生物工程下游技术 第二章 发酵液预处理

1、第二章 发酵液的预处理和固液分离,目的,不仅在于分离细胞、菌体和其它悬浮颗粒（细胞碎片、核酸和蛋白质的沉淀物）， 还希望除去部分可溶性杂质和改变滤液的性质，以利于后继各步操作。,采用絮凝或凝聚的方法，设法增大悬浮液中固体粒子的大小，提高其沉降速度； 或采用稀释、加热等方法降低黏度，以利于过滤。,第一节 发酵液的预处理,一、发酵液过滤特性的改变,微生物发酵液的成分极为复杂，其中除了所培养的微生物菌体及残存的固体培养基外，还有未被微生物完全利用的糖类、无机盐、蛋白质，以及微生物的各种代谢产物。,微生物发酵液的特性为： 发酵产物浓度较低，大多为1-10%，悬浮液中大部分是水； 悬浮物颗粒小，相对密度

2、与液相相差不大； 固体粒子可压缩性大； 液相粘度大，大多为非牛顿型流体； 性质不稳定，随时间变化，如易受空气氧化、微生物污染、蛋白酶水解等作用的影响。,改善发酵液过滤特性的物理化学方法： 调酸（等电点）、热处理、电解质处理、添加凝聚剂、添加表面活性物质、添加反应剂、冷冻-解冻及添加助滤剂等。,1、降低液体粘度 （1）加水稀释法 加水稀释法能降低液体粘度，但会增加悬浮液的体积，加大后继过程的处理任务。而且，单从过滤操作看，稀释后过滤速率提高的百分比必须大于加水比才能认为有效，即若加水一倍，则稀释后液体的粘度必须下降50以上才能有效提高过滤速率。,（2）升高温度 加热是发酵液预处理最简单最常用的方

3、法。加热可有效降低液体粘度，提高过滤速率。同时，在适当温度和受热时间下可使蛋白质凝聚，形成较大颗粒的凝聚物，进一步改善了发酵液的过滤特性。,对于粘度较高的发酵液，稀释或者加热可以降低发酵液黏度，有利于输送和过滤等后续操作。史鹏等的研究比较了热处理和酸处理两种方法对HA 分子量降低的影响。 注意加热温度与时间，不影响产物活性和细胞的完整性。 温度过高或时间过长，会使细胞溶解，胞内物质外溢，增加发酵液的复杂性，影响其后的产物分离与纯化。,2.调整pH,通过调整pH值改变易吸附分子的电荷性质，即可减少堵塞和污染；细胞、细胞碎片及某些胶体物质等在某个pH值下也可能趋于絮凝而成为较大颗粒，有利于过滤的进

4、行。,凝聚指在电解质作用下，由于胶粒之间双电层电排斥作用降低，电位下降，而使胶体体系不稳定的现象； 絮凝指在某些高分子絮凝剂存在下，基于桥架作用，使胶粒形成较大絮凝团的过程。,3、凝聚与絮凝,阳离子对带负电荷的胶粒凝聚能力的次序为：,Al3+ Fe3+ H+ Ca2+ Mg2+ K+ Na+ Li+,常用的凝聚剂电解质有：,硫酸铝 Al2(SO4)318H2O（明矾）； 氯化铝 AlCl36H2O; 三氯化铁 FeCl3; 硫酸亚铁 FeSO47H2O ； 石灰；ZnSO4；MgCO3,（1）凝聚 发酵液中的细胞、菌体或蛋白质等胶体粒子双电层的结构使胶粒之间不易聚集而保持稳定的分散状态。,采用

5、絮凝法可形成粗大的絮凝体，使发酵液较易分离。 絮凝剂是一种能溶于水的高分子聚合物，其相对分子质量可高达数万至一千万以上，长链状结构，其链节上含有许多活性官能团，包括带电荷的阴离子（如-COOH）或阳离子（如-NH2）基团以及不带电荷的非离子型基团。 它们通过静电引力、范德华引力或氢键的作用，强烈地吸附在胶粒的表面。 当一个高分子聚合物的许多链节分别吸附在不同的胶粒表面上，产生桥架联结时，就形成了较大的絮团，这就是絮凝作用。,（2）絮凝,1）有机高分子聚合物，如聚丙烯酰胺类衍生物、聚苯乙烯类衍生物； 2）无机高分子聚合物，如聚合铝盐、聚合铁盐等； 3）天然有机高分子絮凝剂，如聚糖类胶粘物、海藻酸

6、钠、明胶、骨胶、壳多糖、脱乙酰壳多糖等。,工业上使用的絮凝剂可分为三类：,目前最常见的高分子聚合物絮凝剂,有机合成的聚丙烯酰胺（polyacrylamide）类衍生物,根据活性基团在水中解离情况不同，可分为三类： 非离子型 阴离子型（含有羧基） 阳离子型（含有胺基）,聚丙烯酰胺类絮凝剂的优点,用量少，一般以mg/L计量； 絮凝体粗大，分离效果好； 絮凝速度快； 种类多，适用范围广。,聚丙烯酰胺类絮凝剂的缺点,存在一定的毒性，特别是阳离子型聚丙烯酰胺，用于食品和医药工业时应谨慎。,聚丙烯酰胺类絮凝剂的应用,医药和食品工业：聚丙烯酸类阴离子絮凝剂（无毒），聚苯乙烯类衍生物，无机高分子聚合物絮凝剂（

7、聚合铝盐、聚合铁盐等），天然有机高分子絮凝剂（多聚糖类胶粘物、海藻酸钠、明胶、骨胶、壳多糖、脱乙酰壳多糖等）。,对于带负电荷的菌体或蛋白质来说，采用阳离子型高分子絮凝剂同时具有降低胶粒双电层电位和产生吸附桥架的双重机理； 对于非离子型和阴离子型高分子絮凝剂，要采用凝聚和絮凝双重机理才能提高过滤效果，这种包括凝聚和絮凝机理的过程，称为混凝。,（3）混凝,4.加入助滤剂,一种不可压缩的多孔微粒，它能使滤饼疏松，滤速增大。悬浮液中大量的细微胶体粒子被吸附到助滤剂的表面上，改变了滤饼结构，降低了过滤阻力。 常用的助滤剂有： 硅藻土、纤维素、石棉粉、白土、炭粒、淀粉等，最常用的是硅藻土。 使用硅藻土时，

8、通常细粒用量为500 g/m3；中等粒度用量为700 g/m3；粗粒用量为700-1000 g/m3。,5.加入反应剂,加入反应剂和某些可溶性盐类发生反应生成不溶性沉淀，如CaSO4，AlPO4等。生成的沉淀能防止菌丝体粘结，使菌丝具有块状结构，沉淀本身可作为助滤剂，且能使胶状物和悬浮物凝固，改善过滤性能；如发酵液中含有不溶性多糖物质，用酶将其转化为单糖，以提高过滤速率。 如万古霉素用淀粉作培养基，发酵液过滤前加入0.025%的淀粉酶，搅拌30min后，再加2.5%硅藻土助滤剂，可提高过滤效率5倍。,发酵液中的杂质,高价无机离子（Ca2+、Mg2+、Fe2+） 杂蛋白,在采用离子交换提炼时，会

9、影响树脂对生化物质的交换容量。,在采用离子交换和吸附法提取时会降低其交换容量和吸附能力， 在有机溶剂法或双水相萃取时，易产生乳化现象，使两相分离不清。 在常规过滤或膜过滤时，易使过滤介质堵塞或受污染，影响过滤效率。,因此，在预处理时，应尽量除去这些物质。,二、发酵液的相对纯化,（一）高价无机离子的去除方法,Ca2+ 草酸、草酸钠，形成草酸钙沉淀（注意回收草酸） ； Mg2+三聚磷酸钠，形成三聚磷酸钠镁可溶性络合物； Fe2+ 黄血盐，普鲁士兰沉淀,（二）杂蛋白的去除方法,蛋白质一般以胶体状态存在于发酵液中。 在酸性溶液中带正电荷； 在碱性溶液中带负电荷。 在某一pH下，净电荷为零，溶解度最小，

10、称为等电点。,1. 沉淀法,在酸性溶液中，蛋白质与一些阴离子，如三氯乙酸盐、水杨酸盐、钨酸盐、苦味酸盐、鞣酸盐、过氯酸盐等形成沉淀； 在碱性溶液中，蛋白质与一些阳离子，如Ag+、Cu+、Zn+、Fe+和Pb+等形成沉淀。,酸碱调节，使蛋白质与盐或离子形成沉淀。,2. 变性法,加热； 大幅度调节pH值； 加酒精、丙酮等有机溶剂或表面活性剂等。,不足之处,加热法只适合于对热较稳定的目的产物； 极端pH值也会导致某些目的产物失活，且要消耗大量酸碱； 有机溶剂法通常只适用于所处理的液体数量较少的场合。,加入某些吸附剂或沉淀剂吸附杂蛋白质而除去。 在四环素类抗生素中，采用黄血盐和硫酸锌的协同作用生成亚铁

11、氰化锌钾的胶状沉淀来吸附蛋白质； 在枯草杆菌发酵液中，加入氯化钙和磷酸氢二钠，两者生成庞大的凝胶，把蛋白质、菌体及其他不溶性粒子吸附并包裹在其中除去。,3. 吸附法,第二节 固液分离工程及设备,重力沉降 浮选 旋液分离 介质过滤 离心,通气，产生气泡，使固体附着在气泡表面除去。 用于固液比重差小、直径530m颗粒的分离，污水处理,悬浮液以较高速度沿切线方向进入旋风分离器， 轻相由分离器中央排出， 重相由分离器下部排出， 但不适合直径5 m颗粒去除（可用丝网分离器）。,工业上常用,霉菌和放线菌为丝状菌，体形较大，发酵液采用过滤方法； 细菌和酵母菌为单细胞，体形较小，其发酵液采用高速离心分离，如对

12、发酵液进行预处理，也可用过滤进行固液分离。,一、固液分离的方法,优点：分离速度快，分离效率高、液相澄清度好； 缺点：设备投资高、能耗大。 离心机种类：碟片式离心机 管式离心机 倾析式离心机,1. 离心分离,在液相非均一系统中，利用离心力达到液液、液固、液液固分离的方法，统称为离心分离。,离心分离因数,重量kg,旋转直径,转速r/min,微生物发酵液中含有大量菌体、细胞或细胞碎片以及残余的固体培养基成分。,过滤就是将悬浮在发酵液中的固体颗粒与液体进行分离的过程。 在过滤操作中，要求滤速快、滤液澄清，并且有高的收率。,2. 过滤,A. 根据过滤机理，过滤操作可分为澄清过滤和滤饼过滤,澄清过滤,过滤

13、介质为硅藻土、砂、颗粒活性炭、玻璃珠、 塑料颗粒等 适合于固体含量少于0.1g/100ml、颗粒直径在5- 100um的悬浮液的过滤分离，如河水、麦芽汁、酒类和饮料等的澄清。,滤饼过滤,过滤介质为滤布 包括天然或合成纤维织布、金属织布、玻璃纤维纸、 合成纤维等无纺布。 适合于固体含量大于0.1g/100ml的悬浮液的过滤分离。 按推动力不同分四种：重力过滤，加压过滤，真空过滤，离心过滤。,菌种：真菌，放线菌，细菌 培养基：黄豆，花生，淀粉，后期加油，培养基未用完 发酵时间：菌丝自溶前放罐 黏度（发酵液）,影响过滤的因素,B. 常用过滤设备,（1）板框压滤机,广泛应用于培养基制备的过滤及霉菌、放线菌、酵母菌和细菌等多种发酵液的固液分离。适合于固体含量1-10%的悬浮液的分离。,（2）真空转鼓过滤机,1）切向流过滤（Cross-Flow Filtration）又称错流过滤 交叉过滤和十字流过滤，是一种维持恒压下高速过滤的技术。其操作特点是使悬浮液在过滤介质表面作切向流动，利用流动的剪切作用将过滤介质表面的固体（滤饼）移走。,3. 其他固液分离方法,2）双水相萃取 向水相中加入溶于水的某些高分子化合物（如葡聚糖、聚乙二醇等）后，