临床研究美国Entre Med公司于2002年10月正式启动了血管内皮抑制素的期临床试验。 2003年，美国ASCO年会首次报道了ES治疗晚期神经内分泌肿瘤的期开放性试验结 果。有41例患者入组，给药方案为ES初始剂量60 mg/(m2日)，皮下

12、注射，每12小时 1次，连用8周。肿瘤病灶未增大50%，则进行剂量递增。可评价的患者中23例病灶稳 定，12例进展。中位随访35周，肿瘤进展中位时间39周。因疾病进展死亡7例。我国血管内皮抑制素的期临床的单药研究，对象为对晚期复治的非小细胞性肺癌、 黑色素瘤和肾癌患者，经过60多例的单药使用，临床疗效不理想，只有2例部分缓解，其 中1例停药后出现进展，肿瘤缩小未达4周，多数为SD和PD。3. 恩度与化疗联合应用的期临床试验王金万等于2003年4月至2004年6月组织全国24所大型综合医院及肿瘤专科医 院严格按照GCP要求对期非小细胞肺癌(NSCLC)进行了期随机、双盲对照、多中心 临床试验，目

13、的在于比较恩度+NP化疗方案和单纯NP方案化疗的疗效和毒副反应。本 组疗效在开盲前经独立的专家委员会评定和确认。该试验入组493例，其中试验组(恩度 +NP化疗)326例，对照组(NP化疗)167例;初治351例，复治142例。结果显示，在可 评价疗效的486例患者中，恩度+NP化疗组和单纯NP化疗组的总有效率分别为 35.40%和19.51%(P0.01);总临床受益率分别为73.29%和64.02%(P0.05);两 组患者中位TTP分别为6.25个月和3.59个月(P0.001)。1年生存率分别为62.75% 和31.46%(P0.01)。分层分析显示，初治患者恩度+NP化疗组和单纯NP

14、化疗组的 有效率分别为40.00%和23.93%(P0.01);临床受益率分别为76. 52%和64. 96% (P0.05);中位TTP分别为6.61个月和3.65个月(P0.001)。复治患者恩度+NP 化疗组和单纯NP化疗组的有效率分别为23.91%和8.51%(P0.05);中位TTP分别为5.72个月和3.16个月(P0.001)。 该研究对可能影响NSCLC患者预后的因素包括既往治疗情况、病理类型、临床分期、PS、 性别、年龄、转移的情况进行了分析。对这些因素亚组分析表明，在初治或复治、病理类型 为鳞癌或腺癌、PS为01或2、性别、年龄40岁的情况下，治疗组与对照组比较疗效有 差异

15、(P0.05)。期患者治疗组与对照组相比较在有效率上有差异(P0.05)，而无论 临床分期如何，治疗组与对照组在中位TTP上均有统计学差异(P0.05)。恩度+NP化疗组与单纯NP化疗组治疗后QOL评分比较，有明 显提高(P=0.0155)。安全性方面，恩度+NP化疗组和单纯NP组患者接受本研究的中位观察时间分别为 48日(1385日)和43日(1257日)。两组患者的心率、呼吸、血压等生命体征无显著 性差异。化疗不良反应，恩度+NP化疗组326例中血液学不良反应主要有： 白细胞减少 220例(67.48%)、粒细胞减少171例(52.35%)、血红蛋白下降105例(32.21%)、血小板 减

16、少51例(15.64%);非血液学毒副反应主要有：恶心、呕吐165例(50.61%)、乏力104 例(31.90%)、便秘55例(16.87%)、脱发39例(11.96%)、疼痛38例(11.66%)、氨基移 换酶升高22例(6. 75%)、心律失常21例(6. 44%)、感染14例(4. 29%)、腹泻12例 (3.68%)。其中度白细胞减少、粒细胞减少、血红蛋白减少、恶心呕吐、乏力的发生 率分别为27.92%、28.53%、3.37%、7.98%、3.68%。单纯NP化疗组167例中血液学毒 副反应主要有： 白细胞减少111例(66.47%)、粒细胞减少85例(50.90%)、血红蛋白下

17、降47例(28.14%)、血小板减少25例(14.97%);非血液学毒副反应主要有：恶心、呕吐 90例(53.89%)、乏力61例(36.53%)、便秘36例(21.56%)、脱发23例(13.77%)、疼痛 18例(10.78%)、氨基移换酶升高8例(4. 79%)、心律失常6例(3. 59%)、感染3例 (1.80%)、腹泻8例(4.79%)、肺毒性2例(1.20%)。其中至度白细胞减少、粒细胞 减少、血红蛋白、恶心呕吐、疼痛、乏力的发生率分别为22.75%、28.15%、3.0%、6.59%、 2.40%、1.80%。两组不良反应的发生率及严重程度无明显差异。表明恩度不增加化疗 的不良反

18、应，安全性较好。本研究中发生严重不良事件死亡5/493例，主要包括有剧烈腹 痛、严重感染、病情进展。其中因NP方案毒性死亡3/493例，这3例患者均死于严重感 染。未发生与恩度有关的严重不良事件。因此，恩度与化疗联合是一种安全、有效的治疗晚期非小细胞肺癌方案，也是化疗与 靶向治疗药物联合应用的有益尝试。目前在进行的有2 400例晚期非小细胞肺癌患者参 加的临床研究，GP、TP、DP研究方案也被纳入其中，结果正在观察中。4. 恩度疗效的评价Endostatin主要作用于肿瘤新生血管，动物实验证实，它可以使肿瘤的血管趋向“正 常化”，改善肿瘤的血供和缺氧，同时，肿瘤血供的改善有利于血液中化疗药物与

19、肿瘤细胞 充分接触，达到较好的治疗效果，为治疗提供了机会;但另一方面，血管抑制可能导致乏 氧，促使一部分肿瘤细胞优势增殖，所以，Endostatin需和传统化疗药物联合应用。在临 床工作实践中，以传统的化疗药疗效的评价方法来评价Endostatin并不合适，Endostatin 并不以缩小肿瘤大小为目标，而事实上TTP、MST才是它较为重要的评价指标。黄纯等(2006年)采用NP方案联合血管内皮抑制素(治疗组)及单用NP方案(对照 组)治疗晚期NSCLC 67例，流式细胞法检测治疗前后外周血中循环血管内皮细胞(CEC) 数量及细胞角蛋白(CK)水平，分析晚期非小细胞肺癌(NSCLC)患者治疗前后外周血 CEC的变化，探讨CEC在NSCLC中的预后价值。结果治疗组临床有效率为44.4%，对 照组为27.3%(P=0.176);治疗组临床受益率为80.0%，对照组为50.0%(P=0.012)。 治疗组中位肿瘤进展时间(TTP)为146.7日，对照组为91.1日(P=0.